Summary
Vi præsenterer en metode til at isolere voksne organ Corti som tre intakte cochlear sving (apex, midten og bunden). Vi viser også en procedure for immunfarvning med fluorescens mærkede antistoffer. Tilsammen gør disse teknikker gør det muligt studiet af hårceller, støtteceller, og andre celletyper fundet i cochlea.
Introduction
Den spiralformede cochlea i det indre øre, der er indeholdt i den tidsmæssige knoglen, huser organ Corti, det auditive sensoriske ende orgel i pattedyr. Cochlea er tonotopically organiseret og almindeligt opdelt i apikal, midterste og basal vender svarende til forskellige frekvens regioner med høj frekvens lyd detektion i basen og afsløring lav frekvens i spidsen 1. Hårceller, de mechanosensory celler i organet for Corti, køre længden af cochlea, hvilket er cirka 6 mm lange i mus 2,3. Disse celler konvertere den mekaniske energi af lydbølger, som transmitteres gennem væskefyldte membranøs labyrint, ind i neurale signaler, der behandles af de centrale auditive strukturer. Den her beskrevne teknik tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af hele underlag af cortiske organ efter forkalkning af cochlea er færdig (for prøver i området fra en uge gamle til voksenalderen). Vi præsenterer også en fremgangsmåde til immunostalingen hele monteret cochlear væv. Cochlear hele underlag er afgørende for visualisering af alle hårceller og omgivende støtteceller i deres naturlige rumlige arrangementer og muliggøre analyse i tre dimensioner med brug af konfokal mikroskopi.
Drs. Hans Engstrøm og Harlow Ades oprindeligt beskrevet en hel mount cochlear dissektionsmetoden i 1966. De nærmere en teknik til hurtigt at fastsætte og dissekere forkalket cochleae nedsænket i væske fra en række pattedyr, bevare korte intakte segmenter af cortiske organ til mikroskopisk analyse 4. Dissektion af en ikke fastgjort, forkalket rotte cochlea er også blevet vist i en instruktionsvideo 5. Drs. Barbara Bohne og Gary Harding ved Washington University gjort flere vigtige ændringer til denne metode. I deres version af den cochlear hele mount metode, tindingebenet var afkalket, indlejret i plast, og fem halve drejninger eller ti kvart-sving var dissecTed 6,7. Dr. Charles Liberman og kolleger på Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts øjet og øret Ambulatorium, ændret denne teknik, så plastik indlejring ikke var forpligtet 8. Yderligere modifikation af teknikken opstod i Dr. Jian Zuo laboratorium på St. Jude Children Research Hospital 9-12, som informerede dissektion metoden præsenteres her. Vi bruger en anden strategi for at få adgang til organ Corti end Bohne og Liberman, som giver mulighed for isolering af komplet apikal, midterste og basale sving. Det dissekerede væv er således større og mindre tilbøjelige til at blive tabt eller beskadiget under dissektion eller Immunofarvning processer. Hertil kommer, at nuværende metode letter måling af afstanden fra den apikale spids eller basal krog til at identificere et frekvensområde.
Selv om mange laboratorier udfører immunfarvning af cochlear væv, er det uklart, hvor denne metode stammer fra. Som følge heraf er der forskellige opskrifter til blokering buffers og antistof inkubation buffere, der kan påvirke udviklingen i de enkelte primære antistoffer. Her præsenterer vi en metode til immunfarvning med fluorescens mærkede antistoffer, der er gældende for de fleste almindeligt anvendte antistoffer i det auditive område.
Den komplekse form af cochlea, sarte struktur af cortiske organ, og benet indkapsling tilvejebringe en udfordring for histologiske og biokemiske analyser. En række teknikker er for tiden anvendes i hørelse felt at overvinde disse vanskelige egenskaber og visualisere cellerne inden organet for Corti, hver teknik med sine egne fordele og ulemper. Protokollen præsenteres her giver mulighed for hele mount dissektion af voksne mus cochlea, og med let modifikation, kan potentielt anvendes til at undersøge de kritiske strukturer i cochleae fra en række andre organismer, der anvendes model på området.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Southern Illinois University School of Medicine.
1. Udvinding af Temporal Bones
- Identificer tindingeben i bunden af musen kraniet 13 og skrab kranienerverne anvendelse af standard mønster pincet.
- Placer standard mønster pincet på spidsen af den otiske kapsel og med tommelfingeren på den anden hånd trykke ned på den bageste halvrunde kanalen for at løsne den indkapslede cochlea.
- Frigør den nederste halvdel af den tidsmæssige knogle fra kraniet manuelt med tommel- og pegefinger eller ved at bruge 10,5 cm fine saks.
2. Post-fix Temporal Bones
- Placer tindingeben i 2 ml mikrocentrifugerør indeholdende 250 - 500 pi 4% paraformaldehyd (PFA) fortyndet i 10 mM phosphatpufret saltopløsning (PBS) pH 7,4 og incubspiste ved stuetemperatur i 2 - 20 timer.
BEMÆRK: Der kræves ingen åbningen af den apikale hætte eller injektion af PFA i den runde eller ovale vindue. Anbefaler at bruge methanol gratis, ultrarent, elektronmikroskopi (EM) grad PFA, der kan købes i en koncentration i hætteglas 16%. Når et hætteglas åbnes og fortyndet 1: 4 i PBS, hvilket gør en 4% opløsning, kan det anvendes i op til 2 uger, når de opbevares ved 4 ° C (Nogle antistoffer kræver korte fiksering og andre kan tåle O / N (O / N) fiksering).
3. afkalke Temporal Bones
- Efter fiksering fjernes PFA med en pipette og erstatte med 120 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), lidt mere end 2 ml. Sørg for at fylde hele 2 ml mikrocentrifugerør at forhindre luftbobler når røret er lukket.
- Hvis ikke afkalkning umiddelbart erstatte PFA med 10 mM PBS pH 7,4 og gemme prøver ved 4 ° C.
BEMÆRK: Efter fiksering kan tidsmæssige knogler opbevares i variable mængder af tid, før afkalkning afhængig af de antigener, der undersøges.
- Hvis ikke afkalkning umiddelbart erstatte PFA med 10 mM PBS pH 7,4 og gemme prøver ved 4 ° C.
- Rørene anbringes på ende-over-ende rotator og roterer ved 4 opm ved stuetemperatur. Skift EDTA-opløsning dagligt ved hjælp af en pipette. Længde på afkalkning afhænger af alder af prøven og præference for den videnskabsmand gør dissektion.
- Inkuber tidsmæssige knogler i EDTA ved hjælp af følgende retningslinjer for inkubationstider:
For prøver postnatal dag (P) 8 til P15: 2 - 4 timer; For prøver P15 til P21: O / N; For prøver P21 til P30: 2 O / N; For prøver ældre end P30: 3 eller flere O / N.
BEMÆRK: afkalkning tider er underlagt brugernes præferencer og kan udvides efter behov. Afkalkning kan reduceres ved at ændre EDTA-opløsning to gange dagligt, ca. 8 timer fra hinanden. Nogle labs tilsættes 1% PFA til EDTA-løsning, når afkalkning i mere end 3 dage til at forhindre forurening.
- Inkuber tidsmæssige knogler i EDTA ved hjælp af følgende retningslinjer for inkubationstider:
- At afgøre, om prøven er tilstrækkeligt afkalket, placere tindingeben ona silicium beklædt med elastomer dissektion fad og tryk forsigtigt pincet på sneglen-formet cochlea. Hvis vævet er spongey, så afkalkning er færdig.
- Når afkalkning er afsluttet, fjernes EDTA ved hjælp af en pipette og tilsæt 500 -1000 pi 10 mM PBS pH 7,4. Opbevar prøverne ved 4 ° C indtil den er klar til at dissekere.
4. Opret silikone elastomer-belagt Dissektion Dish
- Kombiner basen og hærder af en silikone elastomer encapsulant kit ifølge producentens anvisninger og bland grundigt.
- Der tilsættes ca. 2 - 3 i spsk pulveriseret trækul, indtil opløsningen er sort og bland godt.
BEMÆRK: flydende blæk eller flydende kul vil ikke blandes med opløsningen og kan ikke bruges. Silikoneelastomer encapsulant kits kan købes i sort, så trin 4.2 kan udelades. - Hæld opløsningen i 60 mm glas eller petriskåle af plast, udfylde nok til at belægge bunden. Hvis bubbles er til stede, pust med luft på overfladen. Lad det stå i mindst 24 timer ved stuetemperatur for at indstille.
BEMÆRK: silikoneelastomer skåle coatet kan bruges flere gange i årevis. Men ikke bruger ethanol til rengøring, da dette vil medføre, at silikone elastomer at knække.
5. Hele Mount Dissektion af cochlea (for P7 og ældre Prøver)
- Adskil basale tur fra midten / apikale drejninger
- Placer en afkalket tidsmæssig knogle i en silikone elastomer-coated dissektion fad fyldt to tredjedele fuld med 10 mM PBS pH 7,4, og bruge en stereo dissektion mikroskop for de følgende trin.
- Hold den tidsmæssige knogle i det vestibulære region med # 4 eller # 5 lige guldsmedens pincet og bruge 5 mm Vannas-Tübingen foråret saks, skåret væk overskydende otiske kapsel væv langs siderne og over spidsen.
- Brug 2,5 mm Vännäs foråret saks, indsætte en kniv i det ovale vindue og gøre flere små snit langs spiral ledbånd / lateralvæg af basale vinding.
- Brug 5 mm Vannas-Tübingen foråret saks, indsætte en kniv ind i regionen bare klippe og placere den anden klinge på ydersiden tindingebenet, mediale til det ovale vindue. Denne nedskæring adskiller basale tur fra midten og apikale sving.
- Komplet dissektion af basale vinding.
- Brug 2,5 mm Vännäs foråret saks, klippe spiral ganglion nervefibre, der forbinder til modiolus at frigive spændinger i den basale tur og skæres under den basale tur til at adskille fra vestibulære organer.
- Anvendelse af 2,5 mm Vännäs foråret saks, foretage en række små stykker for at fjerne spiral ligament / sidevæg fra både over og under det organ Corti. Brug # 4 eller # 5 lige guldsmedens pincet til at guide vævet. Pin spiral ganglion nervefibre til silicone elastomer-belagt dissektion fad, men ikke holde på denne region som vævet vil rive.
- I løbet af de foregående trin, hvoraf nogle Reissner s membrane vil ofte blive fjernet. Hvis nogen stadig, tage fat i Reissner membran med # 4 eller # 5 lige guldsmedens pincet og træk væk fra organ Corti.
BEMÆRK: tectorial membran er sjældent synlige og typisk svæver væk uden at kræve en bestemt skridt til fjernelse. - Endelig foretage flere snit for at reducere tykkelsen af spiralganglieneuroner axoner, at gøre turn så flade som muligt og bruge # 4 eller # 5 lige guldsmedens pincet til at overføre det dissekerede basale vinding, ved at gribe de resterende axoner i spiral ganglion, at en 48-brønds plade (eller kammer slide) indeholdende ~ 500 pi 10 mM PBS pH 7,4.
- Separat midten og apikale sving
- Placer de resterende to tredjedele af cochlea, apikale nedad.
- Brug 2,5 mm Vännäs foråret saks, indsætte en kniv ind i Scala medier, hvor den midterste tur bruges til at blive forbundet med basale tur, og gøre flere små snit langs spiral ledbånd / sidevæg af the midterste vinding.
- Anvendelse af 5 mm Vannas-Tübingen foråret saks, indsætte et blad i regionen bare klippe med den midterste igen er placeret på toppen af bladet, og placere det andet blad på ydersiden benede labyrint, i en 90 o vinkel fra den apikale spids. Dette adskiller midterste kammer fra det apikale tur.
- Komplet dissektion af midterste vinding på en måde svarende til den basale vinding (se trin 5.2.2 til 5.2.4).
- Komplet dissektion af den apikale tur.
- Brug 2,5 mm Vännäs foråret saks, skal du åbne låget, der dækker den apikale tur. Komplet dissektion på en måde svarende til den basale vinding (se trin 5.2.2 til 5.2.4).
BEMÆRK: dissekeret cochlear drejninger kan opbevares i 10 mM PBS, pH 7,4 i en 48-brønds plade (eller kammer slide) ved 4 ° C i adskillige uger før immunfarvning. Men PBS vil fordampe og skal regelmæssigt genopfyldes og opbevaring over 2 - 3 uger kan resultere i bakterie- eller svampevækst påvæv, som kan forringe kvaliteten af billedet. Vi anbefaler langtidsopbevaring af prøver som undissected tidsmæssige knogler.
- Brug 2,5 mm Vännäs foråret saks, skal du åbne låget, der dækker den apikale tur. Komplet dissektion på en måde svarende til den basale vinding (se trin 5.2.2 til 5.2.4).
6. Immunfarvning med fluorescens Tagged antistoffer
- Efter dissektion, gemme hvert cochlear tur i en separat brønd i en 48-brønds plade (eller kammer slide), nedsænket i ~ 500 pi 10 mM PBS, pH 7,4. For hvert af de følgende trin Cochlear tur skal nedsænkes i væske, ikke flyder ovenpå eller sidder fast på siden af brønden.
BEMÆRK: Når du fjerner væske fra hver brønd, er det let at miste de cochlear sving eller suge det op i pipettespidsen. Ændring af løsninger med en 200 ul pipettespids ved hjælp af en dissektion omfang vil bidrage til at forhindre dette. - Ved hjælp af en pipette til at fjerne PBS fra hver brønd og erstatte med ~ 200-300 pi pr hul blokerende / permeabilisering opløsning (1% Triton X-100, 1% bovint serumalbumin (BSA), og 10% normalt gedeserum (NGS) fortyndet i 10 mM PBS pH 7,4). Inkuber 1 time ved stuetemperatur på et 3D rotator.
BEMÆRK: Hvis nogen primært antistof anvendte blev lavet i en ged vært, så et sekundært anti-ged antistof vil være behov for, og NGS bør IKKE bruges til nogen af de trin. Normalt hesteserum kan anvendes som en erstatning for NGS. - Fjern blokering / permeabilisering opløsning under anvendelse af en pipette og erstatte med ~ 100 pi per brønd af primært antistof-opløsning (0,1% Triton X-100, 1% BSA og 5% NGS fortyndet i 10 mM PBS, pH 7,4). Fortyndingsfaktoren for hvert primært antistof varierer. Inkuber O / N (minimum 14 timer) ved 4 ° C på et 3D rotator.
BEMÆRK: Hvis der anvendes mere end et primært antistof, kan alle kombineres i den samme løsning til inkubation, bare sørg for, at hver primære antistof har en anden vært. - Fjern primært antistof under anvendelse af en pipette og udfør 3 vaske af 10 mM PBS pH 7,4 ved ~ 500 pi per brønd. Hver vask udrugning mindst 5 minutter ved stuetemperatur på et 3D rotator.
- Fjern sidste PBS vaske med en pipette og erstatte med ~ 100 pi pr brønd sekundært antistof opløsning (0,1% Triton X-100, 1% BSA og 5% NGS fortyndet i 10 mM PBS, pH 7,4). Fortyndingsfaktoren for hver fluorescens mærkede sekundære antistof er sædvanligvis 1: 500 eller 1: 1000. Placer 48-brønds plade i en sort boks for at beskytte fluorescens mærkede sekundære antistoffer mod lys. Inkuber 2 - 3 timer ved stuetemperatur på et 3D rotator.
BEMÆRK: Hvis der er behov for mere end én sekundært antistof, kan de kombineres til den samme løsning til inkubation. Kontroller, at der ikke er mulighed for cross-mærkning (f.eks. Ved anvendelse af gede-anti-kanin og kylling anti-gede sekundære antistoffer) - Fjern sekundært antistof under anvendelse af en pipette og udfør 3 vaske af 10 mM PBS pH 7,4 ved ~ 500 pi per brønd. Inkuber hver vask i mindst 5 minutter ved stuetemperatur på et 3D rotator. Hold 48 brønde i en sort boks til at beskytte mod lys.
- Fjern sidste PBS vask ved hjælp af en pipette og erstatte med ~ 100 pi per brønd af Hoechst 33342 (fortyndet 1: 2.000 i 10 mM PBS, pH 7,4) til at mærke kernerne. Inkuber 15 - 20 minutter ved stuetemperatur på et 3D rotator. Hold 48 brønde i en sort boks til at beskytte mod lys. IKKE inkuberes længere end 20 min.
- Fjern Hoechst opløsning ved anvendelse af en pipette og udfør 3 vaske af 10 mM PBS pH 7,4 ved ~ 500 pi per brønd. Inkuber hver vask i mindst 5 minutter ved stuetemperatur på et 3D rotator. Hold 48 brønde i en sort boks til at beskytte mod lys.
- Alle trin kan udvides, undtagen Hoechst inkubation af flere timer, hvis det er nødvendigt. At holde pause reaktionen på noget tidspunkt, bare nedsænkes prøver i ~ 500 ul 10 mM PBS pH 7,4 og opbevare 48 brønds plade (eller kammer slide) ved 4 ° C indtil den er klar til at genoptage protokolindstillingerne timer eller 1 - 2 dage senere .
7. Mount Cochlear Tænder Slides
- Label glider med relevante oplysninger om prøven og antistoffer anvendes.
- Pipette ~ 50 ul montering medier på hver dias og være omhyggeligat forhindre bobler. Centrifugeres røret med de monteringsmedie for at fjerne eventuelle bobler.
- Brug # 4 eller # 5 lige guldsmedens pincet, forstå axoner af spiral ganglion til forsigtigt at overføre en cochlear tur fra 48 brønde til dias og plads i montering medier. Mount én cochlear tur per dias til at forhindre lys eksponering og fotoblegning under billeddannende proces.
- Brug et stereo-dissektion mikroskop for at sikre, at cochlear sving ikke er foldet, snoet, eller i nærheden af en luftboble. Hvis nogen af disse forhold forekommer, skal du bruge # 4 eller # 5 lige guldsmedens pincet flytte cochlear tur.
- Placer den ene ende af et dækglas på objektglasset og forsigtigt slip for at lade dækglasset falde.
- Brug en stereo dissektionsmikroskop for at sikre, at cochlear tur ikke er foldet, snoet eller i nærheden af en luftboble. Hvis nogen af disse forhold forekommer, forsigtigt flytte dækglasset frem og tilbage for at flytte cochlear tur.
- Placer diasi et dias mappe, så de ligger fladt. Lad montering medier kur O / N ved RT (holde i mørke)
- Seal dækglas med klar neglelak og opbevares ved stuetemperatur eller -20 ° C indtil afbildet. Slides kan opbevares i en mappe eller slide slide boks.
BEMÆRK: Slides kan opbevares i lang tid ved -20 ° C eller -80 ° C, og fluorescens vil blive opretholdt i adskillige måneder. - Billede glider ved hjælp af et konfokalt mikroskop med den passende bølgelængde baseret på de sekundære antistoffer anvendes under proceduren. Immunfarvning Kan udføres justeringer lysstyrke og kontrast ved hjælp af imaging software leveres af konfokale leverandør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi præsenterer en metode til at isolere cortiske organ som tre intakte cochlear vindinger (apex, midterste og base) fra Cochlear væv, der er forkalket, med centrale dissektion trin vist i figur 1. I den første postnatale uge af udvikling, forkalkning af mus cochlea er ufuldstændig og en mere enkel dissektionsmetoden kan anvendes 13. Brug den neonatale hele mount dissektion metode med cochlea fra P7 og ældre mus resulterer i tårer og makulering af organ Corti. Spiral ligament / sidevæg er nu mere solidt fastgjort og ikke kan trækkes bort fra sensoriske epithel uden at forårsage skader. Således er der behov for "voksen" hele mount dissektion metode for prøver ældre end P6. Vi præsenterer et eksempel på den midterste vinding hos en P15 mus cochlea, som er blevet dissekeret og immunfarvet med hår celle og understøttende cellemarkører (figur 2). Optiske cross-hovedafdeling Cen også opnås med hele mount teknik (figur 3).
Flere problemer kan opstå under hele mount dissektion eller ved montering af cochlear tændes dias. Under fjernelsen af spiralen ligament / sidevæg, der er et smalt vindue mellem at skære for meget eller ikke nok. Udskæringer, der opstår ved siden af den sidste række af ydre hårceller kan forårsage hårcellerne i denne sidste række at montere på forskellige vinkler (figur 4A). Cuts der er for store kan fjerne dele af organet for Corti (figur 4B). Håndtering af prøven med pincet tager stor omhu og ofte er der huller i organ Corti hvor pincet blev malplacerede (figur 4C). Endelig når montering af cochlear sving, kan det organ Corti fold som tilslører billedet (figur 4D).
Figur 1. vigtige skridt i Whole Mount Dissektion af "voksen" Mus Cochlea. (A) efter protokol trin 5.1.4, er den basale årsskiftet cochlea adskilt fra midten / apikale sving, men stadig knyttet til det vestibulære region. (B) Efter protokol trin 5.3.3, er den midterste tur adskilt fra den apikale tur. (C) Eksempel på udfyldt dissektion af en midt sving, hvor spiralen ledbånd / laterale væg fjernes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Konfokal Slice Billede af MellemøstenDrej isoleret fra en P15 mus. Fire 20x billeder overlejret at rekonstruere hele midterste tur. Hårceller er mærket med en kanin-anti-myosin VIIa primært antistof (1: 200 fortynding) kombineret med et æsel anti-kanin Alexa 488-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) (magenta). Støtteceller er mærket med en gede-anti-Sox2 primære antistof (1: 500 fortynding) kombineret med et æsel anti-ged Alexa 568-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) (grøn). Hoechst (blå) etiketter alle kerner. Billede blev taget med et Zeiss LSM 700 konfokal mikroskop med 405, 488, og 555 bølgelængder. Skala bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Optisk Tværsnit af Mellemøsten Turn Isoleret fra en 6-uger gamle mus. (A) Konfokal udsnit billede af hele mount præparat (nederst) og optisk tværsnit i XZ-planet (øverst). (B) Øget forstørrelse af toppanelet i (A), med trådkorset fjernet. Hårceller er mærket med en kanin-anti-myosin VIIa primært antistof (1: 200 fortynding) kombineret med et æsel anti-kanin Alexa 647-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) (magenta). Støtteceller er mærket med en gede-anti-Sox2 primære antistof (1: 500 fortynding) kombineret med et æsel anti-ged Alexa 568-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) (grøn). Billede blev taget med et Zeiss LSM 700 konfokal mikroskop med 405, 555, og 647 bølgelængder. Scale barer = 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på problemer, der kan opstå under hele Mount Dissektion eller ved montering Cochlear Tænder Slides. (A) På venstre side af billedet, blev cochlear væv skæres ud for den sidste række af ydre hårceller forårsager mange af disse celler, der skal monteres på forskellige vinkler. (B) En del af cortiske organ på venstre side af billedet er blevet afskåret. (C) Der er et hul udstanset i den ydre hårcelle region i midten af billede. (D), er det organ Corti foldet flere steder. Billeder blev taget 4-8 uger gammel mus cochleae. Hårceller er mærket med en kanin-anti-myosin VIIa primært antistof (1: 200 fortynding) kombineret med en gede-anti-kanin-Alexa 488-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) eller et æsel-anti-kanin Alexa 488-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) (magenta). I C ydre hår cells er mærket med et gede-anti-Prestin primære antistof (1: 200 fortynding) kombineret med et æsel anti-kanin Alexa 568-konjugeret sekundært antistof (1: 1000 fortynding) (grøn). Billeder blev taget med et Leica SP5 konfokal mikroskop med 405, 488 og 555 nm bølgelængder. Skalapanelerne: i AB = 20 um; CD = 40 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske trin for en vellykket helhed mount dissektion og immunfarvning. Men før en af disse metoder udføres, er nødvendig korrekt fiksering af cochlear væv. Vi anbefaler at bruge methanol gratis, ultrarent, EM kvalitet PFA. PFA fremstillet af pulver kan have spor af methanol og en ustabil pH, som nedsætter kvaliteten af immunofluorescens. Andre grupper har også vist, at lignende dissektioner er mulige ved hjælp af fikseringsmidler, som ikke indeholder formaldehyd 14-16. Længden af fiksering er også vigtig og er specifikt antistof. Nogle antistoffer kan tolerere en O / N-fiksering, mens andre ikke fungerer godt med blot 1 time i PFA (men dette er sjældent). Under-fikseret væv kan være problematisk for dissektion metoden som vævet falder fra hinanden. Det er vores erfaring en 3 - 4 timer fiksering giver tilstrækkelig fiksering og ikke interfererer med de fleste af primære antistoffer almindeligvis anvendes i retsmødet felt.
jove_content "> Det er også muligt, at EDTA kan forstyrre primære antistoffer;. dermed nogle antistoffer vil fungere godt i neonatal væv, men ikke i P7 eller ældre væv, der blev afkalket Efter fiksering kan tindingeben opbevares i variable mængder af tid, inden afkalkning afhængigt af antigenerne, der undersøges. Nogle antigener kræver afkalkning og dissektion inden for få dage eller uger efter fiksering, mens andre kan opbevares i årevis (enten før eller efter afkalkning) uden at forringe kvaliteten af immunfarvning. Det anbefales at opbevare prøver som tindingeben på grund af risikoen for afdampning af lagermedier (PBS) fra 48-brønds plade og potentiel kontamination med svamp eller bakterier. Vi udfører typisk hele mount dissektion mindre end en uge i forvejen til immunfarvning.Når faste og afkalket, er hele mount dissektion udført med tindingebenet nedsænket i væske. Fjernelse af overskydende knogle og blødtvæv, der omgiver labyrinten tidligt i dissektion vil hjælpe med fjernelse af spiral ligament / sidevæg på et senere tidspunkt ved at lette manipulation af vævet og give en mindre skjult visning af kritiske strukturer. Ved udførelse af de første par trin kan pincet bruges til at holde vævet i det vestibulære region. Men når svingene er isoleret, er det vigtigt at undgå at placere pincet på organ Corti eller spiral ligament / laterale væg. I stedet holde pincet lukket og pin spiral ganglion nervefibre til silicone elastomer-belagt dissektion fad. Må ikke holde på denne region som vævet vil rive. Generelt når vævet er blevet opdelt i tre omgange, gribe og trække manøvrer kan forårsage uforudsigelige resultater, der ofte skadelige for cortiske organ og bør undgås. Væv fra yngre dyr (P7-P21) tendens til at være mere tilgivende end væv fra dyr ældre end P21. Foruden, cochlear prøver med hårcelle dAmage er vanskeligere at dissekere. Hvis musen modtaget støjbelastning vævet er særligt skrøbelige. Uanset hvilken tilstand af vævet, dissektion vi præsenterer er teknisk krævende og kræver mange praksis forsøg for duelighedsbevis.
Under immunfarvning, er det vigtigt, at hver cochlear igen er nedsænket i flydende, ikke flyder ovenpå eller sidder fast på siden af brønden. Dette tillader mere fuldstændig gennemtrængning af triton og antistoffer i vævet. Når væsken fjernes fra hver brønd, er det let at miste cochlear turn eller trække det op i pipettespidsen. Ændring af løsninger med en 200 ul pipettespids ved hjælp af en dissektion omfang vil bidrage til at forhindre dette. Langsomt udtrække væsken og bevæge pipettespidsen hvis cochlear turn kommer for tæt. Også pipetteting affald opløsning i en ren rør kan være en god strategi, da dette affald rør kan søges, hvis et sving ved et uheld trækkes op i pipetten. Hvis igen er fast i pipettespidsen, tHan tip kan skæres åben med et barberblad, men ofte organ Corti vil blive beskadiget, hvis dette sker.
Når fejlfinding antistoffer til immunfarvning, kan yderligere trin såsom antigen hentning eller signal forstærkning tilsættes. Der er lav pH og høj pH antigen demaskering reagenser, der kan købes. Hvis et antistof ikke fungerer sammen med den her beskrevne fremgangsmåde, den første protokol ændring at prøve er en af disse antigen hentning metoder. Alternativt kan du bruge et signal forstærker. Der er kommercielt tilgængelige løsninger til brug før immunfarvning eller tyramid forstærkning kits, der kan anvendes til at forstærke signalet fra det sekundære antistof.
Betydningen af teknikken præsenterer vi er evnen til at opretholde den tredimensionale struktur af cortiske organ og at visualisere alle celler i organet. Hele længden af cochlea adskilles i kun tre omgange, mens andre lignende teknikker, nemlig the Bohne og Liberman metoder, kræver opdeling i 5 - 10 stykker 6-8, øge antallet af prøver for at manøvrere i Immunofarvningen og billedbehandling processer. Cochlear sidevæg dissektion der blev udviklet af Cosgrove og Gratton kræver en tilsvarende niveau af dygtighed og er mulig i ikke-fikserede, frisk væv, såvel som i afkalket væv, men cortiske organ strippes væk og ødelagt i processen med isolering af lateral væg 17. En anden gruppe har udført lignende dissektioner i ikke fastbundet, frisk cochlear væv fra tre uger gamle rotter, hvor spiralen ledbånd / laterale væg gribes og strippet væk fra organ Corti, der forlader orglet intakt. Men dette var kun opnået i den apikale sving 5. Metoden til peeling spiral ledbånd / sidevæg væk fra organ Corti er rutine for dissektion af fast væv i en ung mus (<P7) 13. Men vores erfaring med mus ældre end P6, efter fiksering etd afkalkning, denne manøvre ofte tårer organet for Corti i en upålidelig måde. Desuden proceduren beskrevet her tillader isolering af midten og basal vender så godt.
Kryosnit og sektioner opnået efter paraffinindlejring er også almindeligt anvendt i den auditive område. Disse metoder tillader visualisering af andre strukturer, såsom stria vascularis, Reissner membran og tectorial membran, men hver sektion kun tillader visualisering af et lille område af organet cortiske i hvert cochlear tur. Således at undersøge hændelser, der forekommer i et mosaikmønster, såsom celletab eller celledeling, med sektionering metode, skal farves og afbildes til at fange hele længden af cochlea 50 eller flere objektglas. I modsætning hertil hele mount dissektion protokollen har den fordel til fremstilling af hele organet cortiske på blot tre stykker. Ud over fordelen ved at bevare den langsgående arkitektur organ Corti Dette technique giver mulighed for indsamling og opbevaring forenklet data. En begrænsning af hele mount dissektion er, at det ødelægger omkringliggende strukturer såsom spiral ligament, stria vascularis, Reissner membran og tectorial membran. En anden begrænsning er de tekniske vanskeligheder og længden af tid for en enkelt dissektion. Dette er for det meste på grund af den skrøbelige karakter af organ Corti og lille margin til fejl, når du fjerner spiral ledbånd / laterale væg. Når beherskes, kan hele mount dissektion af en cochlea udføres i ca. 20 - 30 min.
Mens ovenstående protokol beskriver en hel mount dissektion metode til den voksne mus, håber vi at anvende denne teknik til andre modelorganismer, der anvendes i det auditive område. Vores laboratorium er i øjeblikket at ændre denne teknik til dissektion af rotte cochlea. Jo større cochlea af rotte er indkapslet i et tykkere otiske kapsel, der er mere tæt end forkalket musen. Således tindingebenet skal excised med store saks. Før fiksering og afkalkning med EDTA, bør otiske kapsel åbnes med en saks for at give bedre adgang til cochlear væv. Også afkalkning, er længere og kan tage op til 3 uger afhængigt af alder af prøven. For hele mount dissektion, størrelsen af den benede labyrint påvirker teknikken. Den forøgede størrelse af rotte cochlea giver en lidt større afstand mellem spiral ligament / sidevæg og organ Corti, hvilket giver en større fejlmargin for de enkelte snit. Men mens de større væv kan give mere materiale til at gribe til manipulation af prøven, det kræver også et større antal snit til at fjerne hele længden af spiralen ligament / sidevæg. Vi mener, at analoge modifikationer kunne gøres til dissektion af cochlea fra chinchilla, gerbil, og marsvin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A.
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
