Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og dyrkning af Adult Zebrafisk Brain-afledte Neurosfærer

Published: February 29, 2016 doi: 10.3791/53617
Automatic Translation
*1,2, *3, 1, 1,3, 1
1Yale Cardiovascular Research Center, Internal Medicine, Yale University, 2Department of Medicine, University of California, San Diego, 3APHP Groupe Hospitalier Pitié-Salpètrière, Université Pierre and Marie Curie
* These authors contributed equally

Summary

Her giver vi en reproducerbar metode til at undersøge voksen neurogenese ved anvendelse af en neurosfære assay afledt af hele hjernen eller fra enten telencephalic, tectal eller cerebellare regioner af den voksne zebrafisk hjerne. Desuden har vi beskrive, hvorledes det manipulere genekspression i zebrafisk neurosfærer.

Introduction

Mammale neurale stamceller (NSC) er blevet karakteriseret in vitro ved deres evne til at vokse i frit flydende kulturer som klynger af delende celler betegnet neurosfærer 1. I nærvær af epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktor (FGF), NSC'er opdele enten symmetrisk at generere selvfornyende NSC'er eller asymmetrisk at generere to forskellige datterceller, dvs.., En differentierende progenitorcelle og en hidtil ukendt NSC. Neurosfære kulturer er derfor en blanding af neurale stamceller / progenitorceller og mere differentierede neurale celler 2-4 NSC'er kan imidlertid skelnes fra andre neurosfære celletyper ved to specifikke egenskaber:. De udviser langvarig selvfornyelse i fri- flydende kulturer og de ​​kan differentiere til alle neurale cellelinier (dvs. neuroner, astrocytter og oligodendrocytter) efter tilbagetrækning af vækstfaktorer og adhæsion til ekstracellulær matrix substrater. I Mammals, neurosfæren kultur-systemet var den første in vitro-system, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af NSC i den voksne hjerne og er fortsat det mest anvendte værktøj til at analysere spredning, selvfornyelse kapacitet og multipotency af neurale stamceller og stamceller. Selv om kugle-dannende analyser lider nogle ulemper og begrænsninger 4, denne kultur system er værdifuld for at vurdere potentialet i en celle til at opføre sig som en stamcelle, når fjernet fra dets in vivo-niche 4 og har været medvirkende til at identificere centrale regulatorer af NSC selv-fornyelse og celle skæbne beslutsomhed 5-7.

I modsætning til pattedyr, der har begrænset voksen neurogenese, zebrafisk konstitutivt producere nye neuroner langs hele hjernen akse hele deres liv. Zebrafisk voksne hjerne vises flere neurogene nicher huser neurale stamceller / progenitorceller gør zebrafisk en kraftfuld model organisme for forståelse than stamcelle aktivitet i hjernen samt de molekylære programmer, som kræves for centralnervesystemet regenerering. I løbet af de sidste 17 år, flere forskergrupper udviklet metoder til isolering og dyrkning af zebrafisk nerveceller 8,9. Disse undersøgelser havde til formål at producere embryonale neuronal og gliaceller in vitro, men ikke på at fastholde NSC'er og undersøge deres egenskaber. Selvom neurosfærer er blevet genereret i den voksne Apteronotus leptorhynchus (Brown Ghost Knifefish) 10, en neurosfære-dannende assay i zebrafisk manglede at blive etableret.

Her beskriver vi en neurosfære-dannende assay at demonstrere rolle miR-107 under zebrafisk neurogenese 11. Protokollen giver: 1) indsamling af voksne neurale stamceller / progenitorceller enten fra zebrafisk hele hjernen eller fra flere dissekerede hjernen regioner som telencephalon den Tectum, og lillehjernen; 2) dannelse af flydende og selvfornyende neurosfærer fra voksne neurale stamceller / stamceller; 3) down- og opregulering af ekspressionen af kodende gener eller små ikke-kodende RNA'er 11 i neurosfærer, for at undersøge deres rolle i proliferation og differentiering af neurale stamceller / progenitorceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebrafisk af WT CF stammen blevet rejst og vedligeholdt i henhold til protokoller er godkendt af Yale University Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC protokol nummer 2012-11.473). Alle forsøg skal først godkendes af alle relevante statslige og institutionelle etik regulerer organer med hensyn til brugen af ​​dyr til forskningsformål.

1. Forberedelser

  1. Forbered 10 ml dissektion medium, tilsættes 200 pi 100x penicillin-streptomycin i 9,8 ml DMEM / F12.
  2. Forbered L-Cystein løsning: at 10 ml vand til vævskultur, tilsættes 120 mg L-cystein. Opbevar L-cystein opløsning ved 4 ° C i op til 2 uger, eller i alikvoter ved -20 ° C i op til 1 år.
  3. Forbered DNase I-opløsning: til 1 ml vand til vævskultur, tilsættes 10 mg DNase I. Store DNase I opløsning ved 4 ° C i op til 2 måneder.
  4. Forbered papain løsning: at forberede papain solution, tilsættes 100 pi papain (ca. 140 enheder), 100 pi DNase I (1%) og 200 pi L-cystein (12 mg / ml) i 5 ml DMEM / F12. Frisk forberede papainopløsning hver gang og sterilisere med et 0,22 um porestørrelse før brug.
  5. Forbered vask løsning: at forberede 100 ml vaskeopløsning, tilsættes 650 pi glucose 45%, 500 uL HEPES 1 M og 5 ml FBS i 93,85 ml DPBS 1x. Sterilisere vaskeopløsningen med et 0,22 um porestørrelse før brug. vaskeopløsningen ved 4 ° C i op til 2 måneder lagre.
  6. Forbered insulinopløsning: at forberede 2 ml insulinopløsning, tilføje en 25 ul dråbe 10 N NaOH og 100 mg insulin i 2 ml vand til vævskultur.
  7. Forbered EGF og FGF løsninger: Opløs begge mitogener i DMEM / F12 ved 100 pg / ml koncentration. Store som 10 pi alikvoter ved -20 ° C.
  8. Forbered B-27 og N-2-medier: gemme B-27 og N-2 kosttilskud ved -20 ° C til 500 pi og 1 ml alikvoter, respektively.
  9. Forbered Z-differentiering betingelse medium: Til fremstilling af 100 ml Z-differentiering tilstand medium, tilsættes 40 pi insulin (50 mg / ml), 500 pi B-27, 1 ml N-2, 650 pi glucose 45% og 1 ml 100 x penicillin-streptomycin i 97,81 ml DMEM / F12. Steriliser Z-differentiering tilstand medium med et 0,22 um porestørrelse før brug. Opbevar Z-differentiering tilstand medium ved 4 ° C i op til 1 uge.
  10. Forbered Z-tilstand medium: at forberede 50 ml Z-tilstand medier, tilsættes 10 pi EGF og 10 pi FGF i 50 ml sterilt Z-differentiering tilstand medium (20 ng / ml). Opbevar Z-tilstand medium ved 4 ° C i op til 1 uge.
  11. Forbered coatingopløsning for differentiering kultur: i 5 ml ekstracellulær coatingopløsning, tilsættes 100 pi af den ekstracellulære matrix opløsning i 4,9 ml DMEM / F12 (f.eks Matrigel.). Tø ekstracellulær matrix-opløsning ved 4 ° C på is. Når optøet, holde ved 4 ° C for up til 2 uger.

2. Dissektion af Adult Zebrafisk Brain

  1. Forbered en dissektion seng ved at fylde en 100 mm x 15 mm petriskål med gel isposer. Derefter placere låget på petriskålen og inkuberes ved -20 ° C indtil gelen fryser. Oven på låget sted et kvadrat med rent filterpapir og wrap både filtrerpapiret og petriskål med plastfilm.
  2. Rens og sterilisere alle mikrodissektions instrumenter med 70% ethanol eller varme før hver brug. Læg alle steriliseret dissektion instrumenter nær dissektionsmikroskop og lige før eutanasi, placere dissektion sengen under mikroskop med belysning optisk fiber.
  3. Saml 2 voksne zebrafisk for en hel hjerne neurosfære forberedelse; og 3 til 4 zebrafisk at generere neurosfærer fra dissekerede hjerneregioner.
  4. Afliv voksne zebrafisk (8-12 måneder gamle) ved hjælp af en protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg. Dernæst nedsænkes fisk i 75% ethanol i 5-10 sek og hurtigt placere i dissektion sengen efterfulgt af halshugning på niveau med gællerne bruger kirurgisk kniv.
    1. For at aflive dyr, administrere en overdosis (300 mg / L) tricaine methansulfonatet indtil dyrets hjerteslag gradvist langsommere og cirkulation stopper, så nedsænkes i isvand.
  5. Dreje hovedet dorsale nedad, og ved hjælp saksen gøre et langsgående snit fra de afskårne side til munden. Brug af pincet eksponere bunden af ​​kraniet og fjerne alle de tilstødende væv. Skær sidevægge kraniet fra begyndelsen af ​​rygmarven mod tectum.
  6. Brug af saks, klippe og fjern de optiske nerver og derefter fjerne begge sider af den mest laterale del af kraniet på niveau med den tectum. Drej hovedet ventrale side op. Med pincet, skrælle resten af ​​den mest apikale del af kraniet.
  7. Overfør hjernen sammen med den resterende del af kraniet ind i en ny skål with dissektion medium (1,1). Rengør hjernevæv i dissektionsmedium med micro kniv plasthåndtag, holde alle hjernens strukturer intakte.
  8. Fra dette punkt, fortsætter protokollen bruge hele zebrafisk hjernen.
    1. Alternativt tilpasse denne protokol til bestemte områder af hjernen til at generere neurosfærer fra hele zebrafisk hjernen eller fra telencephalon, Tectum / diencephalon eller cerebellum dissekeret med en frisk skalpel. Brug en neural specifik fluorescerende zebrafisk neurale transgene linje at dissekere hjernen region af interesse i henhold til Figur 3 og referere 11.

3. Enkelt celle Dissociation af Voksen Brain

  1. Udfør alle efterfølgende arbejde i et biologisk sikkerhedsskab. Overfør hjernevæv i et 1,5 ml rør indeholdende 800 pi dissektion medium (fremstillet i trin 1.1). Fjern dissektion medium ved pipettering, uden at røre ved hjernevæv.
  2. Der tilsættes 500 pi papain-opløsning (trin 1.4) og fordøje hjernevæv ved 37 ° C i 10 min. Må ikke inkuberes længere end 15 min, som det kunne nedsætte cellernes levedygtighed.
  3. Efter inkubation overføre hjernevæv med 500 pi papain-opløsning i en 15 ml konisk rør ved anvendelse af en 1.000 pi pipettespids skåret ~ 0,25 inches fra bunden. dissocierer forsigtigt hjernevæv ved langsomt at pipettere op og ned 10 gange med den samme spids. Må ikke pipetteres op og ned mere end 15 gange og ikke skaber luftbobler under dette trin, som det kunne ændre cellernes levedygtighed.
  4. Inkubér hjernevæv igen ved 37 ° C i 10 minutter efterfulgt af pipettering op og ned 10-13 gange ved anvendelse af en uncut 1.000 pi regelmæssig spids. Må ikke pipetteres op og ned mere end 15 gange, for at undgå celledød.
  5. Stop enzymatisk fordøjelse ved tilsætning af 2 ml vaskeopløsning (trin 1.5), og centrifugeres cellesuspensionen ved 800 xg i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). dekanteres forsigtigt supernatant og pellet resuspenderes i den resterende opløsning ved at banke på glasset kraftigt med en finger og derefter ved pipettering op og ned med en 1.000 pi regelmæssig spids. Dernæst tilsættes 2 ml vask løsning.
  6. På dette trin kontrolleres under mikroskop, at en enkelt cellesuspension er blevet opnået. Centrifuger cellesuspensionen igen ved 800 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og re-suspendere pellet hjælp 1 ml frisk Z-tilstand medium (trin 1.10).
  7. Farv celler ved hjælp af trypanblåt 12 og tælle levende celler under anvendelse af et hæmocytometer ved at udelukke blå døde celler. Der fremstilles en 24-brønds plade med 200 pi cellesuspension og 300 pi frisk Z-tilstand medium i hver brønd. Seed celler ved en densitet på ~ 500 celler / pl. Oprethold dyrkede celler i en inkubator ved 30 ° C i 5% CO2, da zebrafisk hjerne-afledt neurosfærer ikke vokser godt ved 37 ° C.

4. generation af Primary Neurosfærer </ P>

  1. Efter 1 dag in vitro (Div1), observere enkelt cellesuspension opnået fra den voksne hele hjernen under mikroskop og notere, om der er støv i centrum af brønden. Fjern forsigtigt eventuelle rester ved pipettering ca. 100 pi af medium (mindre hvis det er muligt). Næste tilsættes 100 pi frisk Z-tilstand medium. Enkeltcellesuspensioner bemærkes på dette tidspunkt (figur 2A Div1).
  2. Efter 2 dage in vitro (div2), udvide dyrkede celler. Under anvendelse af en 1.000 pi pipette med spidsen skåret, indsamle og overføre 250 pi cellesuspension fra hver brønd i en ny brønd. Tilsættes 250 pi frisk Z-tilstand medium til alle brøndene. Før udvidelse af dyrkede celler, homogenisere suspensionen meget forsigtigt ved pipettering op og ned hele godt.
  3. Gentag trin 4.1 og 4.2 for de følgende 4 dage in vitro (DIV4). En progressiv stigning i størrelsen af ​​neurosfærer bør viligt ved midten og kanterne af godt ved DIV3 og DIV4 (Figur 2B og C).
    Bemærk: Primære neurosfærer kan bearbejdes til passage eller differentiering til vurdering multipotency. Alternativt kan de behandles til nucleofection eller lipo-transfektion 11 til at karakterisere rollen af specifikke gener under differentiering proces.

5. Passage af Primary Neurosfærer

  1. Fjern 250 pi vævskultur fra hver brønd og mekanisk dissociere DIV4 neurosfærer med en 1 ml pipette. Må ikke pipetteres op og ned for hurtigt som luftboble dannelse kan øget celledød.
  2. Tæl cellerne med et hæmocytometer og distribuere 800 celler / pl i 250 pi primær kultursupernatant i hver brønd i en plade med 24 brønde.
  3. Tilsættes 250 pi Z-tilstand medium til hver brønd.
  4. Efter 2 dage in vitro (div2), udvide dyrkede celler som rapporteret i trin 4.2 end 4.3.

6. Differentiering af Primary Neurosfærer

  1. Sterilisere dækglas ved nedsænkning i 70% ethanol i 10 minutter, derefter tørre dækglas ved stuetemperatur ved at placere dem i hver brønd i en plade med 12 brønde.
  2. Der tilsættes 300 pi ekstracellulær coatingopløsning (trin 1.11) i midten af ​​dækglasset, således at den kan udvide sig bredt og dækker hele dækglasset. Derefter inkuberes ved 37 ° C i 1 time (ved hjælp af befugtet cellekultur inkubator).
  3. Fjern den ekstracellulære overtræksopløsning efter inkubation, og tør dækglasset i 2 timer ved 37 ° C.
  4. Fjern 250 pi vævskultur fra hver brønd. Mekanisk adskille alle DIV4 primære neurosfærer per brønd med en 1 ml pipette (med bredere ende spids) ved pipettering op og ned.
  5. Seed dissocieret neurosfære cellesuspensioner ved en celletæthed på 4 x 10 3 celler / ml på tidligere fremstillede ekstracellulære matrix-coatede dækglas (trin 6,1-6.3) og i mindst 30 minutter, ved 30 ° C i 5% CO2, indtil fæstnet til substratet. Fjern derefter dyrkningsmediet og hurtigt tilsættes 1 ml forvarmet frisk Z-differentiering tilstand medium (trin 1.9), inden dyrkning af cellerne i 24 timer ved 30 ° C i 5% CO2.
  6. Hver anden dag, erstatte halvdelen af ​​Z-differentiering tilstand medium i den tid af celle differentiering.

7. Gene Manipulation af primær Neurosfærer

  1. Indsamle DiV3-4 primære neurosfærer (trin 4.3) ved centrifugering i 8 minutter ved 80 x g ved 4 ° C. Forbered liposomtransfektion af kommercielle oligonucleoatides som previouly beskrevet 11 eller nucleo-transfektion af DNA plasmid vektorer.
  2. Resuspender neurosfære pellet ved en celletæthed på 4 x 10 3 celler / pl i 100 pi af en reaktionsblanding (82 pi nucleofactor opløsning og 18 pi supplement).
  3. Bland neurosfære suspensipå med 5 pi af DNA plasmidvektorer af valg (plasmid lagre ved 1 pg / pl). Overfør neurosfære / DNA-blandingen i en nucleofector kuvette til nucleotransfection og vælg nucleofector program i henhold til producentens instruktioner tilvejebragt af nucleofector kit.
  4. Umiddelbart efter nucleofection, tilsættes et volumen på 500 ml foropvarmet Z-tilstand medier (1.10) til cellerne og pladen de transficerede neurosfærer for at studere deres celle fornyelse og / eller differentieringsfaktorer egenskaber, som beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Opbygningen af ​​den Adult Zebrafisk neurosfæren Kultur

Her beskriver vi alle trin i protokollen for en neurosfære-dannende assay udføres fra den voksne zebrafisk hjerne. For det første har voksne neurale stamceller / progenitorceller blevet indsamlet enten fra zebrafisk hele hjernen eller fra flere dissekerede hjerneregioner såsom telencephalon, den tectum og cerebellum (figur 1A-C). Enkelt cellesuspension af voksne neurale stamceller / progenitorceller er derefter blevet anvendt til at generere flydende og selvfornyende neurosfærer (figurerne 1D, E). Endelig har neurosfærer været medvirkende til at studere ned- og opregulering af ekspressionen af kodende gener eller små ikke-kodende RNA'er 11 for at undersøge deres rolle i proliferation og differentiering af zebrafisk neurale stamceller / progenitorceller.

Zebrafisk primære neurosfærer kan selv forny efter flere passager. For at generere neurosfærer på Passage 1 og 2, trin 5,1-5,4 blev gentaget to gange, i alt 6-8 dage. Fra DiV2-4, størrelsen af ​​neurosfærerne øges op til omkring 50 um i diameter. Sekundære og tertiære neurosfærer blev også opnået efter passage 1 og 2, henholdsvis (figur 2D). Ved Passage 3, zebrafisk neurosfærer var dog ude af stand til at vokse op på den kritiske størrelse på 50 um diameter og undlod at forny sig selv, hvilket tyder på, at vores kultur tilstand snarere vælger en pulje af stilk / stamceller end en ren population af neurale stamceller 4 .

neurosfære Differentiering

Primære, sekundære eller tertiære neurosfærer afledt fra enten engroe hjernen eller fra telencephalic, cerebellare og tectal område af voksne zebrafisk blev testet for deres differentiering potentiale. Mellem 1 og 3 dage in vitro i differentieringstilstande (DiVd1-DiVd3), blev et monolag af adhærerende celler observeret (figur 3A, B). Som illustreret i figur 3C, ved DiVd4, axonal fremspring samt gliaceller var synlige og skelnes fra hinanden ved immunhistologisk eller genekspression analyser 11, vurderer, at neurale stam- / progenitorceller var differentieret. Tilsvarende neuroner og gliaceller differentieret fra neurale stamceller / progenitor celler isoleret fra forskellige hjerneområder områder (figurerne 3D, E).

Gene Expression Manipulation i zebrafisk Neurosfærer

Vi har testet den rolle, MIR-107 på den neuronale og gliale differentiering af hele zebrafisk hjerne-de afart neurale stamceller / progenitorceller (figur 4). Vi viste, at nedregulering af MIR-107 med anti-MIR-107 ikke påvirkede neurosfære formation men ændret neuronal differentiering, som angivet ved den abnorme vækst af axonale processer (figur 4A, B). RT-PCR-genekspression analyser bekræftede, at hæmning af MIR-107 fører til en forøget ekspression af både neuroblast markør Neurogenin-1 (NGN-1) og Axon-specifikke molekyler, såsom Map-2 og α-tubulin, uden at det påvirker glia cellemarkør ekspression (S-100, GFAP, Olig2) (figur 4C). Følgelig gevinsten af MIR-107-ekspression med MIR-107-mimic inducerede et fald på neuroblast- og Axon-specifik markør ekspression (figur 4D), vurderingen af denne in vitro MIR-107 virker som en neuronal differentiering regulator under zebrafisk neurogenese 11.

/53617/53617fig1.jpg "/>
Figur 1:. Skematisk repræsentation Protokol Steps Procedurerne og tilhørende timing omfatter dissektion af enten hele hjernen eller telencephalic, tectal og cerebellare områder af den voksne zebrafisk hjerne (A, B), opnåelse af en enkelt celle suspension (C ), dannelsen af flydende neurosfærer (D) og differentieringen af neurosfærer (E).

Figur 2
Figur 2: Danner zebrafisk Brain-afledte Neurosfærer. (A - C) Repræsentant fasekontrast billeder af hele hjernen-afledte primære flydende neurosfærer observeret på dag 1 (Div1, A), dag 3 (DIV3, B) og dag 4 (DIV4, C). (D) diagram, der repræsenterer det relative antal neurospheres på Passages 1 og 2 i forhold til neurosfære nummer ved Passage 0. Efter Passage 2, neurosfærer formation var drastisk formindsket. Målestok: 25 um.

Figur 3
. Figur 3: Differentiering af zebrafisk hjerne-afledt Neurosfærer (A - C, E) fasekontrast billeder af hele hjernen-afledte neurosfærer dyrket i Z-differentiering mediet under 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) og 4 (C og D, DiVd4) dage. (E) Dorsal visning af hele hjernen af en 12 måneder gammel Tg (GFAP: DsRed) zebrafisk. Den telencephalon (Tel), Tectum (TEC) og lillehjernen (Cer) blev dissekeret og opsamlet som vist. (D) Billeder af DiVd4 neurosfærer afledt af Tectum, telencephalon og cerebellum ved Passage 0 (P0), 1 (P1) Og 2 (P2). Målestok: 25 um.

Figur 4
Figur 4:. Analyse af Neurosfærer Dannet efter MiR107 Manipulation (A) Fase kontrast billeder, der viser Div4d neurosfærer behandles på DIV4 med de angivne oligonukleotider. Sorte bokse i toppanelerne angive det område forstørres i bundpanelerne. (B) Øverste diagram viser kvantificering af antallet af neurosfærer dannet med eller uden, miR107. Neurosfærer subgrouped ved deres størrelse (20-30 um, 31-50 um,> 51 um i diameter). Nederst diagram viser kvantificering af de axonale fremskrivninger fra neurosfærer behandlede og sub grupperet som ovenfor. (C, D) QRT-PCR ekspression analyse af angivne gener ved Div4d neurosfærer tidligere er behandlet med angivne oligonukleotider på DIV4. Data visermiddelværdi ± SEM, * p <0,05, n = 3. Scr: scramble. Målestok: 25 um.

Problem mulig årsag Løsning
Inddrivelse af for mange døde celler Tidsforsinkelse ved fremstilling hjernen før enzymatisk behandling Sørg for, at dissektion sat op og medier er klar, før ofre fisk (også kontrollere sterilitet, temperatur)
Streng papain behandling Mekanisk dissociation skal være sart nok til at generere en levende enkelt cellesuspension, men stærk nok til at undgå at efterlade for mange klumper af væv. Respekter de anbefalede tider og temperaturer til inkubation / centrifugering perioder
Neurosfærer vises ikke eller vokse dårligt Forkert temperatur Kontroller at inkubator indstillet til 30 ° C giver den correct temperatur.
Voksende kugler fjernet med snavs For hver brønd, aspiration af affald skal udføres godt oven på mediet. Undgå at indgå mediet med din pipette
Integriteten af ​​visse reagenser (B27 supplement, EGF, FGF) er svækket Denne integritet udgør begrænsende faktorer i cellevækst. Tjek batchnummer, og den måde prøver blev bevaret. Undgå tø / refreeze cykler af enhver stikprøven reagens anvendt i kultur
Tilstedeværelse af enkeltceller Mode overførsel / udvidelse af neurosfærer er for barsk Dette trin er en udvidelse / fortynding skridt, fordi for mange sfærer er dannet i brønden. Undgå hårde sfære samling under overførsel at forhindre neurosfære dissociation i enkeltceller
Fravær af celler på matrigel Matrigel blev ikke ordentligt optøet / fortyndet Matrigel fra -20 ° C skal bruge mindst 30 minutter ved 4 ° C for at optø og forbliver viskøs Pipetter omhyggeligt
Ingen vedhæftning på matrigel Volumenet af cellesuspensionen skal være lille nok til at tillade celle aflejring på matrigel frakke
Give mere tid til celle deposition (op til 2 timer, hvis der bruges større mængder)
Frisk differentiering medium for koldt Ved udskiftning af celle-vedhæftning medium, skal varmes op ved 30 ° C differentieringen medium for at forhindre termisk chok på de deponerede celler
Dårlig nucleofection døde celler Sørg for at du ikke genererer luftbobler, mens de udfører nucleofection. Brug af høj kvalitet DNA-vektorer ved hjælp af Maxi-præparater. Mindst 1 - 2 ud timer efter nucleofection, erstatte dyrkningsmedium under anvendelse af enten frisk Z-differentiering tilstand medium eller Z-tilstand medium.
Kun få positive neurosfærer Neurosfærer af varierende størrelser kan føre til dårlig nucleofection. Brug af neurosfærer på div2 og DIV3 er ideelle til nucleofection. Density af celler bør ikke overstige 4 x 10 3 neurosfærer ml -1 i en 100 ml reaktion.

Tabel 1: Fejlfinding Advice Notering, for hvert trin i protokollen, de Mulige problemer og løsninger til at overvinde dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPBS 1x Life Technologies 14190-144
DMEM/F12 1x Life Technologies 11330-032
L-Cysteine hydrochloride monohydrate  Sigma C6852-25g
B-27 Life Technologies 17504-044
N-2 Life Technologies 17502-048 N-2 supplement (100x) liquid 
HEPES  Life Technologies 15630 1 M
D-(+)-Glucose 45%  Sigma G8769
Penicillin-streptomycin  Life Technologies 15140-122
Fetal Bovine Serum  Life Technologies 16000044
Human FGF-basic  Peprotech  100-18B
Human EGF  Peprotech AF-100-15
Insulin  Sigma I5500-50 mg
DNAse Sigma DN25-10mg
Papain  Worthington Biochemical Corporation LS003126
Matrigel  Becton Dickinson 356234
PFA  TCI P0018
PBS AmericanBio AB11072-04000
Tricaine MS-222 Sigma A5040 stock solution of 4 mg/ml. 
Trycold gel  Sigma TGP8 gel pack
Amaxa Basic Nucleofector Kit Lonza VPI-1004
Trypan blue stain  Life Technologies 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
  2. Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
  3. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
  4. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
  5. Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
  6. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  7. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  8. Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
  9. Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
  10. Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
  11. Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
  12. Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
  13. Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. A CRISPR view of development. Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).
  14. Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).

Tags

Developmental Biology zebrafisk neurogenese neurale voksne stamceller / stamceller neurosfæren assay miRNA genmanipulation
Isolering og dyrkning af Adult Zebrafisk Brain-afledte Neurosfærer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F.,… More

Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres. J. Vis. Exp. (108), e53617, doi:10.3791/53617 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter