Summary
Vi presenterer en metode for å isolere den voksne organ Corti som tre intakte cochlea svinger (apex, midtre og basen). Vi viser også en prosedyre for farging med fluorescently merkede antistoffer. Sammen disse teknikkene tillater studier av hårceller, støtte celler, og andre celletyper som finnes i sneglehuset.
Introduction
Den spiralformede sneglehuset i det indre øret, som finnes i tinningbenet, huser organ Corti, det auditive sanse slutten organ hos pattedyr. Sneglehuset er tonotopically organisert og vanligvis delt inn i apikale, midtre og basal svinger tilsvarende forskjellige frekvens regioner med høyfrekvent lyd deteksjon i bunnen og lav frekvens deteksjon i apex en. Hårceller, de mechanosensory celler av organ Corti, kjører lengden av sneglehuset, som er ca 6 mm lang i mus 2,3. Disse cellene omdanne mekanisk energi av lydbølger som sendes gjennom væskefylte membran labyrint, inn nevrale signaler som behandles av sentrale hørsels strukturer. Teknikken er beskrevet her gir en metode for fremstilling av hele festene på den organ Corti etter forkalkning i sneglehuset er ferdig (for prøver fra én uke gamle til voksen). Vi presenterer også en fremgangsmåte for immunostaining hele montert cochlea vev. Cochlea hele monteringer er avgjørende for visualisering av alle hårceller og omkringliggende støtte celler i deres naturlige romlige arrangementer og muliggjøre analyse i tre dimensjoner ved bruk av konfokal mikroskopi.
Drs. Hans Engstrom og Harlow Ades opprinnelig beskrevet en hel montere cochlea disseksjon metode i 1966. De detalj en teknikk for å raskt fikse og dissekere forkalket cochleae nedsenket i væske fra en rekke pattedyr, bevare korte intakte segmenter av organ Corti for mikroskopisk analyse 4. Disseksjon av en unfixed, forkalket rotte cochlea har også blitt vist på en instruksjonsvideo 5. Drs. Barbara Bohne og Gary Harding ved Washington University gjort flere viktige endringer i denne metoden. I sin versjon av cochlea hele mount metode, tinningbenet var decalcified, forankret i plast, og fem halv svinger eller ti kvart svinger var dissected 6,7. Dr. Charles Liberman og kolleger ved Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye og Ear Infirmary, endret denne teknikken slik at plast embedding ikke var nødvendig 8. Ytterligere modifisering av teknikken skjedde i Dr. Jian Zuo laboratoriet ved St. Jude Children Research Hospital 9-12 som informerte disseksjon Metoden som presenteres her. Vi bruker en annen strategi for å få tilgang til organ Corti enn Bohne og Liberman, som tillater isolering av komplett apikal, midtre og basal svinger. Dermed dissekert vev er større og mindre sannsynlighet for å bli tapt eller skadet under disseksjon eller farging prosesser. I tillegg forenkler den nåværende fremgangsmåten måling av avstanden fra den apikale tupp eller basal krok for å identifisere en frekvens region.
Selv om mange laboratorier utføre farging av cochlea vev, er det uklart hvor denne metoden oppsto. Som et resultat er det ulike oppskrifter for å blokkere buffers og antistoff ruge buffere som kan påvirke ytelsen til enkelte primære antistoffer. Her presenterer vi en metode for farging med fluorescently merkede antistoffer som er aktuelt for de mest brukte antistoffer i hørselsfeltet.
Den komplekse form av sneglehuset, delikat strukturen i organ Corti, og benete encasement gir en utfordring for histologiske og biokjemiske analyser. En rekke forskjellige teknikker er for tiden brukes i høre feltet for å overvinne disse vanskelige funksjonene og visualisere cellene i organet Corti, hver teknikk med sine egne fordeler og ulemper. Protokollen som presenteres her muliggjør hel montering disseksjon av den voksne mus og cochlea, med små modifikasjoner, kan potensielt brukes til å undersøke de kritiske strukturer i cochleae fra en rekke andre modellorganismer som brukes i felten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Southern Illinois University School of Medicine.
1. Utvinning av Temporale Bones
- Identifisere timelige bein i bunnen av musen skallen 13 og skrape bort hjernenerver med standard mønster tang.
- Plasser standard mønster tang på spissen av otic kapsel og med tommelen på den andre hånden trykker ned på bakre halvsirkelformet kanalen for å løsne den innkapslede cochlea.
- Frigjøre den nedre halvdelen av tinningbenet fra skallen manuelt med tommelen og pekefingeren eller ved å bruke 10,5 cm gode saks.
2. Post-fix Temporale Bones
- Plasser messige bein i 2 ml mikrosentrifugerør inneholdende 250 - 500 ul 4% paraformaldehyd (PFA) fortynnet i 10 mM fosfatbufret saltvann (PBS) pH 7,4 og incubspiste ved romtemperatur i 2 - 20 timer.
MERK: Ingen åpning av apikale cap eller injeksjon av PFA inn i runde eller ovale vinduet er nødvendig. Anbefale å bruke metanol fri, ultra-rent, elektronmikroskopi (EM) karakter PFA som kan kjøpes til en 16% konsentrasjon i hetteglass. Når en ampulle er åpnet og fortynnet 1: 4 i PBS, slik at en 4% løsning, kan den brukes i opptil 2 uker når de lagres ved 4 ° C (Noen antistoffer krever kort fiksering og andre kan tolerere O / N (O / N) fiksering).
3. avkalke Temporale Bones
- Etter fiksering, fjerne PFA ved hjelp av en pipette og erstatte med 120 mM ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), litt mer enn 2 ml. Sørg for å fylle hele 2 ml mikrosentrifugerør å hindre luftbobler når røret er stengt.
- Hvis ikke kalk umiddelbart, erstatte PFA med 10 mM PBS pH 7,4 og lagre prøvene ved 4 o C.
MERK: Etter fiksering, kan timelige bein lagres for variable mengder tid før avkalking avhengig av antigener som undersøkes.
- Hvis ikke kalk umiddelbart, erstatte PFA med 10 mM PBS pH 7,4 og lagre prøvene ved 4 o C.
- Plasser rørene på ende-over-ende-rotator og roterer med 4 rpm ved RT. Endre EDTA løsning daglig ved hjelp av en pipette. Lengde på avkalking avhenger av alder av prøven og preferanse for forskeren å gjøre disseksjon.
- Inkuber timelige bein i EDTA ved hjelp av følgende retningslinjer for inkuberingstider:
For prøvene postnatal dag (P) 8 til P15: 2 - 4 timer; For prøver P15 til P21: O / N; For prøver P21 til P30: 2 O / N; For prøver som er eldre enn P30: 3 eller flere O / N.
MERK: avkalking tider er gjenstand for brukernes preferanser og kan utvides etter behov. Avkalking Tiden kan reduseres ved å endre EDTA-løsning to ganger om dagen, ca. 8 timer fra hverandre. Noen laboratorier tilsett 1% PFA til EDTA løsning når kalk for mer enn 3 dager for å hindre forurensning.
- Inkuber timelige bein i EDTA ved hjelp av følgende retningslinjer for inkuberingstider:
- For å avgjøre om prøven er tilstrekkelig avkalkes, plasserer timelige bein ona silisium elastomerbelagt disseksjon fatet og trykk forsiktig tang på snegleformede cochlea. Når vevet er spongey, så avkalking er fullført.
- Når decalcification er fullført, fjerner EDTA ved hjelp av en pipette og tilsett 500 -1000 mL av 10 mM PBS pH 7,4. Oppbevar prøver ved 4 o C til den er klar til å dissekere.
4. Lag Silikon elastomerbelagt Dissection Dish
- Kombiner base og herder av en silikon elastomer innkapslingsmiddel kit i henhold til produsentens instruksjoner og bland godt.
- Tilsett ca 2 - 3 ss pulverisert kull før løsningen er svart og bland godt.
MERK: Væske blekk eller flytende kull ikke vil blande seg med oppløsningen og kan ikke brukes. Silikon elastomer encapsulant kits kan kjøpes i svart, slik at trinn 4.2 for å bli utelatt. - Hell løsningen i 60 mm glass eller plast-petriskåler, fyller nok til å belegge bunnen. Hvis bubbles er til stede, å blåse med luft på overflaten. La stå i minst 24 timer ved RT for å angi.
MERK: silikon-belagt retter kan brukes flere ganger i år. Men ikke bruk etanol til rengjøring, da dette vil føre til at silikon elastomer å knekke.
5. Hele Mount Disseksjon av sneglehuset (for P7 og eldre Samples)
- Skill basal sving fra midten / apikale svinger
- Plasser en decalcified tinningbenet i en silikon elastomerbelagt disseksjon tallerken fylt to tredjedeler full med 10 mM PBS pH 7,4 og bruke en stereo disseksjon mikroskop for følgende trinn.
- Hold tinningbenet i vestibular regionen med # 4 eller # 5 straight gullsmed tang og bruke 5 mm Vannas-Tübingen våren saks, klippe bort overflødig otic kapsel vev langs sidene og over apex.
- Ved hjelp av 2,5 mm Vännäs våren saks, sette inn ett blad i det ovale vinduet og lage flere små kutt langs spiral ligament / lateralvegg av basal omdreining.
- Ved hjelp av 5 mm Vannas-Tübingen våren saks, sette inn ett blad inn i regionen bare klippe og plasser den andre blad på utsiden tinningbenet, medial til det ovale vinduet. Dette kuttet skiller basal sving fra midten og apikale svinger.
- Komplett disseksjon av basal turn.
- Ved hjelp av 2,5 mm Vännäs våren saks, klippe spiral ganglion nervefibre som kobles til modiolus å slippe spenningen i basal turn og kutt under basal tur til å skille fra vestibulære organer.
- Ved hjelp av 2,5 mm Vännäs våren saks, lage en serie med små kutt for å fjerne spiral ligament / sidevegg fra både over og under organ Corti. Bruk # 4 eller # 5 straight gullsmed tang for å lede vev. Pin spiral ganglion nervefibrene til silikon-belagt disseksjon rett, men ikke holde på denne regionen som vevet vil rive.
- I løpet av de foregående trinnene, noen av Reissner sin membrane vil ofte bli fjernet. Hvis noen fortsatt gjenstår, ta tak i Reissner membran med # 4 eller # 5 straight gullsmed pinsett og dra bort fra organ Corti.
MERK: tectorial er sjelden synlig og vanligvis flyter bort uten å kreve en bestemt trinn for fjerning. - Endelig gjøre flere kutt for å redusere tykkelsen på spiral ganglion aksoner, for å gjøre svingen så flat som mulig og bruke # 4 eller # 5 straight gullsmed pinsett til å overføre dissekert basal turn, ved å gripe de rester aksoner av spiral ganglion, til en 48-brønns plate (eller kammer lysbilde) inneholdende ~ 500 mL av 10 mM PBS pH 7,4.
- Separat midtre og apikale svinger
- Plasser de resterende to tredjedeler av sneglehuset, apikale siden ned.
- Ved hjelp av 2,5 mm Vännäs våren saks, sette inn ett blad inn i scala media hvor det midterste tur brukes til å bli koblet til basal sving, og gjøre flere små kutt langs spiral ligament / sidevegg the midten sving.
- Ved hjelp av 5 mm Vannas-Tübingen våren saks, sette inn ett blad inn i regionen bare kuttet med midten turn plassert på toppen av bladet, og plasser den andre blad på utsiden benete labyrinten, i en 90 o vinkel fra apikal spissen. Dette skiller midten sving fra apikal sving.
- Fullstendig disseksjon av den midtre omdreining på en lignende måte til basal omdreining (se trinn 5.2.2 til 5.2.4).
- Komplett disseksjon av den apikale turn.
- Ved hjelp av 2,5 mm Vännäs våren saks, åpne lokket som dekker den apikale turn. Fullstendig disseksjon på en lignende måte til basal omdreining (se trinn 5.2.2 til 5.2.4).
NOTE: dissekert cochlea omdreininger kan lagres i 10 mM PBS pH 7,4 i en 48-brønners plate (eller kammer lysbilde) ved 4 ° C i flere uker før farging. Imidlertid PBS vil fordampe og må periodisk etterfylles, og lagring i mer enn 2 - 3 uker, kan det resultere i bakterie- eller soppvekst ivev som kan redusere kvaliteten på bildet. Vi anbefaler langsiktig lagring av prøver som undissected timelige bein.
- Ved hjelp av 2,5 mm Vännäs våren saks, åpne lokket som dekker den apikale turn. Fullstendig disseksjon på en lignende måte til basal omdreining (se trinn 5.2.2 til 5.2.4).
6. Farging med fluorescerende Tagged Antistoffer
- Etter disseksjon, lagre hvert cochlea sving i en egen brønn i en 48-brønns plate (eller kammer lysbilde), nedsenket i ~ 500 mL av 10 mM PBS pH 7,4. For hver av de følgende trinnene i sneglehuset igjen skal senkes ned i væsken, ikke flyter på toppen eller fast ved siden av brønnen.
MERK: Når du fjerner væske fra hver brønn, er det lett å miste cochlea svinger eller suge den opp i pipettespissen. Endre løsninger med en 200 mL pipette tips å bruke en disseksjon omfang vil bidra til å forhindre dette. - Ved hjelp av en pipette, fjerne PBS fra hver brønn og erstatte med ~ 200 - 300 ul pr brønn av blokkerings / permeabilization-løsning (1% Triton X-100, 1% bovint serum albumin (BSA), og 10% normalt geiteserum (NGS) fortynnet i 10 mM PBS pH 7,4). Inkuber 1 time ved romtemperatur på en 3D-rotator.
MERK: Hvis noen primært antistoff brukes ble gjort i en geit vert, deretter en sekundær anti-geit antistoff vil være nødvendig og NGS bør IKKE brukes til noen av trinnene. Normal hesteserum kan brukes som en erstatning for NGS. - Fjern blokkerings / permeabilization oppløsning ved anvendelse av en pipette og erstatte med ~ 100 ul per brønn av primær antistoffoppløsning (0,1% Triton X-100, 1% BSA, og 5% NGS fortynnet i 10 mM PBS pH 7,4). Fortynningsfaktoren for hver primær antistoff varierer. Inkuber O / N (minimum 14 timer) ved 4 o C på en 3D-rotator.
MERK: Hvis mer enn én primær antistoff brukes, kan alle sammen til samme løsning for inkubasjon, bare sørg for at hver primære antistoffet har en annen vert. - Fjern primær antistoffløsning ved anvendelse av en pipette og utføre 3 vaskinger med 10 mM PBS pH 7,4 ved ~ 500 ul per brønn. Hver vask ruger i minst 5 minutter ved romtemperatur på en 3D-rotator.
- Fjern siste PBS vaske ved hjelp av en pipette og erstatte med ~ 100 ul per brønn av sekundært antistoff-oppløsning (0,1% Triton X-100, 1% BSA, og 5% NGS fortynnet i 10 mM PBS pH 7,4). Fortynningsfaktoren for hver fluorescens-merket sekundært antistoff er vanligvis 1: 500 eller 1: 1000. Plasser 48-brønns plate i en svart boks for å beskytte fluorescently merket sekundære antistoffer mot lys. Inkuber 2 - 3 timer ved RT på en 3D-rotator.
MERK: Hvis mer enn ett sekundært antistoff er nødvendig, kan de kombineres i samme løsning for inkubasjon. Pass på at det ikke er noen mulighet for kryss-merking (f.eks. Ved hjelp av geit anti-kanin og kylling anti-geit sekundære antistoffer) - Fjern sekundært antistoff oppløsning ved anvendelse av en pipette og utføre 3 vaskinger med 10 mM PBS pH 7,4 ved ~ 500 ul per brønn. Inkuber hver vask i minst 5 minutter ved romtemperatur på en 3D-rotator. Hold 48-brønns plate i en svart boks for å beskytte mot lys.
- Fjern siste PBS vask ved hjelp av en pipette og erstatte med ~ 100 mL per brønn av Hoechst 33342 (fortynnet 1: 2000 i 10 mM PBS pH 7,4) til å merke kjerner. Inkuber 15 - 20 minutter ved RT på en 3D-rotator. Hold 48-brønns plate i en svart boks for å beskytte mot lys. IKKE ruge lenger enn 20 min.
- Fjern Hoechst oppløsning ved anvendelse av en pipette og utføre 3 vaskinger med 10 mM PBS pH 7,4 ved ~ 500 ul per brønn. Inkuber hver vask i minst 5 minutter ved romtemperatur på en 3D-rotator. Hold 48-brønns plate i en svart boks for å beskytte mot lys.
- Alle trinn kan forlenges, bortsett fra Hoechst inkubering med flere timer om nødvendig. Å stanse reaksjon på ethvert stadium, bare senk prøver i ~ 500 ul av 10mm PBS pH 7,4 og lagre 48 -godt plate (eller kammer lysbilde) ved 4 o C til den er klar til å gjenoppta protokoll timer eller 1 - 2 dager senere .
7. Monter Cochlear Slår på Slides
- Etiketten lysbilder med relevant informasjon om prøven og antistoffer som brukes.
- Pipette ~ 50 mL av monterings media bort på hvert lysbilde og være forsiktigfor å hindre at bobler. Sentrifuger røret som inneholder monterings media for å fjerne eventuelle bobler.
- Bruke # 4 eller # 5 straight gullsmed tang, ta tak i aksoner av spiral ganglion å forsiktig overføre én cochlea sving fra 48-brønns plate til lysbildet og plasser i monterings media. Mount én cochlea omdreining per lysbilde for å hindre lys eksponering og fotobleking under bildeprosessen.
- Bruk en stereo disseksjon mikroskop for å sikre at turn cochlea ikke er brettet, vridd, eller i nærheten av en luftboble. Hvis noen av disse tilstandene oppstår, til bruk # 4 eller # 5 straight gullsmed tang omplassere cochlea turn.
- Plasser den ene enden av en dekkglass på lysbildet og forsiktig slipper å la dekk høsten.
- Bruk en stereo disseksjon mikroskop for å sikre at cochlea turn ikke er brettet, vridd, eller i nærheten av en luftboble. Hvis noen av disse tilstandene oppstår, forsiktig flytte dekk frem og tilbake for å flytte cochlea turn.
- Plasser lysbilderi en bildemappe, slik at de lå flatt. La montering media kur O / N ved RT (hold i mørket)
- Seal Dekk med klar neglelakk og oppbevares ved romtemperatur eller -20 o C til avbildes. Slides kan lagres i et lysbilde mappe eller lysbilde boks.
MERK: Slides kan lagres lang sikt ved -20 ° C eller -80 ° C og fluorescens vil bli opprettholdt i flere måneder. - Bilde lysbilder ved hjelp av et konfokalt mikroskop med passende bølgelengde basert på den sekundære antistoffer som brukes under farging prosedyren. Lysstyrke og kontrast justeringer kan utføres ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer levert av konfokal leverandøren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi presenterer en metode for å isolere organ Corti som tre intakte cochlea svinger (apex, midtre og base) fra cochlea vev som er forkalket, med viktige disseksjon trinn presenteres i figur 1. Under den første postnatal uken i utvikling, forkalkning av mus sneglehuset er ufullstendig og en mer enkel disseksjon metoden kan brukes 13. Bruk av neonatal hele mount disseksjon metode med cochlea fra P7 og eldre mus resultater i tårer og makulering av orgelet i Corti. Den spiralformede ligament / sidevegg er nå mer fast bundet og ikke kan skrelles bort fra den sensoriske epitelet uten å forårsake skade. Således "voksen" hel mount disseksjon metode er nødvendig for prøver som er eldre enn P6. Vi presenterer et eksempel på midten av en omdreining P15 cochlea mus som har blitt dissekert og immunfarget med håret-celle og støttecellemarkører (figur 2). Optiske tverrsnitt cen også oppnås med hele monteringsteknikken (figur 3).
Flere problemer kan oppstå under hele mount disseksjon eller ved montering av cochlea slås på lysbilder. Under fjerningen av den spiralformede ligament / sidevegg, er det et smalt vindu mellom kutte for mye eller for lite. Kutt som oppstår ved siden av den siste raden av ytre hårcellene kan føre hårcellene i denne siste raden til å montere på varierte vinkler (Figur 4A). Kutt som er for store kan fjerne deler av organet Corti (figur 4B). Håndtering prøven med pinsett tar stor omsorg og ofte er det hull i organ Corti hvor tang ble forlagt (Figur 4C). Til slutt når montering cochlea svinger, kan det organ Corti fold som tilslører bildet (Figur 4D).
Figur 1. Viktige steg i hele Mount Dissection av "voksen" Mouse cochlea. (A) Etter protokoll trinn 5.1.4, er basal begynnelsen av cochlea skilt fra midten / apikale svinger, men fortsatt festet til vestibular regionen. (B) Etter protokollen trinn 5.3.3, er midt turn skilt fra apikal turn. (C) Eksempel på utfylt disseksjon av en middel sving der spiral ligament / sidevegg er fjernet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Confocal Slice Bilde av Midt-Slå Isolert fra en P15 Mouse. Fire 20x bildene kledde å rekonstruere hele midten turn. Hårcellene er merket med et kanin anti-myosin VIIa primære antistoff (1: 200 fortynning) i kombinasjon med et esel anti-kanin-Alexa 488-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) (magenta). Støtte celler er merket med en geit anti-Sox2 primær antistoff (1: 500 fortynning) kombinert med et esel anti-geit Alexa 568-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) (grønn). Hoechst (blå) etiketter alle kjerner. Bildet ble tatt med en Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop med 405, 488, og 555 bølgelengder. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Optisk Tverrsnitt av Midt-Turn Isolated fra en 6-ukers gamle Mouse. (A) Confocal stykke bilde av hele mount preparat (nederst) og optisk tverrsnitt i XZ planet (øverst). (B) Økt forstørrelse av toppfeltet i (A), med trådkorset fjernet. Hårcellene er merket med et kanin anti-myosin VIIa primære antistoff (1: 200 fortynning) i kombinasjon med et esel anti-kanin-Alexa 647-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) (magenta). Støtte celler er merket med en geit anti-Sox2 primær antistoff (1: 500 fortynning) kombinert med et esel anti-geit Alexa 568-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) (grønn). Bildet ble tatt med en Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop med 405, 555, og 647 bølgelengder. Skala barer = 20 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på problemer som kan oppstå under hele Mount Dissection eller ved montering cochlea Slår på lysbilder. (A) På venstre side av bildet, ble cochlea vev kutte nest siste raden av ytre hårcellene forårsaker mange av disse cellene til å monteres i ulike vinkler. (B) En del av organet Corti på venstre side av bildet er blitt skåret av. (C) Det er en hullet i det ytre hårcelle region i midten av image. (D), er The organ Corti brettet i flere steder. Bilder ble tatt 4-8 uker gamle mus cochleae. Hårcellene er merket med et kanin anti-myosin VIIa primære antistoff (1: 200 fortynning) i kombinasjon med et geit anti-kanin Alexa 488-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) eller et esel-anti-kanin Alexa 488-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) (magenta). I C ytre hår cells er merket med en geit anti-Prestin primær antistoff (1: 200 fortynning) kombinert med et esel anti-kanin Alexa 568-konjugert sekundært antistoff (1: 1000 fortynning) (grønn). Bilder ble tatt med en Leica SP5 konfokalmikroskop med 405, 488 og 555 nm bølgelengde. Skala barer: i AB = 20 mikrometer; CD = 40 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige skritt for vellykket hele mount disseksjon og farging. Men før noen av disse metodene er utført, er riktig fiksering av cochlea vev nødvendig. Vi anbefaler å bruke metanol fri, ultra-rent, EM grade PFA. PFA laget av pulver kan ha spor av metanol og en ustabil pH som reduserer kvaliteten av immunfluorescens. Andre grupper har også vist at lignende disseksjoner er mulig ved hjelp av fiksativ som ikke inneholder formaldehyd 14-16. Lengden av fiksering er også viktig, og er spesifikt antistoff. Noen antistoffer kan tolerere en O / N fiksering, mens andre ikke fungerer godt med bare en time i PFA (men dette er sjelden). Under-fiksert vev kan være problematisk for disseksjon metode som vevet faller fra hverandre. I vår erfaring med 3 - 4 timers fiksering gir tilstrekkelig feste og ikke forstyrrer de fleste primære antistoffer som vanligvis brukes i høringen feltet.
jove_content "> Det er også mulig at EDTA kan interferere med primære antistoffer,. således noen antistoffer vil fungere godt i neonatal vev, men ikke i P7 eller eldre vev som ble avkalkes Etter fiksering kan temporale ben oppbevares i variable mengder av tid før decalcification avhengig av antigener som blir undersøkt. Noen antigener krever avkalking og disseksjon i løpet av dager til uker etter fiksering, mens andre kan oppbevares i år (enten før eller etter avkalking) uten å redusere kvaliteten på farging. Vi anbefaler lagre prøvene som timelige bein på grunn av faren for fordampning av lagringsmedia (PBS) fra 48-brønns plate og potensiell forurensning med bakterier eller sopp. Vi vanligvis utfører hele braketten disseksjon mindre enn en uke på forhånd for å immunfarging.Når faste og decalcified, hele mount disseksjon utføres med tinningbenet nedsenket i væske. Fjerne overflødig bein og mykvevet rundt labyrinten tidlig disseksjon skal hjelpe til med fjerning av spiralen ligament / sidevegg på senere stadier ved å lette manipulering av vev og som gir en mindre skjulte visning av kritiske strukturer. Når du utfører de første trinnene, kan tang brukes til å holde vevet i vestibular regionen. Men når svingene er isolert, er det viktig å unngå å plassere tang på orgel av Corti eller spiral ligament / sidevegg. I stedet holder pinsett lukket og pin spiral ganglion nervefibrene til silikon-belagt disseksjon parabolen. Ikke holde på denne regionen som vevet vil rive. Generelt, når vevet har blitt delt inn i de tre svinger, fatte og trekke manøvrer kan føre til uforutsigbare resultater, som ofte skadelig for orgel av Corti og bør unngås. Vev fra yngre dyr (P7-P21) har en tendens til å være mer tilgivende enn vev fra dyr som er eldre enn P21. I tillegg cochlea prøver med hårcelle dAmage er vanskeligere å dissekere. Hvis musen mottatt støyeksponering vevet er spesielt skjøre. Uavhengig av tilstanden i vevet, er disseksjon vi presentere teknisk krevende og krever mange praksis forsøk for kunnskaper.
Under farging, er det viktig at hver cochlea igjen er neddykket i væske, ikke flyter på toppen eller fast ved siden av brønnen. Dette tillater mer fullstendig gjennomtrengning av triton og antistoffer inn i vevet. Ved fjerning av væske fra hver brønn, er det lett å miste cochlea turn eller trekke den opp i pipettespissen. Endre løsninger med en 200 mL pipette tips å bruke en disseksjon omfang vil bidra til å forhindre dette. Trekke sakte væsken og flytte pipettespissen hvis cochlea turn kommer for nær. Også pipetteting avfallsløsning i et rent rør kan være en god strategi som dette avfallet tube kan søkes om en sving ved et uhell trukket opp i pipetten. Hvis turn er fast i pipettespissen, tHan tipset kan bli kuttet åpen med et barberblad, men ofte organ Corti vil bli skadet hvis dette skjer.
Når feilsøking antistoffer for farging, kan legges flere trinn som antigen henting eller signalforsterkning. Det er lav pH og høy pH antigen avsløre reagenser som kan kjøpes. Hvis et antistoff ikke fungerer med metoden som beskrives her, er den første protokollen endring for å prøve en av disse antigen gjeninnhentingsmetodene. Alternativt kan du bruke en signalforsterker. Det finnes kommersielt tilgjengelige løsninger for bruk før farging, eller tyramide forsterkersett som kan brukes til å forsterke signalet fra det sekundære antistoff.
Betydningen av teknikken presenterer vi er evnen til å opprettholde den tredimensjonale struktur av organet Corti, og for å visualisere alle celler innenfor organet. Hele lengden av sneglehuset er delt opp i bare tre omdreininger, mens andre lignende teknikker, nemlig the Bohne og Liberman metoder, krever inndeling i 5 - 10 stykker 6-8, øke antall prøver å manøvrere i farging og bildeprosesser. Den sneglehuset sidevegg disseksjon som ble utviklet av Cosgrove og Gratton krever en tilsvarende grad av dyktighet og er mulig i ufiksert, friske vev, samt i decalcified vev, men det organ Corti er strippet bort og ødelagt i prosessen med å isolere sidevegg 17. En annen gruppe har gjennomført tilsvarende disseksjoner i unfixed, frisk cochlea vev fra tre uker gamle rotter der spiral ligament / sidevegg gripes og strippet vekk fra organ Corti, forlater organ intakt. Men dette ble bare oppnådd i apikale turn 5. Metoden for peeling spiral ligament / sidevegg unna organ Corti er rutine for disseksjon av fast vev i en ung mus (<P7) 13. Men i vår erfaring med mus eldre enn P6, etter fiksering end avkalking, denne manøveren tårer ofte organ Corti i en upålitelig måte. I tillegg til den fremgangsmåte som er beskrevet her tillater isolering av mellom og basal svinger også.
Frysesnitt og seksjoner som oppnås etter parafin embedding er også ofte brukt i hørselsfeltet. Disse metodene tillater visualisering av andre strukturer som stria vascularis, Reissner membran, og tectorial, men hver seksjon bare tillater visualisering av et lite område av organ Corti i hvert cochlea sving. Således for å undersøke hendelser som forekommer i et mosaikkmønster, slik som celle tap eller celledeling, med snitte metode, 50 eller flere lysbilder må være farget og avbildes for å fange opp hele lengden av sneglehuset. I kontrast, har hele mount disseksjon protokollen fordelen med å forberede hele organ Corti i bare tre stykker. I tillegg til fordelen av å bevare den langs arkitekturen av organet Corti, dette technique åpner for forenklet datainnsamling og lagring. En begrensning av hele mount disseksjon er at det ødelegger omkringliggende strukturer som spiral ligament, stria vascularis, Reissner membran, og tectorial. En annen begrensning er teknisk vanskelighetsgrad og lengde av tid for en enkelt disseksjon. Dette er hovedsakelig på grunn av den skjøre natur organ Corti og liten feilmargin når du fjerner spiral ligament / sidevegg. Når mestret, kan hele mount disseksjon av et cochlea utføres i ca 20 - 30 For min.
Mens de ovennevnte protokollen beskriver en hel mount disseksjon metode for den voksne mus, håper vi å kunne bruke denne teknikken til andre modellorganismer som brukes i det auditive feltet. Vår lab er for tiden endre denne teknikken for disseksjon av rotte cochlea. Jo større cochlea av rotte er innkapslet i en tykkere otic kapsel som er mer tett forkalket enn musen. Dermed tinningbenet må være excised med store saks. Før fiksering og avkalking med EDTA, bør otic kapselen åpnes med saks for å gi bedre tilgang til cochlea vev. Også decalcification prosessen er lengre og kan ta opptil 3 uker, avhengig av alderen på prøven. For hele mount disseksjon, størrelsen av benete labyrinten påvirker teknikk. Den økte størrelsen på rotte cochlea gir en litt større avstand mellom spiral ligament / sidevegg og orgel av Corti, som gir en større feilmargin for den enkelte kutt. Imidlertid, mens den større vevet kan gi mer materiale for å gripe for manipulering av prøven, det krever også et større antall kutt for å fjerne hele lengden av spiralligament / sidevegg. Vi tror at analoge modifikasjoner kan gjøres for disseksjon av sneglehuset fra chinchilla, hamsteren, og marsvin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A.
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
