エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析計と組み合わせた社内構築のフロースルートリプシンマイクロリアクターによるタンパク質分解の迅速なプロトコルが提示されます。マイクロリアクターの作製、実験装置、データ取得プロセスについて説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
質量分析（MS）の大部分は、タンパク質分析方法は、典型的にはトリプシン、検出前に酵素消化工程を含むベース。この工程は、質量分析計測器の有効走査範囲内MW <3,000-4,000ダで一般に、低分子量ペプチドの生成のために必要です。従来のプロトコルは、37ºCでO / N酵素消化を伴います。最近の進歩は、典型的には、例えば 、マイクロ波または高固定化酵素または数分にタンパク質分解消化に必要な時間を短縮する相補的な物理的プロセス（の範囲のマイクロリアクターの使用を含む様々な戦略の開発につながっています圧力）。この研究では、タンパク質の迅速な酵素消化を達成するための任意の実験室で実施することができる簡単で費用効果的なアプローチを記載します。タンパク質（またはタンパク質の混合物）は、C18結合逆相高速PERFに吸着されていますキャピラリーカラムにプリロード液体クロマトグラフィー（HPLC）、シリカ粒子をormance、そして水性緩衝液中のトリプシンを短時間で粒子上に注入されます。オンラインのMS検出を有効にするには、トリプシンペプチドは、MSイオン源で直接増加有機含有量の溶媒系で溶出されています。このアプローチは、高価な固定化酵素粒子の使用を回避し、プロセスを完了するための任意の援助を必要としません。タンパク質消化および完全なサンプルの分析は、それぞれ、2〜3分と約30分未満で達成することができます。
概要
精製タンパク質の同定および特徴付けは、しばしばMS技術を使用することによって達成されます。タンパク質が酵素で消化され、そのペプチドは、さらに単純な注入実験を用いてMSによって分析します。タンパク質分解性消化は、ほとんどのMS分析器の有用な質量範囲に小さいペプチド断片を生成するために必要であり、それは容易に、アミノ酸配列情報を生成する低エネルギー衝突誘起解離を介して断片化することができます。単離されたタンパク質または単純なタンパク質混合物のために、MS検出の前に、ペプチドのクロマトグラフ分離のための更なる必要はありません。 25-50ペプチドの混合物は、容易にMSのイオン源に直接シリンジポンプを用いてサンプルを注入することによって分析することができます。
質量分析計は、分析を実行し、短い時間枠内でタンパク質の配列を確認することができます。現代のデータ取得方法と、この方法は、wを実現することができます数分あるいは秒をithin。短い時間スケールで全体のプロセスを完了するの制限要因は、タンパク質分解消化ステップです。 （50-100）の酵素比：一般的に、これは、基板を使用して、37ºCでは、溶液中で、数時間（またはO / N）を介して実行される1。分または秒に酵素消化時間を短縮するために、固定化酵素マイクロリアクタ、マイクロ流体リアクターまたは市販のカートリッジの形で記載されている。1-6一般的に、酵素は、共有結合、非共有結合的/物理吸着、錯体によって固定され....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
キャピラリーマイクロリアクターの調製
- 100μmの内径（ID）が360μmの外径（OD）7〜8センチメートルの長さに毛細血管、およびガラスキャピラリー包丁で3〜5センチメートル〜20μmでID×90ミクロンのODキャピラリーをxはカット。任意の突出バリなし、両方のキャピラリー端がきれい、ストレートカットを持って、顕微鏡下で確認してください。
- 〜6mmの長さのために、100μmのIDのx 360μmの外径キャピラリーの一端には20μmID×90ミクロンのODキャピラリを挿入します。必要な場合には、顕微鏡下でこの動作を観察します。
- Q-チップの先端と90μmのOD / 100μmのIDを毛細血管の接合の周りに接着剤E6000の小滴を適用し、室温で接着剤の硬化O / Nをしましょう。
- 10~15ミリの長さまで挿入さ20μmID×90ミクロンのODキャピラリーをカット。これは、エレクトロスプレーイオン化エミッタとなります。
- 1/32 "OD PEEK、1/16" OD PEEKと1/16 "OD PTFE浴槽カット済み長さ4-5センチの作品でる。これらは、漏れのない接続を提供するためのキャピラリー組合で使用袖になります。
- PEEK組合に100μmのIDのx 360μmの外径キャピラリーの反対側の端を接続します。漏れのない接続を提供するための1/32 "PEEKスリーブを使用します。
- 挿入/労働組合の....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
タンパク質分解性消化プロセスの代表的な結果は、上述したマイクロリアクター（ 図1または2）、 表1に提供されて、タンパク質の混合物を同時に行う。テーブルは、特定のタンパク質を同定する独特のペプチド配列を含み、クロス切れ残りの相関スコア（XCORR）（ すなわち 、対応するタンデム質量スペクトルの実験対理論上のマッチの品質を特徴付けるスコア）、数字、ペプチドの荷電状態（Z）、および質量/電荷（プロトン化ペプチドののm / z）。タンパク質レベルでは、テーブルは、UniProtのタンパク質ID、タンパク質、タンパク質スコアおよびタンパク質カバレッジの説明（名前）を提供します。タンパク質分解消化を90秒間行った後、全てのタンパク質は、多数のペプチドによって同定しました。
ために必要な時間全てのペプチドの溶出は、ナノESI最適な動作と互換性の流量300 NL / minで酸性.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
この研究に記載のマイクロリアクターは、簡単に実装する30分未満でMS分析と識別を可能にするために、タンパク質の酵素消化を実施するための実験を提供します。このシステムの明確な利点は、従来の手法と比較して、簡単、高速、低試薬消費と低コストが含まれます。特に、高価な固定化トリプシンビーズおよびカートリッジを必要としません。毛細管マイクロリアクターの製造は簡単な（ 図1A）であり、一般にクロマトグラフィー実験室で見られる標準供給、から数分以内に達成することができます。逆相C18粒子が吸着されたタンパク質またはペプチドを完全に除去するための高有機含量溶媒（CH 3 CNまたはCH 3 OH）でリンスすることができ、マイクロリアクターを再使用することができ、簡単かつ費用対効果の高い製造工程ながらシングルユースAPPLICための使い捨てユニットを製造するための招待状ations。毛細管マイクロリアクターは、 図1（b）に示すように 、自作ESI源に取り付けることができ、または標準的な市販のイオン源に挿入.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作業は、IMLへのNSF/DBI-1255991助成金によって支援されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| イオントラップ ESI-MS | サーモエレクトロン | LTQ | LTQ質量分析計は、タンデムMSデータの取得に使用されます |
| XYZステージ | ニューポート | 複数の部品 | 自作のXYZステージは、市販のLTQ nano-ESIソースを適応させて、さまざまなサンプル送達システムからの入力を受け入れるために使用されます |
| ステレオ顕微鏡 | エドモンド光学 | G81-278 | 顕微鏡は、マイクロリアクターのパッキングプロセスを観察するために使用されます |
| 分析天びん/メトラーVWR | 46600-204 | 天びんは、タンパク質サンプルの計量に使用されます | |
| 超音波浴/ブランソン | VWR | 33995-540 | ソニックバスは、サンプルの混合/均質化とC18粒子スラリー |
| シリンジポンプ22 | 552222 | マイクロポンプは、パックキャピラリーマイクロリ | |
| アクターMilli-Q超純水システム | EMDミリポア | ZD5311595 | MilliQ水システムは、精製された純水の調製に使用されます |
| ピペッター/エッペンドルフ (1,000 &マイクロ;l) | VWR | 53513-410 | ピペッターは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます |
| Pipettor/Eppendorf (100 &マイクロ;l) | VWR | 53513-406 | ピペッターは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます |
| Pipettor/Eppendorf (10 &マイクロ;l) | VWR | 53513-402 | ピペッターは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます |
| 溶融シリカキャピラリー(100 & マイクロ;m ID x 360 & マイクロ;m OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | この毛細管は、マイクロリアクター |
| 溶融シリカ毛細管(20 &マイクロ;m ID x 100 & マイクロ;m OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | このキャピラリーは、ESIエミッタ |
| ズドシリカキャピラリー(50 &マイクロ;m ID x 360 & マイクロ;m OD) | Polymicroの技術 | TSP050375 | この毛細管は、サンプルと溶離液をシリンジポンプから毛細管マイクロリアクターに移すために使用されます |
| ガラス毛細管クリーバー | Supelco | 23740-U | これは、溶融シリカ毛細血管を所望の長さで切断するためのツールです |
| 接着剤 | 折衷的な製品 | E6000クラフト | この接着剤は、ESIエミッターをキャピラリーマイクロリアクターまたはマイクロ流体チップに固定するために使用されます |
| エポキシ接着剤 | Epo-Tek | 353NDT | この接着剤は、C18粒子がロードされるマイクロ流体入口穴をシールするために使用されます |
| 逆相C18粒子(5 &マイクロ;m) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | これらは、タンパク質が吸着されるC18粒子であり、粒子は4 mm x 20 cm C18 LC カラム Agilent |
| シリンジ/ガラス製 (250 µl) | Hamilton | 81130-1725RN | ガラスシリンジは、C18粒子スラリーをキャピラリーマイクロリアクターに装填し、サンプルと溶離液をマイクロリアクターに送るために使用されます |
| 内部還元PEEKユニオン(1/16インチから1/32インチ) | Valco | ZRU1.5FPK | このユニオンは、250 & microを接続するために使用されます。l 5 & MICROを装填するためのマイクロリアクターへのシリンジ;m粒子スラリー |
| ステンレス鋼ユニオン(1/16インチ) | Valco | ZU1XC | ステンレス製ユニオンは、ガラスシリンジニードルを注入キャピラリー |
| マイクロボリュームPEEKティーコネクタ(1/32インチ | Valco | MT.5XCPK | ピークティーは、サンプル移送キャピラリーをキャピラリーマイクロリアクターに接続するために使用されます;そのサイドアームでは、Ptワイヤー |
| ティーコネクタ(軽量) | コ | C-NTXFPK | を介してマイクロ流体チップにESI電圧を印加するために使用されます |
| PtワイヤーはESI生成用の電気接続を提供し、質量分析計ESI電源 | |||
| PTFEチューブ(1/16インチ)に接続されていますOD) | Valco | TTF115-10FT | テフロンチューブは、シリンジ針とステンレス鋼ユニオンとの間の気密接続を可能にするために使用されます |
| PEEKチューブ(0.015インチID x 1/16インチOD) | Upchurch Scientific | 1565 | Peekチューブは、ステンレス鋼ユニオンと50 &マイクロ;m IDトランスファーキャピ |
| ラリーPEEKチューブ(0.015インチID x 1/32インチOD) | Valco | TPK.515-25 | ピークチューブは、溶融シリカキャピラリーとピークティー |
| カットポリマーチューブカッターValco | JR-797 | この | カッターは、1/16インチと1/32 'を事前にカットするために使用されます長さが4~5 cmの琥珀色のバイアル(2 ml)の小片で漏れのない接続のためのスリーブとして使用されるピークポリマーチューブ |
| Agilent | HP-5183-2069 | バイアルは、サンプル溶液とC18粒子スラリーの調製に使用されます | |
| 琥珀色のバイアル(4 ml) | VWR | 66011-948 | アルは、サンプル溶液の調製に使用されます |
| ポリプロピレンチューブ(15 ml) | フィ | ッシャー12-565-286D | バイアルは緩衝液を調製するために使用されます |
| シリンダー(100ml) | VWR | 24710-463 | シリンダーは溶剤の容量を測定するために使用されます |
| シリンダー(10ml) | VWR | 24710-441 | シリンダーは溶剤 |
| ピペットチップ(1,000 µl) | VWR | 83007-386 | ペットチップは、少量のサンプル溶液ピ |
| ペットチップ(100µl) | VWR | 53503-781 | ピペットチップは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます |
| ピペットチップ(10µl) | VWR | 53511-681 | ペットチップは、少量のサンプル溶液を測定するために使用されます |
| ガラス基板 | ナノフィルム | B270ホワイトクラウン、3 "x 3" | マイクロチップ製造用ガラス基板です |
| オスナットフィッティング(1/16インチ) | アップチャーチ | P203X | このフィッティングは、マイクロ流体チップへのトランスファーキャピラリーの接続に使用されます |
| ナノポートアセンブリ | アップチャーチ | N-122H | このフィッティングは、マイクロ流体チップへのトランスファーキャピラリーの接続に使用されます |
| タンパク質標準 | シグマ | マルチプル # | |
| アセトニトリル、HPLCグレード | フィ | ッシャーA955 | |
| メタノール、HPLCグレード | フィ | ッシャーA452 | |
| イソプロパノール、HPLCグレード | シグマ | 650447 | |
| トリフルオロ酢酸 | シグマ | 302031 | |
| 重炭酸アンモニウム | ドリッチ | A6141 | |
| トリプシン、シーケンシンググレード | プロメガ | V5111 |
参考文献
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
