本文所述方案介绍了两种基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的技术，用于快速研究配体-受体相互作用：第一种检测方法可用于测定配体与受体之间的解离常数；第二种检测方法则可实现对配体-受体相互作用阻断肽的快速筛选。
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本文内容
摘要
摘要
要全面理解信号通路，需要对配体-受体相互作用有深入的认识。本文介绍了两种快速且可靠的酶联免疫吸附测定（ELISA）逐点实验方案，用于研究配体-受体相互作用：直接配体-受体相互作用测定法（LRA）和竞争性LRA。以λ干扰素（IFNLs）与其受体α亚基（IL28RA）之间相互作用的ELISA分析为例进行说明：直接LRA用于测定受体与IFN配体之间的解离常数（KD值），竞争性LRA则用于测定一种寡肽的抑制能力，该寡肽被设计用于在IFNLs的受体结合位点处与其竞争结合。文中详细描述了估算KD值和半数最大抑制浓度（IC50）值的分析步骤。最后，讨论部分重点阐述了所介绍方法的优缺点，以及这些结果如何促进对配体-受体相互作用的分子机制的深入理解。
引言
要全面理解信号通路，需要深入了解配体-受体相互作用。目前大多数评估特定配体与其受体相互作用的方法均成本高昂、耗时较长、劳动强度大，且需要专门的仪器设备和技术专长1。
本文介绍了两种基于酶联免疫吸附测定法（ELISA）的快速、可靠的逐点检测方案，用于研究配体-受体相互作用：直接配体-受体相互作用检测法（LRA）和竞争性LRA。ELISA是一种高度灵敏、特异且易于获取的技术，几乎在每个实验室中常规使用。ELISA可根据需要以多种方式进行实施和调整。本文所述方案已针对不同λ型干扰素（INFLs）与其受体之间的相互作用研究进行了优化。
直接LRA能够根据配体浓度对配体-受体结合进行定量，从而得到结合曲线。通过使用适当的配体-受体相互作用模型，可进一步分析数据以估算解离常数（KD）。
在本方案中，采用常用的Hill方程对配体-受体结合进行建模。尽管其他方法（如表面等离子共振技术2,3）可用于测定两种蛋白质之间的结合亲和力，但该技术通常耗时耗力、成本高昂，且需要特殊的实验设备。
竞争性配体-受体结合分析（LRA）可用于筛选抑制性肽：通过测定不同肽浓度下的配体-受体结合量，获得描述肽抑制效应的剂量-反应曲线。进一步分析数据可估算阻断肽的半数最大抑制浓度（IC<....
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方案
1. 试剂配制
- 配制碳酸盐包被缓冲液：将 0.36 g Na2CO3 和 0.84 g NaHCO3 溶解于 100 ml 蒸馏水中；使用真空驱动的 0.22 µm 聚醚砜（PES）膜滤器对缓冲液进行无菌过滤，并在室温下保存备用。
- 通过在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入 0.05% v/v Tween 20 配制洗涤液。
- 在 PBS 溶液中配制 5% 牛血清白蛋白（BSA）（封闭液），方法是将 5 g BSA（≥98%）溶解于 100 ml PBS 中，并在 4 °C 下保存。
- 重组受体、配体及阻断肽
- 根据生产商说明书，重悬重组人白细胞介素受体α亚基（IL28RA）以及带 His 标签的重组人干扰素配体（IFNL1-3），并在 -80°C 下保存。合成阻断肽，并按先前所述方法使用4。使用 PBS 配制不同浓度的配体和肽，用于后续检测。
- 配制一抗：将 6x His 小鼠单克隆抗体用含 0.1% BSA 的 PBS 按 1:1,000 稀释。配制二抗：将辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）用含 0.1% BSA 的 PBS 按 1:10,000 稀释。
- 根据生产商说明书，将 TMB 试剂 A 和试剂 B 混合配制 TMB 溶液。
- 通过将 ....
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结果
通过直接配体结合分析法（LRA）测定了INFL1-3与其受体α亚基IL28RA之间的解离常数。结果如图3所示：结合位点的占有率随相应干扰素（IFN）浓度的对数值变化而变化。数据的Scatchard图显示在右下角。结果表明，直接LRA可获得一条结合曲线，该曲线可进一步分析以估算KD值。KD值通过将数据拟合至Hill方程（公式1）而确定。
IFNL1 的结合亲和力最高，其次是 IFNL2 和 IFNL3。Hill 系数 n >1 表明，在初始配体-受体相互作用之后，对后续配体的亲和力增强（见讨论部分）。估计的解离常数和 Hill 系数总结于表 1中。
采用竞争性LRA定量分析阻断肽对IFNL1-3与IL28RA相互作用的.......
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讨论
ELISA 是许多实验室常用的标准且成熟的方法。我们对先前发表的方法5,7进行了进一步的改进和优化。本演示的逐步操作方案展示了如何以简便的方式测定配体-受体相互作用的KD值。此外，还可测定干扰配体-受体相互作用的阻断肽的IC50值。
主要优势包括操作快速、试剂制备简便以及操作方式熟悉，因为大多数研究人员此前都使用过ELISA方案。直接LRA方案具有高度灵活性，可适用于检测多种蛋白质-蛋白质相互作用。应使用带有His6标签或其他标签的重组蛋白作为与固定化配体结合的结合伴侣。竞争性LRA可用作筛选工具，用于（i）确定阻断性化合物（如多肽、抗体或小分子）的抑制潜力，以及（ii）通过使用模拟受体或配体的阻断性多肽，确定关键的相互作用位点。
阴性对照对于正确解读所展示的实验至关重要。在之前的一项筛选研究4中，所用阻断肽的随机序列未显示出拮抗作用。然而，其他一些肽段在随机化后仍表现出阻断能力，这可能是由于非特异性的静电相互作用所致。
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披露
A.E. 获得了“SNSF Ambizione Score”项目（PZ00P3_154709）、巴塞尔大学“Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte”、巴塞尔传染病基金会以及Bangeter Rhyner基金会的研究资助。J.L. 感谢SystemsX.ch系统生物学项目（9）提供的iPhD奖学金支持。th 呼叫
致谢
我们感谢瑞士苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系及瑞士生物信息学研究所（瑞士巴塞尔）的 J. Stelling 教授对本文稿的审阅。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA 板 |
| 碳酸钠 (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | 用于 ELISA 板包被缓冲液 |
| 碳酸氢钠(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | 用于 ELISA 板包被缓冲液 |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Sigma | A7030-100G | 用于封闭的 PBS 中 5% BSA |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | 重组人白细胞介素-28 受体 α |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | 重组人白细胞介素-29/无载体蛋白/C端10-His标签 |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | 重组人白细胞介素-28A/无载体蛋白/C端6-His标签 |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | 重组人白细胞介素-28B/无载体蛋白/C端6-His标签 |
| 6x His 单克隆抗体（小鼠） | Clontech | 631212 | 用于捕获带 His 标签配体的一抗 |
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | 辣根过氧化物酶标记的二抗 |
| BDoptEIA TMB 试剂盒 | BD Biosciences | 555214 | ELISA - TMB 底物溶液 |
| 硫酸 (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4（酶反应终止液） |
| Synergy/H1 - 微孔板读数仪 | BioTeK | ELISA 板读数仪 |
参考文献
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al.
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重印与许可
