Summary
Qui forniamo un metodo riproducibile per esaminare neurogenesi adulta usando un test neurosfere derivato dal cervello intero o sia dal telencefalica, tectal o nelle regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto. Inoltre, si descrive la procedura per manipolare l'espressione genica in neurosfere zebrafish.
Introduction
Le cellule staminali neurali (NSC) di mammiferi sono stati caratterizzati in vitro per la loro capacità di crescere in colture libero di fluttuare come gruppi di cellule in divisione neurosfere 1 chiamati. In presenza di fattore di crescita epidermico (EGF) e del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), NSC dividono sia simmetricamente per generare NSCs auto-rinnovamento, o asimmetrico per generare due differenti cellule figlie, vale a dire., Una differenziazione delle cellule progenitrici e un romanzo NSC. Culture neurosfere sono quindi una miscela di cellule staminali / progenitrici neurali e cellule neurali più differenziati 2-4 NSC possono, tuttavia, essere distinti da altri tipi di cellule neurosfere da due proprietà specifiche:. Visualizzano a lungo termine di auto-rinnovamento free- culture galleggiante e possono differenziarsi in tutte le linee cellulari neuronali (ad esempio, neuroni, astrociti, oligodendrociti e) dopo il ritiro di fattori di crescita e di adesione a substrati della matrice extracellulare. in Mammals, il sistema di coltura neurosfere è stato il primo sistema in vitro utilizzato per dimostrare la presenza di cellule staminali neurali nel cervello adulto e rimane lo strumento più comunemente usato per analizzare la proliferazione, la capacità di auto-rinnovamento e multipotenza delle cellule staminali e progenitrici neurali. Pertanto, anche se saggi sfera formante soffrono di alcuni inconvenienti e limitazioni 4, questo sistema di coltura è utile per valutare il potenziale di una cella a comportarsi come una cellula staminale quando viene rimosso dalla sua nicchia in vivo 4 ed è stato determinante nell'identificare regolatori chiave di NSC auto-rinnovamento e il destino delle cellule determinazione 5-7.
A differenza di mammiferi che hanno limitato neurogenesi adulta, zebrafish costitutivamente produrre nuovi neuroni lungo l'asse del cervello intero per tutta la loro vita. Il cervello zebrafish adulti visualizza più nicchie neurogena ospitare staminali neurali / cellule progenitrici rendendo zebrafish un potente organismo modello per la comprensione tegli staminali attività delle cellule del cervello e dei programmi molecolari necessari per la rigenerazione del sistema nervoso centrale. Nel corso degli ultimi 17 anni, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodologie per l'isolamento e la coltura di cellule neurali zebrafish 8,9. Questi studi avevano lo scopo di produrre neuroni embrionali e le cellule gliali in vitro, ma non a mantenere le cellule staminali neurali e lo studio delle loro proprietà. Anche se neurosfere sono stati generati nell'adulto apteronotus Leptorhynchus (Brown fantasma Knifefish) 10, un saggio neurosfere di formazione nel zebrafish è rimasto da stabilire.
Qui si descrive un saggio neurosfere di formazione per dimostrare il ruolo di miR-107 durante la neurogenesi zebrafish 11. Il protocollo consente: 1) la raccolta di cellule staminali / progenitrici neurali adulte sia da zebrafish intero cervello o provenienti da diverse regioni del cervello sezionati come il telencefalo, il tectum, e il cervelletto; 2) la generazione di flottante e neurosfere di auto-rinnovamento da cellule staminali / progenitrici neurali adulte; 3) il down e up-regolazione dell'espressione dei geni codificanti o piccoli RNA non codificanti 11 in neurosfere, al fine di indagare il loro ruolo nella proliferazione e differenziazione delle cellule staminali / progenitrici neurali.
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Protocol
Zebrafish del ceppo WT CF sono state sollevate e mantenuto secondo protocolli approvati dal Comitato Yale University Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC numero di protocollo 2.012-11.473). Tutti gli esperimenti devono essere prima approvati da ogni etica governativi e istituzionali applicabili in materia organi per quanto riguarda l'uso di animali per scopi di ricerca.
1. preparati
- Preparare 10 ml di terreno dissezione, aggiungere 200 ml di 100x penicillina-streptomicina in 9,8 ml di DMEM / F12.
- Preparare la soluzione L-cisteina: a 10 ml di acqua per colture di tessuti, aggiungere 120 mg di L-cisteina. Conservare la soluzione L-cisteina a 4 ° C per 2 settimane, o in aliquote a -20 ° C fino a 1 anno.
- Preparare DNasi soluzione: 1 ml di acqua per colture di tessuti, aggiungere 10 mg di DNasi I. Conservare la soluzione che DNasi a 4 ° C per un massimo di 2 mesi.
- Preparare la soluzione papaina: per preparare papaina solution, aggiungere 100 microlitri papaina (circa 140 unità), 100 microlitri DNasi I (1%) e 200 microlitri L-cisteina (12 mg / ml) in 5 ml di DMEM / F12. Appena preparare la soluzione papaina ogni volta e sterilizzare con un filtro con pori di 0,22 micron prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di lavaggio: preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 650 ml di glucosio al 45%, 500 microlitri HEPES 1 M e 5 ml FBS in 93.85 ml DPBS 1x. Sterilizzare la soluzione di lavaggio con un filtro con pori di 0,22 micron prima dell'uso. Conservare la soluzione di lavaggio a 4 ° C per 2 mesi.
- Preparare la soluzione di insulina: per preparare 2 ml di soluzione di insulina, aggiungere una goccia 25 ml di NaOH 10 N e 100 mg di insulina in 2 ml di acqua per coltura di tessuti.
- Preparare soluzioni EGF e FGF: sciogliere due mitogeni in DMEM / F12 a 100 mg di concentrazione / ml. Store come 10 aliquote microlitri a -20 ° C.
- Preparare supporti B-27 e N-2: negozio B-27 e N-2 integratori a -20 ° C in 500 microlitri e 1 ml aliquote, respectively.
- Preparare Z-differenziazione condizioni medie: per preparare 100 ml di Z-differenziazione condizioni medie, aggiungere 40 ml di insulina (50 mg / ml), 500 microlitri B-27, 1 ml N-2, 650 microlitri di glucosio 45% e 1 ml di 100 x penicillina-streptomicina in 97.81 ml di DMEM / F12. Sterilizzare medio condizione di Z-differenziazione con un filtro con pori di 0,22 micron prima dell'uso. Conservare il supporto di condizione di Z-differenziazione a 4 ° C per un massimo di 1 settimana.
- Preparare Z-condizioni medie: per preparare 50 ml di Z-condizione media, aggiungere 10 ml di EGF e 10 ml di FGF in 50 ml di sterile condizione di Z-differenziazione di media (20 ng / ml). Conservare il supporto di Z-condizione a 4 ° C per un massimo di 1 settimana.
- Preparare la soluzione di rivestimento per cultura differenziazione: per 5 ml di soluzione di rivestimento extracellulare, aggiungere 100 microlitri della soluzione di matrice extracellulare in 4,9 ml di DMEM / F12 (ad esempio, Matrigel.). Scongelare soluzione matrice extracellulare a 4 ° C su ghiaccio. Una volta scongelato, mantenere a 4 ° C per up per 2 settimane.
2. La dissezione del cervello adulto Zebrafish
- Preparare una dissezione letto riempiendo da 100 mm x 15 mm piastra di Petri con confezioni di gel di ghiaccio. Poi posto il coperchio sulla capsula di Petri e incubare a -20 ° C fino congela gel. In cima al posto coperchio un quadrato di carta filtro pulito e avvolgere sia il filtro con capsula di Petri con film plastico.
- Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti di microdissezione del 70% di etanolo o di calore prima di ogni utilizzo. Mettere tutti gli strumenti di dissezione sterilizzati vicino al microscopio da dissezione e, appena prima l'eutanasia, posizionare il letto dissezione al microscopio con illuminazione a fibre ottiche.
- Raccogliere 2 zebrafish adulto per tutta la preparazione neurosfere cervello; e da 3 a 4 zebrafish per generare neurosfere da regioni del cervello sezionati.
- Euthanize zebrafish adulti (8-12 mesi) utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali. Avanti, immergere il pesce in 75% di etanolo per 5-10 secondi e rapidamente pongono nel letto dissezione seguita da decapitazione a livello delle branchie con una lama chirurgica.
- Per l'eutanasia degli animali, somministrare una dose eccessiva (300 mg / L) di tricaine metanosolfonato fino battito cardiaco dell'animale rallenta gradualmente e la circolazione si ferma, poi immergere in acqua ghiacciata.
- Ruotare lato testa dorsali giù, e utilizzando le forbici un taglio longitudinale dal lato tagliato alla bocca. Utilizzando la pinza esporre la base del cranio e rimuovere tutto il tessuto adiacente. Tagliare le pareti laterali del cranio dall'inizio del midollo spinale verso il tectum.
- Utilizzando le forbici, tagliare e rimuovere i nervi ottici e quindi rimuovere entrambi i lati della parte più laterale del cranio a livello della tectum. Girare la testa ventrale verso l'alto. Utilizzando pinze, staccare il resto della parte apicale del cranio.
- Trasferire il cervello insieme alla parte rimanente del cranio in un nuovo piatto with medio dissezione (1.1). Pulire il tessuto cerebrale nel medio dissezione con manico in plastica micro del coltello, mantenendo intatte tutte le strutture del cervello.
- Da questo punto, continuare il protocollo utilizzando l'intero cervello zebrafish.
- In alternativa adattare questo protocollo a regioni specifiche del cervello per generare neurosfere da tutto il cervello zebrafish o dal telencefalo, tectum / diencefalo o cervelletto sezionato con un bisturi fresca. Utilizzare una fluorescente zebrafish linea transgenica neurale specifica neurale per sezionare la regione del cervello di interesse secondo la figura 3 e riferimento 11.
3. cellulare dissociazione unico del cervello adulto
- Eseguire tutti i successivi lavori in un armadio di sicurezza biologica. Trasferire il tessuto cerebrale in una provetta da 1,5 ml contenente 800 ml di media dissezione (preparata al punto 1.1). Rimuovere il mezzo di dissezione pipettando, senza toccare il tessuto cerebrale.
- Aggiungere 500 ml di soluzione di papaina (passo 1.4) e digerire il tessuto cerebrale a 37 ° C per 10 min. Non incubare più di 15 min come potrebbe diminuire la vitalità cellulare.
- Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto cerebrale con 500 microlitri della soluzione di papaina in un tubo da 15 ml con un taglio puntale 1.000 microlitri a ~ 0,25 pollici dal fondo. dissociarsi delicatamente il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù per 10 volte con la stessa punta. Non pipettare su e giù più di 15 volte e non generano bolle d'aria durante questa fase, in quanto potrebbe alterare la vitalità cellulare.
- Incubare nuovamente il tessuto cerebrale a 37 ° C per 10 minuti seguiti da pipettando su e giù 10-13 volte utilizzando un uncut 1.000 microlitri punta regolare. Non pipettare su e giù per più di 15 volte, per evitare la morte delle cellule.
- Arrestare la digestione enzimatica aggiungendo 2 ml di soluzione di lavaggio (passo 1.5), e centrifugare la sospensione cellulare a 800 xg per 5 min a temperatura ambiente (RT). decantare attentamente le supernatant e risospendere il pellet in soluzione rimanente toccando il tubo energicamente con un dito e poi pipettando su e giù con un 1.000 microlitri punta regolare. Successivamente, aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio.
- In questa fase, controllare sotto il microscopio che una singola sospensione cellulare è stata ottenuta. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 800 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di fresco Z-condizione media (passo 1.10).
- Cellule Stain utilizzando trypan blu 12 e contare le cellule viventi utilizzando un emocitometro escludendo le cellule morte blu. Preparare un 24-pozzetti con 200 ml di sospensione cellulare e 300 ml di fresco Z-condizione di media in ciascun pozzetto. cellule seme ad una densità di ~ 500 cellule / ml. Mantenere cellule coltivate in un incubatore a 30 ° C in 5% di CO 2, dal momento che zebrafish neurosfere cervello-derivato non crescono bene a 37 ° C.
4. Generazione di primaria Neurosfere </ P>
- Dopo 1 giorno in vitro (Div1), osservare la sospensione di cellule singole ottenuti dall'intero cervello adulto al microscopio e osservare se detriti ha accumulato nel centro del pozzo. Rimuovere con cautela eventuali detriti pipettando circa 100 ml di media (meno se possibile). Successivamente aggiungere 100 ml di fresco Z-condizioni medie. Sospensioni singola cella devono essere osservate in questo momento (Figura 2A Div1).
- Dopo 2 giorni in vitro (div2), espandere le cellule in coltura. Usando una pipetta 1000 ml con il taglio punta, raccogliere e trasferire 250 microlitri di sospensione cellulare da ogni pozzetto in un nuovo pozzo. Aggiungere 250 ml di fresco Z-condizione media in tutti i pozzetti. Prima espandendo le cellule coltivate, omogeneizzare la sospensione molto delicatamente pipettando su e giù durante il pozzo.
- Ripetere i punti 4.1 e 4.2 per i seguenti 4 giorni in vitro (DIV4). Un progressivo aumento delle dimensioni del neurosfere dovrebbe essere vibile al centro e bordi del bene div3 e DIV4 (Figura 2B e C).
Nota: neurosfere primarie possono essere trattati per il passaggio o la differenziazione di valutare multipotenza. In alternativa, possono essere trattati per nucleofection o lipo-trasfezione 11 per caratterizzare il ruolo di geni specifici durante il processo di differenziazione.
5. Passaging di primaria Neurosfere
- Togliere 250 ml di coltura di tessuti da ciascun pozzetto e dissociarsi meccanicamente neurosfere DIV4 con una pipetta 1 ml. Non pipettare su e giù troppo rapidamente, come la formazione di bolle d'aria può aumento della morte cellulare.
- Contare le cellule con un emocitometro e distribuire 800 cellule / ml in 250 ml di surnatante coltura primaria in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
- Aggiungere 250 ml di Z-condizione media in ciascun pozzetto.
- Dopo 2 giorni in vitro (div2), espandere le cellule coltivate come riportato al passo 4.2 und 4.3.
6. La differenziazione di primaria Neurosfere
- Sterilizzare vetrini per immersione in etanolo al 70% per 10 min, vetrini coprioggetto poi essiccare a RT ponendoli in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti.
- Aggiungere 300 ml di soluzione di rivestimento extracellulare (passo 1.11) al centro del vetro di copertura in modo tale che si può allargare ampiamente e coprire l'intero vetro di copertura. Poi, incubare a 37 ° C per 1 h (utilizzando la umidificato coltura incubatore cellulare).
- Rimuovere la soluzione di rivestimento extracellulare dopo incubazione, e asciugare il vetro di copertura per 2 ore a 37 ° C.
- Togliere 250 ml di coltura di tessuti da ogni pozzetto. Meccanicamente dissociarsi tutti i principali neurosfere DIV4 per bene con una pipetta 1 ml (con punta più ampio-end) pipettando su e giù.
- Seed dissociato sospensioni cellulari neurosfere ad una densità cellulare di 4 x 10 3 cellule / ml su vetrini matrice extracellulare rivestite precedentemente preparati (passo 6.1-6.3) e mantenere per almeno 30 minuti, a 30 ° C in 5% CO 2, fino attaccata al substrato. Poi, rimuovere il terreno di coltura e rapidamente aggiungere 1 ml di fresco Z-differenziazione condizione medio pre-riscaldato (passo 1,9) prima coltivando le cellule per 24 ore a 30 ° C in 5% CO 2.
- Ogni due giorni, sostituire la metà della condizione medio Z-differenziazione durante il tempo di differenziazione cellulare.
7. manipolazione genetica di primaria Neurosfere
- Raccogliere DiV3-4 neurosfere primarie (passo 4,3) per centrifugazione per 8 minuti a 80 x g a 4 ° C. Preparati per liposomi trasfezione di oligonucleoatides commerciali previouly descritto 11 o nucleo-trasfezione di vettori plasmidici DNA.
- Risospendere neurosfere pellet ad una densità cellulare di 4 x 10 3 cellule / ml in 100 ml di una miscela di reazione (soluzione nucleofactor 82 microlitri e 18 ml di supplemento).
- Mescolare il suspensi neurosferesu con 5 ml di vettori plasmide DNA di scelta (scorte plasmidi a 1 mg / mL). Trasferire il composto neurosfere / DNA in una provetta Nucleofector per nucleotransfection e selezionare Nucleofector programma in base alle istruzioni del costruttore fornite dal kit Nucleofector.
- Subito dopo nucleofection, aggiungere un volume di 500 ml di pre-riscaldato Z-condizioni del supporto (1,10) alle cellule e piastra le neurosfere trasfettate per studiare il rinnovo cellulare e / o differenziazione, come descritto sopra.
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Representative Results
Schema generale del Zebrafish adulti neurosfere Cultura
Qui si descrivono tutte le fasi del protocollo di un test neurosfere di formazione svolto dal cervello zebrafish adulto. In primo luogo, per adulti cellule staminali / progenitrici neurali sono stati raccolti sia da zebrafish intero cervello o da diverse regioni del cervello sezionati come il telencefalo, il tectum e il cervelletto (Figure 1A-C). Sospensione cellulare singolo di cellule staminali / progenitrici neurali adulte sono stati poi utilizzati per generare galleggianti e neurosfere di auto-rinnovamento (Figure 1D, E). Infine, neurosfere sono state fondamentali per lo studio del down e up-regolazione dell'espressione dei geni codificanti o piccoli RNA non codificanti 11, al fine di indagare il loro ruolo nella proliferazione e differenziazione delle cellule staminali / progenitrici neurali zebrafish.
Zebrafish neurosfere primarie possono auto-rinnovarsi dopo diversi passaggi. Per generare neurosfere a Passage 1 e 2, a pochi passi 5,1-5,4 sono state ripetute due volte, per un totale di 6-8 giorni. Dal DiV2-4, le dimensioni delle neurosfere aumentata fino a circa 50 micron di diametro. Neurosfere secondari e terziari sono stati ottenuti dopo Passaggio 1 e 2, rispettivamente (Figura 2D). A Passage 3, neurosfere zebrafish erano comunque in grado di crescere fino alla dimensione critica di 50 micron di diametro e non è riuscito ad auto-rinnovare, il che suggerisce che la nostra condizione cultura piuttosto seleziona un pool di cellule staminali / progenitrici di una popolazione pura di cellule staminali neurali 4 .
neurosfere Differenziazione
neurosfere primarie, secondarie o terziarie derivanti sia dal da te il cervello o dalla telencefalica, cerebellare e la zona tectal di zebrafish adulti sono stati testati per la loro potenzialità di differenziazione. Da 1 a 3 giorni in vitro in condizioni di differenziazione (DiVd1-DiVd3), un monostrato di cellule aderenti stata osservata (Figure 3A, B). Come illustrato in figura 3C, a DiVd4, assonale sporgenze e cellule gliali erano visibili e distinguibili mediante espressione immunoistochimica o gene analisi 11, valutando che stelo / cellule progenitrici neurali erano dissociati. Allo stesso modo, i neuroni e cellule gliali differenziate da cellule staminali / progenitrici neurali isolate da diversi territori cerebrali (figure 3D, E).
Gene Expression Manipulation in Zebrafish Neurosfere
Abbiamo testato il ruolo di miR-107 sulla differenziazione neuronale e gliale di tutto il zebrafish brain-de Rived neurali cellule staminali / progenitrici (Figura 4). Abbiamo dimostrato che la sottoregolazione di miR-107 da anti-miR-107 non ha influenzato la formazione di neurosfere ma alterata differenziazione neuronale, come indicato dalla crescita abnorme dei processi assonale (Figure 4A, B). RT-PCR dell'espressione genica analisi conferma che l'inibizione di miR-107 porta ad un aumento dell'espressione sia del marcatore neuroblasti Neurogenin-1 (NGN-1) e molecole specifiche assoni, come Map-2 e α-tubulina, senza influenzare gliali espressione marcatore cellulare (S-100, GFAP, Olig2) (Figura 4C). Di conseguenza, il guadagno del miR-107 espressione da miR-107-mimico indotto una diminuzione di neuroblast- e assone-specifica espressione marcatore (Figura 4D), valutando che, in vitro, miR-107 agisce come un regolatore di differenziazione neuronale durante la neurogenesi zebrafish 11.
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Figura 1:. Rappresentazione schematica del protocollo Passi le modalità ei tempi associati includono la dissezione di uno tutto il cervello o il telencefalica, tectal e le regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto (A, B), l'ottenimento di una sospensione singola cella (C ), la generazione di neurosfere galleggianti (D) e la differenziazione di neurosfere (e).
Figura 2: Formare Zebrafish Brain-derived Neurosfere. (A - C) immagini a contrasto di fase Rappresentante di intere neurosfere galleggianti primari del cervello-derivato osservate al giorno 1 (Div1, A), il giorno 3 (div3, B) e il giorno 4 (DIV4, C). (D) grafico che rappresenta il numero relativo di Neurospheres a passaggi 1 e 2 rispetto al numero di neurosfere al passaggio 0. dopo il passaggio 2, neurosfere formazione era drasticamente diminuito. barra della scala: 25 micron.
. Figura 3: Differenziazione delle Zebrafish Brain-derived Neurosfere (A - C, E) immagini a contrasto di fase di intere neurosfere derivato dal cervello coltivate nel medio Z-differenziazione durante 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) e 4 (C e D, DiVd4) giorni. View (E) dorsale di tutto il cervello di un vecchio Tg (GFAP: DsRed) 12 mesi di zebrafish. Il telencefalo (Tel), tectum (Tec) e nel cervelletto (Cer) sono stati sezionati e raccolti come indicato. (D) Immagini di neurosfere DiVd4 derivati dalla tectum, telencefalo e nel cervelletto a Passage 0 (P0), 1 (P1) E 2 (P2). barra della scala: 25 micron.
Figura 4:. L'analisi dei Neurosfere a formare in seguito MiR107 Manipolazione immagini (A) a contrasto di fase che mostrano neurosfere Div4d trattati presso DIV4 con gli oligonucleotidi indicati. scatole nere nei pannelli superiori indicano l'area ingrandita nei pannelli inferiori. (B) Top grafico rappresenta la quantificazione del numero di neurosfere formati con, o senza, miR107. Neurosfere sono subgrouped per le loro dimensioni (20-30 micron, 31-50 micron,> 51 micron di diametro). grafico in basso indica la quantificazione delle proiezioni assonale da neurosfere trattati e sub raggruppati come sopra. (C, D) qRT-PCR analisi di espressione dei geni indicati da neurosfere Div4d precedentemente trattati con oligonucleotidi indicati in DIV4. I dati rappresentano lamedia ± SEM, * p <0.05, n = 3. Scr: scramble. barra della scala: 25 micron.
| Problema | possibile causa | Soluzione |
| Recupero di troppi cellule morte | Ritardo nella preparazione cervello prima del trattamento enzimatico | Assicurarsi che la dissezione impostato e media sono pronti prima di sacrificare il pesce (controllare anche la sterilità, temperatura) |
| trattamento papaina rigorosi | dissociazione meccanica deve essere abbastanza delicato per generare una sospensione vivo singola cella, ma abbastanza forte per evitare di lasciare dietro troppi ciuffi di tessuto. Rispettare i tempi consigliati e temperature per periodi di incubazione / centrifugazione | |
| Neurosfere non appaiono o crescono poco | la temperatura non corretta | Controllare che incubatore a 30 ° C sta fornendo la ctemperatura orrect. |
| sfere crescenti rimossi con detriti | Per ciascun pozzetto, l'aspirazione di detriti deve essere effettuata ben sopra del mezzo. Evitare di entrare nel mezzo con la pipetta | |
| L'integrità di alcuni reagenti (supplemento B27, EGF, FGF) è indebolito | Questa integrità costituisce fattori limitanti di crescita cellulare. Controllare il numero di lotto, e il modo in cui i campioni sono stati conservati. Evitare di disgelo / ricongelare cicli di qualsiasi reagente campionato utilizzati nella cultura | |
| Presenza di singole cellule | Modalità di trasferimento / espansione del neurosfere è troppo dura | Questo passo è un passo di espansione / diluizione perché troppe sfere sono formate nel pozzo. Evitare di raccolta sfera dura durante il trasferimento per evitare che la dissociazione neurosfere in singole cellule |
| Assenza di cellule su Matrigel | Matrigel non è stato correttamente scongelato / diluito | Matrigel da -20 ° C necessita di almeno 30 minuti a 4 ° C per scongelare e rimane accuratamente viscoso Pipettare |
| No adesione su matrigel | Il volume di sospensione cellulare deve essere abbastanza piccolo per permettere la deposizione delle cellule sul cappotto matrigel | |
| Lasciare più tempo per la deposizione delle cellule (fino a 2 ore se si usano grandi volumi) | ||
| media differenziazione fresco troppo freddo | Quando si sostituisce il mezzo cella attaccamento, il mezzo di differenziazione deve essere riscaldato a 30 ° C per evitare shock termici sulle cellule depositate | |
| povero nucleofection | Le cellule morte | Assicurarsi che non si generano bolle d'aria durante l'esecuzione nucleofection. Utilizzare vettori di DNA di alta qualità usando Maxi-preparati. Almeno 1 - 2 ore dopo nucleofection, sostituire terreno di coltura utilizzando medie condizione fresca Z-differenziazione o Z-condizioni medie. |
| neurosfere positivi Poche | Neurosfere di varie dimensioni può portare a scarsa nucleofection. Uso neurosfere a div2 e div3 sono ideali per nucleofection. Densità di cellule non superiore a 4 x 10 3 neurospheres ml -1 in una reazione 100 ml. |
Tabella 1: risoluzione dei problemi Consigli profilo, per ogni fase del protocollo, i possibili problemi e le soluzioni per superarli.
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Discussion
L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare e cultura Zebrafish adulti neurosfere cervello-derivato per studiare le caratteristiche cellulari e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali. Qui, si segnala come selezionare le cellule neurali multipotenti e generare tre tipi di cellule neurali, cioè, astrociti, oligodendrociti e neuroni, dal cervello zebrafish adulto. Il protocollo è altamente significativo dal momento che un saggio neurosfere di formazione riproducibile non è stato stabilito nel zebrafish finora.
Bisogno di alcuni passaggi critici nel protocollo da rispettare e sono stati recapitutaled nel consiglio di risoluzione dei problemi (Tabella 1). In primo luogo, la morte cellulare avviene sia durante la dissezione del cervello zebrafish adulti e la procedura di sospensione singola cella. Per limitare l'estendere di morte cellulare, è indispensabile utilizzare attrezzi puliti e affilati, nonché di rispettare rigorosamente i tempi e la temperatura di incubazione raccomandata nel presente proprotocollo. In secondo luogo, la cultura neurosfere deve essere effettuata con mezzi preparati al momento e con una tecnica di pipettamento accurato. In terzo luogo, le raccomandazioni di densità delle cellule devono essere seguite per ottenere il rinnovo affidabili o differenziazione delle cellule neurosfere. Con questo in mente, ogni tecnico tecniche di coltura cellulare dovrebbe essere in grado di utilizzare il protocollo ed eseguire la manipolazione di isolamento, della cultura e del gene di neurosfere cervello-derivato zebrafish adulti.
I saggi sfera di formazione nel zebrafish soffre di le stesse limitazioni precedentemente descritte in specie di mammiferi 4: 1) il comportamento delle cellule staminali / progenitrici neurali viene alterata in seguito il loro isolamento dalla loro nicchia naturale del cervello; 2) neurosfere non sono una popolazione omogenea di cellule staminali, ma sono le cellule staminali, cellule progenitrici e cellule differenziate post-mitotico. E 'inoltre da notare che il nostro protocollo genera culture neurosfere aclonal. La densità cellulare di culture èun parametro critico in saggi sfera formanti poiché determina clonalità, cioè, se la cultura è clonale, semi-clonale o aclonal. condizioni clonali permettono di caratterizzare in modo accurato e quantificare i diversi pool di cellule staminali e progenitrici presenti nella cultura. Non siamo stati in grado di eseguire test di clonalità delle cellule finora e le nostre condizioni di coltura ancora bisogno di più di ottimizzazione prima di poter discriminare le cellule staminali neurali da altri pool di cellule progenitrici.
colture di neurosfere zebrafish può essere utilizzato per una vasta gamma di esperimenti. Essi consentono analisi di espressione genica e manipolazione genica durante neurogenesi come illustrato dal nostro studio per valutare la funzione miR-107 nella determinazione specifico tessuto neurale destino cellulare (figura 4 e 11). Ulteriori applicazioni includono strategie di montaggio del genoma, come ad esempio il sistema di CRISPR / Cas9, al fine di verificare il ruolo dei geni neuronali staminali / progenitrici in neurogeNesis e il cervello di riparazione 13. Infine, il nostro protocollo dimostra che neurosfere zebrafish possono essere derivate da differenti regioni del cervello aprendo la possibilità di studiare le caratteristiche regionali specifici di neuroni e cellule gliali e di esplorare le basi cellulari e molecolari di eterogeneità delle cellule neurali in diversi domini ventricolari del cervello zebrafish 14 .
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
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