Summary
אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר הבוגר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס). אנחנו גם מדגימים הליך immunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently. יחד טכניקות אלה יאפשרו המחקר של תאי שיער, תאי תמיכה, וסוגי תאים אחרים הנמצא בשבלול.
Introduction
השבלול בצורת הספירלה של האוזן הפנימית, בתוך העצם הטמפורלית, בתי האיבר של קורטי, איבר השמיעה החושי הסוף ביונקים. השבלול מאורגן tonotopically ומחולק בדרך כלל לפסגה, אמצע, ובסיס פונה מתאים לאזורים שונים בתדירות עם זיהוי קול בתדר גבוה בבסיס וזיהוי בתדר נמוך בקודקוד 1. תאי שיער, תאי mechanosensory של האיבר של קורטי, לאורכו של שבלול האוזן, שהם כ 6 מ"מ ארוך בעכברי 2,3. תאים אלה להמיר את האנרגיה המכנית של גלי קול, שמועברים דרך המבוך הקרומי מלא הנוזל, לאותות עצביים המעובדים על ידי מבנים שמיעתיים מרכזיים. הטכניקה המתוארת כאן מספקת שיטה להכנת mounts של האיבר של קורטי כל אחרי ההסתיידות של השבלול היא מלאה (לדגימות החל שבוע בגיל אחת לבגרות). כמו כן, אנו מציגים שיטה לimmunostaining כל רכוב רקמת שבלול. mounts כל שבלול הם קריטיים להדמיה של כל תאי השיער ותאים המקיפים את תמיכה בסידורים מרחביים הטבעיים שלהם ולאפשר לניתוח בשלושה ממדים בשימוש במיקרוסקופ confocal.
בני הזוג. האנס Engstrom והארלו עדס במקור תיארו שיטת הר שלמה שבלול נתיחה בשנת 1966. הם מפורטים טכניקה לתקן במהירות ולנתח cochleae המסויד שקוע בנוזל ממגוון רחב של יונקים, שמירת מגזרים שלמים קצרים של האיבר של קורטי לניתוח מיקרוסקופי 4. הנתיחה של שבלול עכברוש מבולבל, מסויד גם כבר מודגמת בסרטון הדרכה 5. בני הזוג. ברברה Bohne וגארי הרדינג באוניברסיטת וושינגטון עשו כמה שינויים חשובים בשיטה זו. בגרסתם של שיטת ההר השלמה השבלול, העצם הטמפורלית היה נטול הסידן, משובץ בפלסטיק, וחמישה וחצי או עשרה סיבובים רבע תור היו dissecטד 6,7. ד"ר צ'רלס ליברמן ועמיתיו באיטון מעבדות פיבודי, מסצ'וסטס עין ואוזן המרפאה, השינוי בטכניקה זו, כך שהטבעת הפלסטיק לא נדרשה 8. שינוי נוסף של הטכניקה התרחש במעבדה של ד"ר ג'יאן זואו בבית החולים למחקר סנט ג'וד 9-12 שהודיע לשיטה לנתיחה שהוצגה כאן. אנו משתמשים באסטרטגיה שונה כדי לקבל גישה לאיבר של קורטי מאשר Bohne וליברמן, המאפשר בידוד של הפסגה מלאה, אמצע, וסיבובים בסיסיים. כך הרקמה גזור היא גדולה יותר ופחות סיכוי להיות אבד או ניזוק במהלך תהליכי הנתיחה או immunostaining. בנוסף, השיטה הנוכחית מאפשרת מדידה של המרחק מקצה הקודקוד או הוו בסיסי לזיהוי אזור תדר.
למרות שמעבדות רבות לבצע immunostaining של רקמת שבלול, לא ברור היכן מקורו בשיטה זו. כתוצאה מכך יש מתכונים שונים לחסימת buffeRS ומאגרי דגירה נוגדן שעשוי להשפיע על הביצועים של נוגדנים ראשוניים בודדים. כאן, אנו מציגים שיטה אחת לimmunostaining עם נוגדנים מתויגים fluorescently שחל על נוגדנים הנפוצים ביותר בתחום השמיעתי.
הצורה המורכבת של השבלול, המבנה עדין של האיבר של קורטי, וההסגר גרמי לספק אתגר לניתוח היסטולוגית וביוכימיים. מגוון של טכניקות משמש כיום בתחום השמיעה להתגבר על התכונות קשות האלה ולדמיין את התאים בתוך האיבר של קורטי, כל טכניקה עם יתרונות משלה וחסרונות. הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר לנתיחה הר שלמה של שבלול העכבר הבוגר ו, עם שינוי קל, עלול לשמש כדי לבחון מבנים הקריטיים בתוך cochleae ממגוון רחב של אורגניזמים מודל אחרים המשמשים בתחום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: נהלים כרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש באוניברסיטת דרום אילינוי לרפואה.
1. הפקה של עצמות זמניות
- לזהות עצמות זמניות בבסיס גולגולת העכבר 13 ולגרד ממנו את עצבי הגולגולת באמצעות מלקחיים דפוס סטנדרטיים.
- מניחים מלקחיים דפוס סטנדרטיים בקצה של הקפסולה otic ועם האגודל של יד העיתונות ההפוכה על התעלה חצי עגולה האחורית כדי לסלק את השבלול במארז.
- לשחרר את החצי התחתון של העצם הטמפורלית מהגולגולת באופן ידני עם האגודל והאצבע או באמצעות 10.5 סנטימטר מספריים עדינים.
2. פוסט לתקן עצמות זמניות
- מניחים עצמות זמניות לתוך 2 מיליליטר צינורות microcentrifuge המכילים 250-500 μl paraformaldehyde 4% (PFA) בדילול מלא בופר פוספט 10 מ"מ (PBS) pH 7.4 וincubאכלתי ב RT עבור 2 - 20 שעות.
הערה: אין צורך בפתיחת המכסה או הזרקת הפסגה של PFA לסיבוב החלון סגלגל או. מומלץ להשתמש בכיתת מתנול החופשית, אולטרה-טהור, במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) PFA שניתן לרכוש בריכוז 16% בבקבוקוני זכוכית. ברגע שבקבוקון נפתח ודילול 1: 4 בPBS, מה שהופך את פתרון 4%, ניתן להשתמש בו לתקופה של עד 2 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלסיוס (נוגדנים מסוימים דורשים קיבוע ואחרים קצרים יכול לסבול O / N (O / N) קיבעון).
3. עצמות זמניות Decalcify
- לאחר קיבוע, להסיר PFA בעזרת פיפטה ולהחליף עם 120 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), מעט יותר מ -2 מיליליטר. הקפד למלא את צינור microcentrifuge 2 מיליליטר כל כדי למנוע בועות אוויר כאשר הצינור סגור.
- אם לא decalcifying מייד, להחליף PFA עם דגימות pH 7.4 וחנות 10 מ"מ PBS ב 4 מעלות צלסיוס
הערה: לאחר קיבוע, ניתן לאחסן עצמות זמניות לvariable מסתכם של זמן עד שנבחן decalcification בהתאם לאנטיגנים.
- אם לא decalcifying מייד, להחליף PFA עם דגימות pH 7.4 וחנות 10 מ"מ PBS ב 4 מעלות צלסיוס
- מקום צינורות על הכתף הסוף-על-הסוף ולסובב ב 4 סל"ד ב RT. לשנות פתרון EDTA יומי בעזרת פיפטה. אורכו של decalcification תלוי בגיל של המדגם והעדפתו של המדען עושה הנתיחה.
- דגירה עצמות זמניות בEDTA באמצעות ההנחיות לזמני דגירה הבאות:
עבור דגימות יום (P) לאחר הלידה 8 לP15: 2 - 4 שעות; לP15 דגימות לP21: O / N; לP21 דגימות לP30: 2 O / N; עבור דגימות מבוגרות מP30: 3 או יותר O / N.
הערה: הפעמים decalcification כפופות להעדפה של משתמשים וניתן להרחיב על פי צורך. זמן decalcification יכול להיות מופחת על ידי שינוי פתרון EDTA פעמיים ביום, מלבד כ -8 שעות. מעבדות כמה להוסיף 1% PFA לפתרון EDTA כאשר decalcifying ליותר מ -3 ימים על מנת למנוע זיהום.
- דגירה עצמות זמניות בEDTA באמצעות ההנחיות לזמני דגירה הבאות:
- כדי לקבוע אם המדגם הוא נטול הסידן כראוי, למקם את העצמות זמניות oסיליקון אלסטומר na מצופה צלחת לנתיחה ולוחץ בעדינות על מלקחיים השבלול בצורת השבלול. אם הרקמה היא ספוגית, אז decalcification הוא מלא.
- ברגע שdecalcification הושלם, להסיר EDTA בעזרת פיפטה ולהוסיף 500 -1000 μl של 10 מ"מ PBS pH 7.4. דגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לנתח.
4. צור צלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון
- מערבבים את הבסיס וסוכן ריפוי של ערכת encapsulant אלסטומר סיליקון על פי הוראות היצרן ומערבבים היטב.
- להוסיף כ 2 - 3 כפות של אבקת פחם עד הפתרון הוא שחור ומערבבים היטב.
הערה: דיו נוזלי או פחם נוזלי לא לערבב עם הפתרון ולא ניתן להשתמש בו. ניתן לרכוש ערכות encapsulant אלסטומר סיליקון בצבע שחור, המאפשרות ללהשמיט שלב 4.2. - יוצקים את הפתרון לזכוכית 60 מ"מ או צלחות פטרי פלסטיק, מילוי מספיק כדי מעיל התחתון. אם bubbles נמצא, עלים עם אוויר על פני השטח. תן לעמוד לפחות 24 שעות בRT להגדיר.
ניתן להשתמש בכלים מצופים אלסטומר סיליקון שוב ושוב במשך שנים: הערה. עם זאת אין להשתמש באתנול לניקוי, כמו זה יגרום אלסטומר סיליקון לפיצוח.
5. הר השלם Dissection של השבלול (לP7 ודוגמאות ישנות יותר)
- הפרד את התור הבסיסי מתור הפסגה / אמצע
- מניחים עצם הטמפורלית נטול הסידן אחד בצלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון מולא באופן מלא שני שלישים עם 10 מ"מ PBS pH 7.4 ולהשתמש מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו לשלבים הבאים.
- החזק את העצם הטמפורלית באזור שיווי המשקל עם מס '4 או # 5 המלקחיים של צורף ישר ובאמצעות 5 מ"מ מספריים אביב Vannas-טובינגן, לחתוך רקמות כמוסת otic עודפות לאורך הצדדים ומעל לקודקוד.
- באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, הכנס להב אחד לחלון הסגלגל ולעשות כמה חתכים קטנים לאורך רצועת ספירלה / לרוחבקיר של התור הבסיסי.
- בעזרת מספריים אביב 5 מ"מ Vannas-טובינגן, הכנס להב אחד לאזור רק לחתוך ולמקם את הלהב האחר על מחוץ לעצם הטמפורלית, המדיאלי לחלון הסגלגל. קיצוץ זה מפריד תור הבסיסי מתור אמצע והפסגה.
- נתיחה מלאה של התור הבסיסי.
- באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לחתוך את סיבי עצב הגנגליון ספירלה המתחברים כלִּישׁוֹר כדי לשחרר את המתח בתורו הבסיסי ולחתוך מתחת לתורו הבסיסי להיפרד מאיברי שיווי המשקל.
- באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לעשות סדרה של חתכים קטנים כדי להסיר את רצועת ספירלה / הקיר לרוחב משני מעל ומתחת לאיבר של קורטי. השתמש # 4 או 5 # המלקחיים של צורף ישר כדי להנחות את הרקמה. הצמד את סיבי עצב הגנגליון ספירלה לצלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון, אבל לא להיאחז אזור זה כרקמה תקרע.
- במהלך השלבים הקודמים, חלק מmembran של רייסנרהדואר יהיה לעתים קרובות יוסר. אם כל עדיין, לתפוס הקרום של רייסנר עם המלקחיים # 4 או 5 של תכשיטים ישרים ולהתרחק מהאיבר של קורטי.
הערה: קרום tectorial הוא לעתים רחוקות גלוי, ובדרך כלל צף משם ללא צורך בצעד מסוים להסרת. - סוף סוף לעשות כמה חתכים כדי להפחית את העובי של אקסונים הגנגליון ספירלה, על מנת להפוך את התור שטוח ככל האפשר ולהשתמש מס '4 או # 5 המלקחיים של צורף ישר להעביר את תור הבסיס גזור, על ידי אחיזת האקסונים הנותרים של הגנגליון הספירלה, ל צלחת 48-היטב (או תא שקופיות) המכילים ~ 500 μl של 10 מ"מ PBS pH 7.4.
- אמצע נפרד וסיבובי הפסגה
- הנח את שני השלישים הנותרים של שבלול האוזן, צד הפסגה למטה.
- באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, הכנס להב אחד לתקשורת סקאלה בי תור האמצע משמש לחיבור לתורו הבסיסי, ולעשות כמה חתכים קטנים לאורך רצועת ספירלה / הקיר לרוחב של הדואר אמצע התור.
- בעזרת מספריים אביב 5 מ"מ Vannas-טובינגן, הכנס להב אחד לאזור רק לחתוך עם תור האמצע ממוקם על גבי הלהב, ולמקם את הלהב האחר על מחוץ למבוך הגרמי, בזווית של 90 o מקצה הקודקוד. זה מפריד תור האמצע מתור הפסגה.
- נתיחה מלאה של תור האמצע בצורה דומה לתורו הבסיסי (ראה 5.2.2 צעדים ל5.2.4).
- נתיחה מלאה של תור הפסגה.
- באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לפתוח את הכובע שמכסה את תור הפסגה. נתיחה מלאה באופן דומה לתורו הבסיסי (ראה 5.2.2 צעדים ל5.2.4).
ניתן לאחסן תור שבלול גזור ב10 מ"מ PBS pH 7.4 בצלחת 48-היטב (או שקופיות קאמריות) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות לפני immunostaining: הערה. עם זאת PBS יתאדה וצריך להתחדש מעת לעת והאחסון ארוך יותר מ2-3 שבועות יכול לגרום להתפתחות חיידקים או פטרייתי ברקמה אשר יכול להקטין את איכות התמונה. אנו ממליצים אחסון לטווח הארוך של דוגמאות כמו עצמות זמניות undissected.
- באמצעות 2.5 מ"מ מספריים אביב Vannas, לפתוח את הכובע שמכסה את תור הפסגה. נתיחה מלאה באופן דומה לתורו הבסיסי (ראה 5.2.2 צעדים ל5.2.4).
Immunostaining 6. עם נוגדנים מתויגים fluorescently ש
- לאחר הנתיחה, לאחסן כל תור שבלול ובנפרד בצלחת 48-היטב (או שקופיות קאמריות), שקוע ב~ 500 μl של 10 מ"מ PBS pH 7.4. לכל אחד מהשלבים הבאים תור השבלול צריך להיות שקוע בנוזל, לא צף על גבי או דבוק לצד השני של הבאר.
הערה: בעת הסרת נוזל מכל טוב, זה קל לאבד את תור השבלול או למצוץ אותו בקצה פיפטה. שינוי פתרונות עם קצה פיפטה 200 μl באמצעות היקף נתיחה יעזור למנוע את זה. - בעזרת פיפטה, להסיר PBS מכל טוב ולהחליף עם ~ 200-300 μl לכל גם חסימה / פתרון permeabilization (1% Triton X-100, 1% אלבומין בסרום שור (BSA), ו -10% עזים בסרום נורמלי (NGS) בדילול מלא 10 עמ מ"מ PBSH 7.4). דגירה שעה 1 ב RT על הכתף 3D.
הערה: אם כל נוגדן ראשוני משמש נעשה במארח עז, אז נוגדן אנטי-עז משנית יהיה צורך ולא צריך להיות בשימוש NGS לכל אחד מהשלבים. סרום סוס רגיל יכול לשמש כתחליף לNGS. - הסר חסימה / פתרון permeabilization בעזרת פיפטה ולהחליף עם כל טוב של פתרון נוגדן ראשוני ~ 100 μl (0.1% Triton X-100, NGS BSA 1%, ו -5% בדילול מלא 10 מ"מ PBS pH 7.4). הגורם לדילול עבור כל נוגדן ראשוני משתנה. דגירה O / N (HR 14 המינימום) בשעת 4 המעלות צלסיוס על הכתף 3D.
הערה: אם משמש נוגדן אחד או יותר יסודי, כל ניתן לשלב אותו הפתרון לדגירה, רק לוודא שכל נוגדן ראשוני מארח שונה. - הסר פתרון נוגדן ראשוני בעזרת פיפטה ולבצע 3 שוטף של 10 מ"מ PBS pH 7.4 ב ~ 500 μl בכל טוב. כל אחד לשטוף דוגר מינימום של 5 דקות ב RT על הכתף 3D.
- הסר P האחרוןBS לשטוף בעזרת פיפטה ולהחליף עם ~ 100 μl לכל גם פתרון נוגדנים משני (0.1% Triton X-100, NGS BSA 1%, ו -5% בדילול מלא 10 מ"מ PBS pH 7.4). הגורם לדילול עבור כל מתויג fluorescently נוגדנים משני הוא בדרך כלל 1: 500 או 1: 1,000. מניחים צלחת 48-היטב בקופסא שחורה כדי להגן מתויג fluorescently נוגדנים משני מהאור. דגירה 2 - 3 שעות ב RT על הכתף 3D.
הערה: אם יש צורך בנוגדן אחד או יותר משני, הם יכולים להיות משולבים לאותו פתרון לדגירה. ודא שאין אפשרות של תיוג צולב (למשל., באמצעות עז נגד ארנב ועוף אנטי-עז נוגדנים משני) - הסר פתרון נוגדנים משני באמצעות פיפטה ולבצע 3 שוטף של 10 מ"מ PBS pH 7.4 ב ~ 500 μl בכל טוב. דגירה כל שטיפה למינימום של 5 דקות ב RT על הכתף 3D. שמור צלחת 48 היטב בקופסא שחורה כדי להגן מפני אור.
- הסר לשטוף PBS האחרון בעזרת פיפטה ולהחליף עם כל טוב של Hoec ~ 100 μlHST 33342 (בדילול 1: 2,000 ב 10 מ"מ PBS pH 7.4) לתייג גרעינים. דגירה 15 - 20 דקות ב RT על הכתף 3D. שמור צלחת 48 היטב בקופסא שחורה כדי להגן מפני אור. אל דגירה ארוכה יותר מ -20 דקות.
- הסר פתרון Hoechst בעזרת פיפטה ולבצע 3 שוטף של 10 מ"מ PBS pH 7.4 ב ~ 500 μl בכל טוב. דגירה כל שטיפה למינימום של 5 דקות ב RT על הכתף 3D. שמור צלחת 48 היטב בקופסא שחורה כדי להגן מפני אור.
- ניתן להרחיב את כל הצעדים, למעט הדגירה Hoechst, על ידי כמה שעות במידת הצורך. כדי להשהות את התגובה בכל שלב, רק לצלול דגימות ב~ 500 ul של 10mm PBS pH7.4 ולאחסן את הצלחת 48 "טוב (או תא שקופיות) בשעת 4 המעלות צלסיוס עד מוכן לחדש את שעות פרוטוקול או 1 - 2 ימים לאחר מכן .
7. הר שבלול מאירה בשקופיות
- תווית שקופיות עם מידע רלוונטי על המדגם ונוגדנים בשימוש.
- פיפטה ~ 50 μl של תקשורת הרכבה על כל שקופית ולהיזהרכדי למנוע בועות. צנטריפוגה הצינור המכיל את תקשורת ההרכבה כדי להסיר בועות.
- שימוש במס '4 או מלקחיים # 5 של התכשיטים ישרים, לתפוס את האקסונים של הגנגליון הספירלה להעביר בעדינות תור שבלול אחד מהצלחת 48 היטב לשקופית והמקום בתקשורת ההרכבה. הר תור שבלול אחד לכל שקופית כדי למנוע חשיפה לאור וphotobleaching במהלך תהליך ההדמיה.
- השתמש במיקרוסקופ לנתיחה סטריאו כדי להבטיח שתור שבלול אינו מקופל, מעוות, או בסמוך בועת אוויר. אם כל התנאים הללו מתרחשים, המלקחיים # שימוש 4 או 5 של התכשיטים ישר כדי למקם מחדש את תור השבלול.
- מניחים בקצה אחד של coverslip בשקופית ומשחרר בעדינויות לתת coverslip הסתיו.
- השתמש במיקרוסקופ לנתיחה סטריאו כדי להבטיח שתור השבלול אינו מקופל, מעוות, או בסמוך בועת אוויר. אם כל התנאים הללו מתרחשים, בעדינות להזיז את coverslip קדימה ואחורה כדי למקם מחדש את תור השבלול.
- שקופיות מקוםבתיקיית שקופיות, כך שהם שכבו. בואו הרכבה O תרופת תקשורת / N ב RT (לשמור בחושך)
- coverslips חותם עם לק ציפורניים ברורים ולאחסן ב RT או C -20 o עד צילם. שקופיות ניתן לאחסן בתיקיית שקופיות או תיבת שקופיות.
הערה: ניתן לאחסן שקופיות לטווח ארוך בC -20 o או -80 מעלות צלסיוס וקרינה יישמר במשך כמה חודשים. - שקופיות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם אורך הגל המתאים המבוסס על הנוגדנים משני המשמשים במהלך הליך immunostaining. ניתן לבצע התאמות בהירות והניגודיות באמצעות תוכנת ההדמיה מסופקת על ידי הספק confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו מציגים שיטה לבודד את האיבר של קורטי כשלושה סיבובים שלמים שבלול (קודקוד, אמצע, ובסיס) מרקמת שבלול שהוא מסויד, בצעדים לנתיחה מפתח מוצגים באיור 1. בשבוע הראשון לאחר הלידה של פיתוח, ההסתיידות של שבלול העכבר אינו שלם ושיטה לנתיחה פשוטה יותר ניתן להשתמש 13. שימוש בשיטה בילוד ההר שלמה לנתיחה עם שבלול מP7 ותוצאות עכברים מבוגרים בדמעות ורטוש של האיבר של קורטי. רצועת ספירלה / הקיר לרוחב כעת מחובר היטב יותר ולא ניתן התקלף מהאפיתל החושית ללא גרימת נזק. כך בשיטה "למבוגרים בלבד" ההר השלמה הנתיחה דרושה לדגימות מבוגרות מP6. אנו מציגים דוגמא של תור אמצע שבלול עכבר P15 שכבר ניתח וimmunostained עם תא שיער וסמני תמיכה תא (איור 2). ג חתכים אופטי גם להשיג עם כל טכניקת ההר (איור 3).
כמה בעיות יכולות להתרחש במהלך כל נתיחת ההר או כאשר ההרכבה השבלול פונה בשקופיות. במהלך הסרת רצועת ספירלה / הקיר לרוחב, יש חלון צר שבין החיתוך יותר מדי או לא מספיק. קיצוצים המתרחשים בסמוך לשורה האחרונה של תאי שיער חיצוניים עלולים לגרום לתאי שיער בשורה האחרונה זה לעלות בזוויות מגוונות (איור 4 א). קיצוצים כי הם גדולים מדי יכולים להסיר חלקים של האיבר של קורטי (איור 4). טיפול במדגם עם מלקחיים דואג גדול ולעתים קרובות יש חורים באיבר של קורטי שבו מלקחיים היו משוללות (איור 4C). לבסוף, כאשר ההרכבה תור השבלול, האיבר של קורטי יכול לקפל אשר מטשטשת את התמונה (איור 4D).
-together.within עמודים = "1">
איור 1. צעדים חשובים בהר השלם Dissection של "למבוגרים בלבד" עכבר שבלול. (א) לאחר שלב פרוטוקול 5.1.4, התור הבסיסי של השבלול מופרד מתור הפסגה / אמצע, אך עדיין מחובר לאזור שיווי המשקל. (ב) לאחר שלב פרוטוקול 5.3.3, תור האמצע מופרד מתור הפסגה. דוגמא (ג) לנתיחה הושלמה של תור זהב שבי רצועת ספירלה / הקיר לרוחב מוסר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2. תמונת Confocal Slice של התיכוןהפעל מבודד מP15 עכבר. ארבעה 20x תמונות הם כיסו לשחזר את כל תור האמצע. תאי שיער מסומנים עם אנטי-שרירן ארנב VIIa נוגדן ראשוני (1: 200 דילול) בשילוב עם נוגדנים חמורים נגד הארנב Alexa 488 מצומדות- משניים (1: 1,000 דילול) (מגנטה). תאי תמיכה מסומנים עם נוגדנים עזים נגד Sox2 עיקריים (1: 500 דילול) בשילוב עם אנטי-עז חמור נוגדן Alexa 568 מצומדות- המשני (1: 1,000 דילול) (ירוקה). Hoechst (כחול) תוויות כל הגרעינים. תמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 700 עם 405, 488, 555 ואורכי גל. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אופטי איור 3. חתך של התיכון הפעל מבודד מישן עכבר 6 שבועות. (א) תמונת פרוסת Confocal של כל הכנת ההר (למטה) וחתך אופטי במישור XZ (למעלה). (ב) מוגברות הגדלה של הפנל העליון ב (א), עם הכוונת הוסרה. תאי שיער מסומנים עם אנטי-שרירן ארנב VIIa נוגדן ראשוני (1: 200 דילול) בשילוב עם נוגדנים חמורים נגד הארנב Alexa 647 מצומדות- משניים (1: 1,000 דילול) (מגנטה). תאי תמיכה מסומנים עם נוגדנים עזים נגד Sox2 עיקריים (1: 500 דילול) בשילוב עם אנטי-עז חמור נוגדן Alexa 568 מצומדות- המשני (1: 1,000 דילול) (ירוקה). תמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופ confocal Zeiss LSM 700 עם 405, 555, 647 ואורכי גל. ברים סולם = 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
/files/ftp_upload/53561/53561fig4.jpg "/>
איור 4. דוגמאות לבעיות שיכולים להתרחש במהלך ההר השלם Dissection או כאשר ההרכבה שבלול מאירה בשקופיות. (א) בצד השמאל של התמונה, רקמת השבלול נחתך ליד השורה האחרונה של תאי שיער חיצוניים גורמת רב של תאים אלה להיות מותקנים בזוויות מגוונות. (ב) סעיף של האיבר של קורטי בצד השמאל של התמונה נותק. (ג) יש חור המנוקב באזור תא שיער החיצוני באמצע תמונה. (ד), האיבר של קורטי מקופל במספר מקומות. תמונות נלקחו מ4 - cochleae עכבר בן 8 שבוע. תאי שיער מסומנים עם אנטי-שרירן ארנב VIIa נוגדן ראשוני (1: 200 דילול) 488 מצומדות- נוגדנים משני Alexa שילוב עם נגד ארנב עז (1: 1,000 דילול) או נגד ארנב חמור Alexa 488 מצומדות נוגדנים משני (1: 1,000 דילול) (מגנטה). בcel שיער החיצוני CLS מסומנים עם נוגדנים עזים נגד פרסטין עיקריים (1: 200 דילול) בשילוב עם נוגדנים חמורים נגד הארנב Alexa 568 מצומדות- משניים (1: 1,000 דילול) (ירוקה). תמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ confocal SP5 לייקה עם 405, 488, 555 ואורכי גל nm. ברים סולם: בAB = 20 מיקרומטר; בCD = 40 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר צעדים קריטיים לנתיחה מוצלחת כל ההר וimmunostaining. עם זאת, לפני אחת מהשיטות הבאות מבוצעות, יש צורך בקיבוע הנכון של רקמת השבלול. אנו ממליצים על שימוש בכיתה ללא תשלום, אולטרה-טהורה, EM PFA מתנול. PFA עשוי אבקה יכולה להיות עקבות של מתנול ו- pH יציב אשר מקטין את האיכות של immunofluorescence. גם קבוצות אחרות הראו כי ניתוחים דומים הם fixatives באמצעות אפשרי שאינו מכיל פורמלדהיד 14-16. אורכו של הקיבעון הוא גם חשוב וספציפי נוגדן. נוגדנים מסוימים יכולים לסבול O / קיבעון N, בעוד שאחרים אינם פועלים היטב רק עם 1 שעות בPFA (אולם זה נדיר). קבוע מתחת לרקמה יכולה להיות בעייתית לשיטה לנתיחה כרקמה מתפרקת. מניסיוננו 3 - קיבעון שעות 4 מספק קיבוע נאות ואינו פוגע ברוב הנוגדנים עיקריים בשימוש נפוץ בתחום השמיעה.
jove_content "> זה גם אפשרי שEDTA יכול להפריע לנוגדנים ראשוניים;. כך כמה נוגדנים יעבדו גם ברקמות בילוד, אבל לא בP7 או רקמות מבוגרות שנטולה הסידן לאחר קיבוע, ניתן לאחסן עצמות זמניות לכמויות משתנות של זמן עד ש נבחן decalcification בהתאם לאנטיגנים. אנטיגנים מסוימים דורשים decalcification ונתיחה בתוך ימים עד שבועות לאחר קיבוע, ואילו אחרים עשויים להיות מאוחסנים במשך שנים (לפני או אחרי decalcification) ללא ירידה באיכות של immunostaining. אנו ממליצים דגימות אחסון כעצמות זמניות בשל הסיכון של אידוי של אמצעי האחסון (PBS) מצלחת 48-היטב והזיהום פוטנציאלי עם פטרייה או חיידקים. בדרך כלל אנו מבצעים את כל נתיחת ההר פחות משבוע אחד מראש לimmunostaining.ברגע שקבוע ונטול הסידן, כל נתיחת ההר מתבצעת עם העצם הטמפורלית השקוע בנוזל. הסרת עצם ורך עודפיםרקמה המקיפה את המבוך מוקדם בנתיחה תסייע בהסרת רצועת ספירלה / הקיר לרוחב בשלבים מאוחר יותר על ידי הקלת המניפולציה של הרקמות ומספק תצוגה פחות מעורפלת של מבנים קריטיים. בעת ביצוע כמה הצעדים הראשונים, ניתן להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את הרקמה באזור שיווי המשקל. אולם ברגע שהתור מבודדים, חשוב להימנע מהצבת מלקחיים על האיבר של קורטי או רצועה / קיר לרוחב ספירלה. במקום זאת, לשמור על המלקחיים סגורים ולהצמיד את סיבי עצב הגנגליון ספירלה לצלחת לנתיחה מצופה אלסטומר סיליקון. אל תחזיקו אזור זה כרקמה תקרע. באופן כללי, ברגע שהרקמה כבר מחולקת לשלושה סיבובים, אחיזה ותמרונים משיכת יכולים לגרום לתוצאות בלתי צפויות, שלעתים קרובות פוגעים באיבר של קורטי ויש להימנע. רקמה מבעלי חיים צעירים (P7-p21) נוטה להיות סלחני יותר מאשר רקמה מן החי מבוגר מP21. בנוסף, דגימות שבלול עם ד תא שיערamage קשה יותר לנתח. אם העכבר קיבל חשיפה לרעש הרקמה היא שבירה במיוחד. ללא קשר למצב של הרקמה, לנתיחה אנו מציגים היא תובענית מבחינה טכנית ודורשת ניסיונות תרגול רבים למיומנות.
במהלך immunostaining, חשוב שכל תור שבלול הוא שקוע בנוזל, לא צף על גבי או דבוק לצד השני של הבאר. זה מאפשר חדירה מלאה יותר של טריטון ונוגדנים לרקמה. בעת הסרת נוזל מכל טוב, זה קל לאבד את תור השבלול או לצייר אותו עד לקצה פיפטה. שינוי פתרונות עם קצה פיפטה 200 μl באמצעות היקף נתיחה יעזור למנוע את זה. לאט לחלץ את הנוזל ולהזיז את קצה פיפטה אם תור השבלול מקבל קרוב מדי. גם pipetteting פתרון פסולת לתוך צינור נקי יכולה להיות אסטרטגיה טובה כמו צינור פסולת זו ניתן לחפש אם תור נמשך בטעות לתוך פיפטה. אם התור תקוע בקצה פיפטה, לאהוא להטות ניתן לחתוך פתוח עם סכין גילוח, אבל לעתים קרובות האיבר של קורטי ייפגע אם זה מתרחש.
כאשר נוגדנים לimmunostaining ירי-צרות, ניתן להוסיף צעדים נוספים כגון שליפת אנטיגן או שיפור אות. יש pH הנמוך ואנטיגן pH הגבוה ריאגנטים הסרת מסכות שניתן לרכוש. אם נוגדנים לא עובדים בשיטה שתוארה כאן, שינוי הפרוטוקול הראשון לנסות הוא אחת משיטות אחזור אנטיגן אלה. לחלופין, להשתמש משפר אות. ישנם פתרונות זמינים מסחרית לשימוש ערכות הגברה לפני immunostaining, או tyramide שניתן להשתמש בי כדי להגביר את האות מהנוגדנים משני.
המשמעות של הטכניקה אנו מציגים היא היכולת לשמור על המבנה התל-ממדי של האיבר של קורטי ולדמיין את כל התאים בתוך האיבר. לכל האורך של השבלול מופרד לשלושה סיבובים בעוד טכניקות דומות אחרות, כלומר השיטות הדואר Bohne וליברמן, דורשות חלוקה ל5 - 10 חתיכות 6-8, הגדלת מספר הדגימות לתמרן בתהליכי immunostaining והדמיה. קיר נתיחת רוחב השבלול שפותחה על ידי קוסגרוב וגרטון דורשת רמה דומה של מיומנות ואפשרית ברקמה מבולבל, טרי, כמו גם ברקמות נטולות הסידן, אבל האיבר של קורטי הוא פשט משם ונהרס בתהליך של בידוד קיר לרוחב 17. קבוצה נוספת ביצעה ניתוחים דומים ברקמה מבולבל, טרי שבלול מחולדות בן שלושה בשבוע שבו רצועת ספירלה / הקיר לרוחב נתפס והפשיטו מהאיבר של קורטי, שעזבה את האיבר שלם. עם זאת זו הושגה רק בתורו 5 הפסגה. השיטה של קילוף רצועת ספירלה / הקיר לרוחב מהאיבר של קורטי היא שגרתית לנתיחה של רקמה קבועה בעכבר צעיר (<P7) 13. עם זאת, בניסיון שלנו עם עכברים מבוגרים מP6, לאחר הקיבועdecalcification ד, תמרון זה לעתים קרובות קורע את האיבר של קורטי באופנה לא אמינה. בנוסף ההליך המתואר כאן מאפשר בידוד של אמצע ובסיסי הופך גם כן.
Cryosections וחתכים מתקבלים לאחר הטבעת פרפין גם משמשים בדרך כלל בתחום השמיעתי. שיטות אלה מאפשרות הדמיה של מבנים אחרים כגון vascularis stria, הקרום של רייסנר, וקרום tectorial, עדיין כל קטע מאפשר הדמיה של אזור קטן של האיבר של קורטי בכל תור שבלול בלבד. כך לחקור אירועים המתרחשים בדפוס פסיפס, כגון אובדן תא או חלוקת תא, בשיטת חתך, 50 או יותר שקופיות צריכה להיות מוכתמות וצלמו כדי ללכוד את כל אורכו של השבלול. לעומת זאת, יש לו את כל פרוטוקול נתיחת הר היתרון של הכנת כל האיבר של קורטי בשלוש חתיכות. בנוסף ליתרון של שמירה על ארכיטקטורת האורך של האיבר של קורטי, TEC זהhnique מאפשר איסוף נתונים פשוטים ואחסון. מגבלה אחת של כל נתיחת ההר היא שזה הורס סביב מבנים כגון רצועת הספירלה, vascularis stria, הקרום של רייסנר, וקרום tectorial. מגבלה נוספת היא הקושי הטכני ומשך זמן לנתיחה יחידה. זה בעיקר בשל האופי השברירי של האיבר של קורטי והפרש קטן לשגיאה בעת הסרת רצועת ספירלה / הקיר לרוחב. שולט ברגע, כל נתיחת הר שבלול אחד יכולה להתבצע בכ 20 - 30 דקות.
בעוד הפרוטוקול לעיל מתאר שיטה לנתיחה הר שלמה לעכבר הבוגר, אנו מקווים ליישם את הטכניקה לאורגניזמים מודל אחרים המשמשים בתחום השמיעתי. המעבדה שלנו כיום שינוי בטכניקה זו לנתיחה של שבלול העכברוש. השבלול הגדול יותר של החולדה עטוף בקפסולה otic עבה שיותר בצפיפות מסוידת מאשר העכבר. כך העצם הטמפורלית יש דוארxcised עם מספריים גדולים. לפני הקיבעון וdecalcification עם EDTA, כמוסת otic יש לפתוח במספריים כדי לאפשר גישה טובה יותר לרקמת השבלול. גם תהליך decalcification הוא ארוך יותר ויכול לקחת עד 3 שבועות בהתאם לגיל של המדגם. לכל נתיחת ההר, בגודל של המבוך הגרמי משפיע על הטכניקה. הגודל המוגבר של שבלול העכברוש מספק מרחק מעט גדול יותר בין רצועת ספירלה / הקיר והאיבר של קורטי לרוחב, מתן מרווח גדול יותר של שגיאה לקיצוצים בודדים. עם זאת, בעוד שהרקמה הגדולה יותר עשויה לספק חומר נוסף להבנה למניפולציה של הדגימה, זה גם דורש מספר גדול יותר של קיצוצים כדי להסיר את כל אורכו של רצועת ספירלה / קיר לרוחב. אנו מאמינים כי שינויים דומים יכולים להתבצע לנתיחה של השבלול מצ'ינצ'ילה, הגרביל, ושפן ניסיונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
| 10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
| 2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
| 16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC --wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
| end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
| 60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
| Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
| stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
| Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
| 5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
| 48-well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
| 8-well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
| BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
| NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
| NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
| 3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
| Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
| Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
| Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
| coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
| clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
| cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
| plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |
References
- Robles, L., Ruggero, M. A.
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information processing. J Comp Physiol. 122, 65-85 (1977).
- Ou, H. C., Bohne, B. A., Harding, G. W. Noise damage in the C57BL/CBA mouse cochlea. Hear Res. 145 (1-2), 111-122 (2000).
- Engstrom, H., Ades, H. W., Andersson, A. Structural pattern of the organ of Corti. A systematic mapping of sensory cells and neural elements. , Almqvist and Wiksell. (1966).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse. J Vis Exp. (48), e2442 (2011).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hear Res. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Bohne, B. A., Harding, G. W., Ou, H. C. Handbook of Mouse Auditory Research. Willott, J. , CRC Press. 171-187 (2001).
- Eaton-Peabody Laboratories. Video Tutorial for Cochlear Dissection. , Massachusetts Eye and Ear. Available from: http://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/investigators/laboratories/eaton-peabody-laboratories/epl-histology-resources/video-tutorial-for-cochlear-dissection/ (2015).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (2), 781-785 (2008).
- Yu, Y., et al. In vivo proliferation of postmitotic cochlear supporting cells by acute ablation of the retinoblastoma protein in neonatal mice. J Neurosci. 30 (17), 5927-5936 (2010).
- Steigelman, K. A., et al. Polycystin-1 Is Required for Stereocilia Structure But Not for Mechanotransduction in Inner Ear Hair Cells. J Neurosci. 31 (34), 12241-12250 (2011).
- Liu, Z., et al. Age-dependent in vivo conversion of mouse cochlear pillar and Deiters' cells to immature hair cells by Atoh1 ectopic expression. J Neurosci. 32 (19), 6600-6610 (2012).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), e1685 (2010).
- Burns, J. C., On, D., Baker, W., Collado, M. S., Corwin, J. T. Over half the hair cells in the mouse utricle first appear after birth, with significant numbers originating from early postnatal mitotic production in peripheral and striolar growth zones. J Assoc Res Otolaryngol. 13 (5), 609-627 (2012).
- Collado, M. S., et al. The postnatal accumulation of junctional E-cadherin is inversely correlated with the capacity for supporting cells to convert directly into sensory hair cells in mammalian balance organs. J Neurosci. 31 (33), 11855-11866 (2011).
- Meyers, J. R., Corwin, J. T. Shape change controls supporting cell proliferation in lesioned mammalian balance epithelium. J Neurosci. 27 (16), 4313-4325 (2007).
- Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
