Se presenta un protocolo rápido para la digestión proteolítica con un microrreactor tríptico de flujo continuo construido internamente acoplado a un espectrómetro de masas de ionización por electrospray (ESI). Se describe la fabricación del microrreactor, la configuración experimental y el proceso de adquisición de datos.
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Artículo de método
Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo
En este artículo
Resumen
Resumen
La gran mayoría de la espectrometría de masas (MS) a base de los métodos de análisis de proteínas implican una etapa de digestión enzimática antes de la detección, por lo general con tripsina. Este paso es necesario para la generación de péptidos de bajo peso molecular, generalmente con MW <3.000-4.000 Da, que caen dentro del rango de escaneado efectivo de la instrumentación de espectrometría de masas. protocolos convencionales implican la digestión enzimática O / N a 37 ºC. Los avances recientes han llevado al desarrollo de una variedad de estrategias, típicamente implica el uso de un microrreactor con enzimas inmovilizadas o de una serie de procesos físicos complementarios que reducen el tiempo necesario para la digestión proteolítica a unos pocos minutos (por ejemplo, de microondas o de alta presión). En este trabajo se describe un método sencillo y rentable que puede ser implementado en cualquier laboratorio para lograr la rápida digestión enzimática de una proteína. La proteína (o mezcla de proteínas) se adsorbe en alta perf de fase inversa C18-unidoormance partículas de sílice líquidos cromatografía (HPLC) precargados en una columna capilar, y tripsina en tampón acuoso se infunde a través de las partículas para un corto período de tiempo. Para habilitar la detección MS en línea, los péptidos trípticos se eluyen con un sistema disolvente con el aumento de contenido orgánico directamente en la fuente de MS de iones. Este enfoque evita el uso de partículas de alto precio enzima inmovilizada y no necesita ninguna ayuda para completar el proceso. La digestión de proteínas y análisis de la muestra completa se puede lograr en menos de 3 min y ~ ~ 30 min, respectivamente.
Introducción
La identificación y caracterización de las proteínas purificadas se consigue frecuentemente mediante el uso de técnicas de EM. La proteína se digiere con una enzima y sus péptidos se analizan además por MS mediante una sencilla configuración experimental de infusión. La digestión proteolítica es necesaria para la generación de pequeños fragmentos de péptidos que se encuentran en el rango de masa útil de la mayoría de los analizadores de MS, y que puede ser fácilmente fragmentado a través de baja energía de disociación inducida por colisión para generar información de la secuencia de aminoácidos. Para las proteínas aisladas o mezclas de proteínas simples, no hay más n....
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Protocolo
1. Preparación del capilar Microreactor
- Cortar el diámetro interior 100 mm (ID) x capilar 360 micras de diámetro exterior (OD) a una longitud de 7-8 cm, y el 20 micras ID x 90 micras OD capilar a 3-5 cm con la cuchilla de capilar de vidrio; verificar en el microscopio que ambos extremos capilares tienen un corte limpio y recto, sin las rebabas que sobresalen.
- Insertar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD en un extremo de la 100 micras ID x 360 micras capilar OD, para una longitud de ~ 6 mm; en caso de necesidad, observar esta operación bajo un microscopio.
- Aplique una pequeña gota de pegamento E6000 alrededor de la unión de los capila....
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Resultados
Un resultado representativo de un proceso de digestión proteolítica lleva a cabo de forma simultánea en una mezcla de proteínas, con los microrreactores descritos anteriormente (Figuras 1 o 2), se proporciona en la Tabla 1. La tabla comprende las secuencias de péptidos únicos que identifican una proteína particular, la cruz puntuación de correlación (Xcorr) (es decir, una puntuación que caracteriza la calidad del partido-experimental para teóric.......
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Discusión
El micro-reactor descrito en este trabajo proporciona una forma fácil de implementar montaje experimental para llevar a cabo la digestión enzimática de las proteínas para permitir el análisis de MS y la identificación en menos de 30 minutos. Las ventajas de este sistema, en comparación con los enfoques convencionales, incluyen la simplicidad, velocidad, bajo consumo de reactivo y bajos costos. En particular, no hay necesidad de perlas de tripsina inmovilizada caros y cartuchos. La preparación del microrreactor capilar e.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención NSF/DBI-1255991 al IML.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Trampa de iones ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | El espectrómetro de masas LTQ se utiliza para adquirir datos MS en tándem |
| Etapa XYZ | Newport | Múltiples partes | La platina XYZ de fabricación propia se utiliza para adaptar la fuente comercial LTQ nano-ESI para recibir información de varios sistemas de entrega de muestras |
| Microscopio estereoscópico | Edmund optics | G81-278 | El microscopio se utiliza para observar el proceso de empaquetamiento del microrreactor |
| Balanza analítica/Metler | VWR | 46600-204 | La balanza se utiliza para pesar las muestras de proteínas |
| Baño ultrasónico/Branson | VWR | 33995-540 | El baño sónico se utiliza para mezclar/homogeneizar las muestras y dispersar la bomba de jeringa de lodo de partículas C18 |
| 22 | Harvard Apparatus | 552222 | La microbomba se utiliza para cargar, enjuagar y eluir la muestra y la enzima en y desde el microrreactor capilar empaquetado |
| Sistema de agua ultrapura Milli-Q | EMD Millipore | ZD5311595 | El sistema de agua MilliQ se utiliza para preparar agua desionizada purificada |
| Pipettor/Eppendorf (1.000 y micro; l) | VWR | 53513-410 | La pipeta se utiliza para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra |
| Pipettor/Eppendorf (100 y micro; l) | VWR | 53513-406 | La pipeta se utiliza para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra |
| Pipettor/Eppendorf (10 y micro; l) | VWR | 53513-402 | La pipeta se utiliza para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra |
| Capilar de sílice fundida (100 µ m ID x 360 y micro; m OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | Este capilar se utiliza para la fabricación del microrreactor |
| Capilar de sílice fundida (20 y micro; m ID x 100 y micro; m OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | Este capilar se utiliza para la fabricación del emisor ESI |
| Capilar de sílice fundida (50 y micro; m ID x 360 y micro; m OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | Este capilar se utiliza para transferir las muestras y el eluyente de la bomba de jeringa al microrreactor |
| capilar Cuchilla capilar de vidrio | Supelco | 23740-U | Esta es una herramienta para cortar capilares de sílice fundida a la longitud deseada |
| Pegamento | Productos eclécticos | E6000 Craft | Este pegamento se utiliza para asegurar el emisor ESI en el microrreactor capilar o en el chip microfluídico |
| Pegamento epoxi | Epo-Tek | 353NDT | Este pegamento se utiliza para sellar el orificio de entrada microfluídico a través del cual se cargan las partículas C18 |
| Partículas C18 de fase reversa (5 y micro; m) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | Estas son partículas de C18 en las que se adsorben las proteínas; las partículas se extrajeron de un 4 mm x 20 cm Columna C18 LC de Agilent |
| Jeringa/vidrio (250 µ l) | Hamilton | 81130-1725RN | Las jeringas de vidrio se utilizan para cargar la suspensión de partículas C18 en el microrreactor capilar y para entregar la muestra y los eluyentes al microrreactor |
| Unión PEEK reductora interna (1/16" a 1/32") | Valco | ZRU1.5FPK | Esta unión se utiliza para conectar el 250 µ l jeringa al microrreactor para cargar el 5 µ m lodo de partículas |
| Unión de acero inoxidable (1/16") | Valco | ZU1XC | La unión de acero inoxidable se utiliza para conectar la aguja de la jeringa de vidrio al conector capilar |
| en T Microvolume PEEK de infusión (1/32") | Valco | MT.5XCPK | La T Peek se utiliza para conectar el capilar de transferencia de muestras al microrreactor capilar; en su brazo lateral, permite la inserción del cable Pt |
| Conector en T (peso ligero) | Valco | C-NTXFPK | Este conector en T se utiliza para aplicar voltaje ESI al chip microfluídico a través de la línea de transferencia de muestras |
| Alambre Pt (0,404 mm) | VWR | 66260-126 | El cable Pt proporciona la conexión eléctrica para la generación de ESI y está conectado al tubo de PTFE de la fuente de alimentación ESI del espectrómetro |
| de masas (1/16" OD) | Valco | TTF115-10FT | El tubo de teflón se utiliza para permitir una conexión hermética entre la aguja de la jeringa y la unión de acero inoxidable |
| Tubo de PEEK (0.015" ID x 1/16" OD) | Upchurch Scientific | 1565 | El tubo Peek se utiliza como manguito para permitir una conexión hermética entre la unión de acero inoxidable y el 50 y micro; Tubo de PEEK capilar de transferencia de diámetro interior m |
| (0,015" ID x 1/32" OD) | Valco | TPK.515-25 | El tubo Peek se utiliza como manguito para permitir una conexión sin fugas entre los capilares de sílice fundida y el Peek Tee |
| Cortador de tubos de polímero de corte limpio | Valco | JR-797 | Este cortador se utiliza para precortar los tubos de 1/16" y 1/32' Tubo de polímero Peek que se utiliza como manguito para conexiones sin fugas en piezas de ~4-5 cm de longitud |
| Frasco de ámbar (2 ml) | Agilent | HP-5183-2069 | Los viales se utilizan para preparar soluciones de muestra y la suspensión de partículas C18 |
| Frasco ámbar (4 ml) | VWR | 66011-948 | Los viales se utilizan para preparar soluciones de muestra |
| Tubo de polipropileno (15 ml) | Fisher | 12-565-286D | Los viales se utilizan para preparar soluciones tampón |
| Cilindro (100 ml) | VWR | 24710-463 | El cilindro se utiliza para medir volúmenes de disolvente |
| Cilindro (10 ml) | VWR | 24710-441 | El cilindro se utiliza para medir volúmenes de disolvente |
| Puntas de pipeta (1.000 y micro; l) | VWR | 83007-386 | Las puntas de pipeta se utilizan para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra |
| Puntas de pipeta (100 y micro; l) | VWR | 53503-781 | Las puntas de pipeta se utilizan para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra |
| Puntas de pipeta (10 y micro; l) | VWR | 53511-681 | Las puntas de pipeta se utilizan para medir pequeños volúmenes de soluciones de muestra |
| Sustratos de vidrio | Corona | blanca Nanofilm B270, 3" x 3" | Se trata de sustratos de vidrio para la fabricación de microchips |
| Racor de tuerca macho (1/16") | Upchurch | P203X | Este accesorio se utiliza para conectar capilares de transferencia al conjunto de nanopuertos del chip microfluídico |
| Upchurch | N-122H | Este accesorio se utiliza para conectar capilares de transferencia al chip microfluídico | |
| Patrones de proteínas | Sigma | Múltiple # | |
| Acetonitrilo, grado HPLC | Fisher | A955 | |
| Metanol, grado | HPLCFisher | A452 | |
| Isopropanol, grado de HPLC | Sigma | 650447 | |
| Ácido trifluoroacético | Sigma | 302031 | |
| Bicarbonato de amonio | Aldrich | A6141 | |
| Tripsina, grado de secuenciación | Promega | V5111 |
Referencias
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol.
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Reimpresiones y permisos
