Met behulp van Tomoauto: Een protocol voor High-throughput Automated Cryo-electron tomography

Summary

We presenteren een protocol over hoe om high-throughput cryo-electron tomography gebruiken om hoge resolutie in situ structuren van moleculaire machines te bepalen. Het protocol maakt grote hoeveelheden gegevens te verwerken, vermijdt gemeenschappelijke resource bottlenecks en vermindert stilstand, zodat de gebruiker zich concentreren op belangrijke biologische vragen.

Abstract

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

Introduction

Type III secretie systeem (T3SS) zijn essentiële virulentie determinanten voor vele Gram-negatieve pathogenen. De injectisome, ook bekend als de naald complex, is de centrale T3SS machine vereist voor directe translocatie van effector eiwitten van de bacterie in eukaryote gastheercellen ^{1, 2.} De injectisome omvat een extracellulair naald, een basale lichaamstemperatuur, en een cytoplasmatisch complex ook bekende als sorteren complex ^3. Eerdere studies hebben opgehelderd 3-D structuur van gezuiverd injectisomes van Salmonella en Shigella, evenals de atomaire structuur van grote basale lichaamseiwitten ^{4, 5.} Recente

Protocol

1. Minicel Voorbereiding

1. S. maken flexneri minicellen, transformeren 1 pl plasmide pBS58, die constitutief uitdrukt Escherichia coli celdeling genen FtsQ, ftsA en ftsZ van een low-copy spectinomycine-resistente plasmide in 5 ul elektrocompetente streptomycine resistente serotype 5a (M90T-Sm) cellen door elektroporatie op 2,5 kV voor 5 msec bij 1 mm cuvettes.
2. WINKEL minicel monsters bij -80 ° C in 15% glycerol in 1,5 ml microbuisjes cryogeen. Wanneer klaar voor gebruik, schraap ongeveer 5 ul van cellen uit het ontdooid microbuisjes met een pipet tip en schorten de cellen in 4 ml tryptische soja bouillon....

Results

Monsters van minicellen S. flexneri werden ingezameld en verwerkt zoals getoond in de schematische figuur 1 via tomoauto na de pijpleiding gedetailleerd in figuur 2. Tilt-serie werden verzameld met behulp SerialEM ^10, die zorgt voor high-throughput-tilt series verwerving punten door de gebruiker aangewezen lage vergroting montage maps (figuur 3). Microfoto's werden verzameld met behulp van dosis.......

Discussion

De high-throughput hier beschreven methode ons in staat om 1917 cryo tilt-serie te verwerken en produceren meer dan 4.500 sub-tomogram van de intacte S. flexneri injectisome ^19. De verzamelde gegevens tot de gedetailleerde karakterisatie van in situ injectisome, waaronder het cytoplasmatische sorteren complex. De werkwijze werd eveneens toegepast om verschillende mutantcellen visualiseren specifieke deletie van vermoedelijke eiwitcomponenten, die hielp verhelderen de samens.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Tyrptic Soy Broth	Sigma-Aldrich	22092
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S0692
Electroporation Apparatus	Bio-rad	165-2100
1 mm Cuvette	BTX	45-0124
1.5 ml Cryogenic Tube	Thermoscientific	5000-1020
1.5 ml Microcentrifuge Tube	Sigma-Aldrich	Z336769
Holey Carbon Grids	Quantifoil (Electron Microscopy Sciences)	Q2100CR2	R2/2 200 Cu
Glow Discharge Device	In-House		Commercial Alternative Available
Vacuum Desiccator	Sigma-Aldrich	Z119016	Used in In-House Glow Discharge Device
High-Frequency Generator	Electro-Technic Products	BD-10A	Used in In-House Glow Discharge Device.  CAUTION: This device generates high voltages.
Centrifuge
Forceps	Dumont (Electron Microscopy Sciences)	72705-D	Style 5 Anti-magnetic
Colliodal Gold	Aurion		BSA 10nm
Filter Paper	Whatman		#2
Ethane	Matheson Tri-Gas	UN1035
Nitrogen	Matheson Tri-Gas	UN1977
Plunger Device	In-House		Commercial Alternative Available
Cryogenic Grid Storage Box	Electron Microscopy Sciences	71166-30
Transmission Electron Microscope	FEI		Tecnai Polara F30 (300 KeV)
Direct Detection Device Camera	Gatan		K2 Summit
Tomogram Acquisiton Software	SerialEM		http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography
Beam-induced Motion Correction Software	MOTIONCORR		http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU
Tilt-Series Alignment Software	IMOD		http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo
Automatic Fiducial Marker Modelling Software	IMOD		Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto)
CTF Determination Software	IMOD		Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto)
Tilt-Series Reconstruction Software	tomo3d		https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo
Tilt-Series Automated Processing Software	tomoauto		https://github.com/DustinMorado/tomoauto
Particle Picking Software	i3		http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD
Subvolume Averaging Software	i3		Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org