我々は、分子機械のその場構造で高解像度を決定するために、ハイスループット低温電子断層撮影法を利用する方法のプロトコルを提示します。プロトコルは、処理すべき大量のデータを可能にし、一般的なボトルネックを回避し、ユーザは、重要な生物学的問題に集中することができ、リソースのダウンタイムを減少させます。
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この記事について
サマリー
要約
クライオ電子線トモグラフィー(Cryo-ET)は、高分子複合体を分子レベルでの本来の状況で視覚化するための強力な3次元(3D)イメージング技術です。この手法では、まず試料をガラス質の氷で急速に凍結して試料を本来の状態に保ち、次にさまざまな角度から高倍率で一連の顕微鏡写真を収集し、最後に3D密度マップを計算で再構築します。凍結水和した試料は電子ビームに非常に敏感であるため、放射線損傷を制限するために、非常に低い電子線量で顕微鏡写真が収集されます。その結果、生のクライオ断層撮影は、本質的にノイズの多い画像を特徴とする非常に低い信号対雑音比を示します。関心のある被写体をよりよく視覚化するために、従来の画像解析と、被験者のサブトモグラムを初期トモグラムから抽出し、位置合わせして平均化するサブトモグラム平均化を利用して、コントラストと解像度の両方を改善します。傾斜系列の大規模なデータセットは、さまざまな状態、条件、または突然変異の複合体を理解して解決し、平均化と分類に十分な大きさのサブトモグラムのコレクションを得るために不可欠です。このデータの収集と処理は、さらなる分析を妨げる大きな障害になる可能性があります。ここでは、コンピュータ制御の300kVクライオ電子顕微鏡、直接検出装置(DDD)カメラ、および自社開発の高効率な半自動画像処理パイプラインソフトウェアラッパーライブラリtomoautoをベースにしたハイスループットクライオETプロトコルについて紹介します。このプロトコールは、赤痢菌ミニセルにおける無傷のIII型分泌システム(T3SS)を可視化するために効果的に利用されています。クライオETに適したあらゆるプロジェクトに適用できます。
概要
III型分泌系（T3SS）多くのグラム陰性病原体に不可欠な病原性決定因子です。また、針複合体として知られているinjectisomeは、真核生物の宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の直接転座1、2に必要な中央T3SS機である。injectisomeが外針、基礎体温、また既知の細胞質複合体を含みますソート複雑な3など。以前の研究では、主要な基礎体タンパク質4、5の原子構造とともに、 サルモネラ菌や赤痢菌から精製injectisomesの3次元構造を解明した。 サルモネラ 、 赤痢菌 、およびエルシニアからinjectisomesのその場構造の最近の -ETクライオ6によって明らかにされました7。しかし、エフェクターの選択と針アセンブリのための本質的な細胞質複合体は、それらの構造において可視化されていません。
クライオETはモスです（ その場で ）その本来の細胞のコンテキスト内でナノメートルの分解能で分子機構を画像化するための適切な技術をtは。それにもかかわらず、クライオETによって達成可能な解像度は、試験片の厚さによって制限されます。欠点を克服するために、我々は遺伝的に凍結ETのために十分に薄いミニ細胞を産生するように改変された病原性
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プロトコル
1.ミニ細胞の準備
- S.を作成するにはフレクスナーミニ細胞は、構成的にスペクチノマイシン耐性プラスミド5μlのエレクトロストレプトマイシン耐性血清型5aの（M90T-SM）、エレクトロポレーションによって細胞に低コピーから大腸菌細胞分裂遺伝子ftsQ、ftsA、とのFtsZを発現するプラスミドpBS58、1μlのを変換します1ミリメートルのキュベット中で5ミリ秒のために2.5 kVの時。
- 1.5ミリリットル極低温マイクロチューブ中で15％グリセロール中で-80℃で保存するミニ細胞のサンプル。スペクチノマイシンとするとき使用するための準備ができて、ピペットチップを使用して解凍していないマイクロチューブからの細胞の約5μLをこすりし、4ミリリットル中に細胞を懸濁トリプシン大豆ブロスを、100μg/ mlの濃度に加えました。 37℃でO / Nを成長させます。
- ピペット再び100μg/ mlの濃度になるように追加されたスペクチノマイシンと1.2 200ミリリットルにトリプシン大豆ブロスからの培養の2ミリリットル。後期対数期に37℃で成長します。
- ミニセル、遠心分離機を豊かにします5分1,000×gで1.3からの培養の200ミリリットル。慎重に10分間20,000×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に上清画分を注ぎます。慎重にオフ注ぎ、上清画分を廃棄し、静かにピペットチップを使用して残りの液....
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結果
ミニ細胞Sのサンプルフレクスナーを回収し、 図2に詳述され、パイプラインを使用して、次のtomoauto概略図を図1に示したように処理しました。 傾斜シリーズは、低倍率のモンタージュマップ上でユーザにより指定されたポイントでの高スループット傾斜シリーズ取得を可能SerialEM 10（ 図3）を用いて収集しました。顕微鏡写真は、ビーム誘起運動22（ 図4）を低減するために直接検出素子カメラに対する用量分画モードを使用して収集しました。 TomoautoはMOTIONCORR 22、さらに（動画1）を処理することがチルトシリーズに結果を組み立てて、それぞれの処理用量分画した顕微鏡写真のコレクションを取って動き補正を調整します。
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ディスカッション
ここで説明するハイスループット法は、1917クライオチルトシリーズを処理し、そのままSの 4,500を超えるサブ断層像を生成することができましたフレクスナー injectisome 19は、収集されたデータは、複雑なソート細胞質を含め、 その場 injectisome での詳細な特性評価につながりました。この方法はまた、injectisomeの選別プラットフォームの組成を解明する助け推定上のタンパク質成分の特定の欠失を有するいくつかの変異体細胞を可視化するために利用されました。我々の方法はinjectisomeの構造 - 機能関係を研究するための新しい手段を提供しました。その結果、新たなステージをT3SS媒介分泌および病原性のメカニズムのさらなる解剖のために設定しました。
ここで紹介するプロトコルは、完全なSの高スループットクライオ-ETを説明フレクスナー、しかし凍結ETに適した任意のプロジェクトに適用可能です。この方法は、struct.......
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開示事項
著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。
謝辞
私たちはコメント博士ウィリアム・マーゴリンに感謝します。私たちは、博士からSerialEMのサポートに感謝しています。デビッドMastronardeとチェン徐。 DM、BHとJLは、ウェルチ財団から国立アレルギー感染症研究所、総合医科学研究所（NIGMS）から補助金R01GM110243とR01GM107629、グラントAU-1714からの助成金R01AI087946によってサポートされていました。直接電子検出器は、健康賞S10OD016279の国立研究所によって資金を供給されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| グリセロール | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| チロプチン酸醤油 | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| スペクチノマイシン | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| エレクトロポレーション装置 | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 ml Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 ml 微量遠心分離機 チューブ | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) | Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | 自社製グロー放電装置に使用 |
| 高周波発生器 | 電機 | BD-10A | 注意: このデバイスは高電圧を生成します。 |
| 遠心分離 | |||
| 機鉗子 | Dumont (Electron Microscopy Sciences) | 72705-D | スタイル 5 反磁性 |
| コリオダル金 | Aurion | BSA 10nm | |
| 濾紙 | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| 窒素 | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| プランジャー装置 | 社内 | 商用 代替 | |
| 利用可能な 極低温グリッド 収納ボックス | 電子顕微鏡 科学 | 71166-30 | |
| 透過型 電子顕微鏡 | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) | |
| 直接検出装置カメラ | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 代替品UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | が必要IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD 代替ソフト:XMIPP、Protomo | |
| 自動基準マーカーモデリングソフト | IMOD | の代替品:RAPTOR (IMOD0 に付属(tomoautoで使用可能) | |
| CTF判定ソフト | IMOD | の代替品:CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (tomoautoで使用可能) | |
| チルトシリーズ再構成ソフトウェア | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 代替ソフト:IMOD、XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es、Protomo | |
| チルトシリーズ自動処理ソフト | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| パーティクルピッキングソフト | i3 | http://www.electrontomography.org 代替品:IMOD | |
| サブボリューム平均化ソフトウェア | i3 | の代替品: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET、Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch、PyTom http://pytom.org |
参考文献
- Cornelis, G. R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4 (11), 811-825 (2006).
- Galan, J. E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444 (7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al.
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