Summary
Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.
Introduction
Memeli nöral kök hücreler (NSC'lerde) Neurospheres 1 olarak adlandırılan hücrelerin bölünmesi kümeleri gibi serbest bir kültürlerinde gelişme yetenekleri ile, in vitro olarak karakterize edilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) varlığında, NSC'lerde kendini yenileyen NSCs oluşturmak için ya da simetrik olarak bölmek veya asimetrik, iki farklı yavru hücrelere oluşturmak için, yani. Bir ayırıcı projenitör hücre ve yeni bir MGK. Neurosphere kültürler, bu nedenle nöral kök / progenitör hücrelerin ve daha fazla farklı sinir hücrelerinden 2-4 bir karışımı olan NSC'lerde Ancak iki spesifik özellikleri ile, diğer neurosphere hücre tiplerinden ayırt edilebilir. Bunlar serbest uzun süreli kendini yenileme görüntüler kültürleri yüzen ve hücre dışı matriks substratlara büyüme faktörlerinin geri çekilmesi ve yapışma takiben tüm nöral hücre soyları (yani, nöronlar, astrositler ve oligodendrosit) içine ayırt edebilirsiniz. memeli konakçının içindeALS, neurosphere kültür sistemi, yetişkin beyinde NSC'lerde varlığını göstermek için kullanılan ilk tüp sistemi ve proliferasyonu, kendi kendini yenileme ve nöral kök ve projenitör hücrelerinin multipotency analiz etmek için en sık kullanılan araç. Bu nedenle, küre oluşturan deneyleri bazı dezavantajları ve sınırlamalar 4 muzdarip olsa da, bu kültür sistemi kendi in vivo niş 4 çıkarılır ve kilit düzenleyiciler belirlenmesinde etkili olmuştur zaman kök hücresi gibi davranmaya bir hücrenin potansiyelini değerlendirmek için değerlidir MGK kendini yenileme ve hücre kader tayini 5-7.
yetişkin nörogenezi sınırlı memelilere aksine, Zebra balığı yapısal hayatları boyunca tüm beyin ekseni boyunca yeni nöronlar üretirler. Zebra balığı yetişkin beyin t anlamak için Zebra balığı güçlü bir model organizma yapma nöral kök / progenitör hücreler barındıran birden nörojenik nişler görüntülerHücrenin beyinde aktivitesi hem de merkezi sinir sistemi rejenerasyonu için gerekli olan moleküler programları kaynaklanıyor. Geçtiğimiz 17 yıl içinde, çeşitli araştırma grupları izole ve Zebra balığı sinir hücreleri 8,9 kültürleme için yöntemler geliştirmiştir. Bu çalışmalar embriyonik nöronal ve in vitro glial hücreler üretmeyi amaçladığını, ancak NSCs korumak ve onların özelliklerini incelemeyi bulundu. Neurospheres yetişkin Apteronotus leptorhynchus (Brown hayalet Knifefish) 10 içinde olmasına rağmen, zebrabalıkları bir neurosphere oluşturucu deney kurulacak kalmıştır.
Burada zebrabalıkları nöron 11 sırasında miR-107 rolünü göstermek için bir neurosphere oluşturan deneyi açıklar. protokol sağlar: 1) Zebra balığı bütün beyin ya da telencephalon, tektum ve beyincik gibi çeşitli disseke beyin bölgelerinden ya yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin toplanması; fl 2) nesiloating ve yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerden kendini sürekli yenileyen Neurospheres; 3) aşağı ve yukarı yönde regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar neurospheres 11, ekspresyon için nöral kök / progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması rollerini araştırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
WT CF suşu Zebra balığı Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC protokol numarası 2012-11473) tarafından onaylanan protokollere göre kaldırdı ve muhafaza edildi. Tüm deneyler ilk araştırma amaçlı hayvanların kullanımı ile ilgili organları düzenleyen ilgili tüm devlet ve kurumsal etik tarafından onaylanmış olmalıdır.
1. hazırlıklar
- Diseksiyon ortamı 10 ml hazırlamak 200 ul 100x Penisilin-Streptomisin DMEM / F12 9.8 ml.
- , Doku kültürü için 10 ml su ile L-sistein 120 mg ekleyin: L-sistein solüsyonu hazırlayın. 2 haftaya kadar 4 ° C 'de, L-sistein solüsyonu saklayın veya 1 yıla kadar -20 ° C' de parçalar halinde.
- DNase I çözelti hazırlayın: doku kültürü için 1 ml su için, DNase I deposu 2 aya kadar, 4 ° C 'de DNase I çözeltisi 10 mg ekleyin.
- Papain çözelti hazırlayın: Papain solut hazırlamakiyonu, DMEM / F12 5 ml 100 ul papain (yaklaşık 140 adet), 100 ul DNase I (% 1) ve 200 ul L-sistein (12 mg / ml) ekleyin. Taze papain çözüme her zaman hazırlamak ve kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile sterilize edin.
- Yıkama çözeltisi hazırlayın: yıkama çözeltisi 100 ml hazırlanması 93,85 mi DPBS 1x glikoz% 45, 500 uL, 1 M HEPES ve 5 ml FBS 650 ul ekleyin. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre içinden filtre yıkama çözeltisi sterilize edin. en fazla 2 ay için 4 ° C'de yıkama solüsyonu saklayın.
- insülin çözeltisi hazırlayın: insülin çözeltisinin 2 ml hazırlamak için, doku kültürü için 2 ml su içinde, 10 N NaOH ve 100 mg insülin 25 ul damla ekleyin.
- EGF ve FGF çözümleri hazırlayın: 100 ug / ml konsantrasyonda DMEM / F12 iki mitojenler eritin. -20 ° C'de 10 ul alikotları olarak saklanmalıdır.
- B-27 ve K-2 ortamı hazırlayın: KAYIT B-27 ve K-2 takviyesi 500 ul -20 ° C ve 1 ml alikotlar, respectiv deely.
- Z farklılaşma durumu orta hazırlayın: Z-farklılaşma durumu ortamı 100 ml hazırlayın 40 ul insülin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 mL N-2, 650 ul glükoz 45 ve% 1 ml eklemek 100 x penisilin-streptomisin DMEM / F12 97,81 ml. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile Z-farklılaşma durum orta sterilize edin. 1 hafta kadar 4 ° C 'de Z-farklılaşma durumu orta saklayın.
- Z durumu orta hazırlayın: Z-durumu ortamı 50 ml hazırlayın EGF 10 ul steril Z farklılaşma durumu ortamı (20 ng / ml), 50 ml FGF 10 ul ekleyin. 1 hafta kadar 4 ° C 'de Z-ortamla saklayın.
- Farklılaşma kültürü için kaplama çözeltisi hazırlayın: 5 ml dışı kaplama çözümü için, hücre dışı matriks solüsyonu 100 ul ekleyin DMEM / F12 4.9 ml (örneğin, Matrigel.). buz üzerinde 4 ° C'de çözülme hücre dışı matris çözeltisi. Bir kez çözüldü, U, 4 ° C 'de devam2 hafta s.
Yetişkin Zebra balığı Beyin 2. Diseksiyon
- Jel buz paketleri ile 100 mm x 15 mm Petri kabı doldurarak yatağı bir diseksiyon hazırlayın. Daha sonra Petri kabı kapağı yerleştirmek ve jel donar kadar -20 ° C de inkübe edilir. Kapak yerin üstüne temiz filtre kağıdı kare filtre kağıdı ve plastik film ile petri hem sarın ve.
- Temiz ve her kullanımdan önce% 70 etanol ya da ısı ile tüm mikrodiseksiyon aletleri sterilize. mikroskop yakınındaki bütün sterilize diseksiyon aletleri yerleştirin ve sağ ötenazi önce, fiber optik aydınlatma ile mikroskop altında diseksiyon yatak yerleştirin.
- Bir tüm beyin neurosphere hazırlanması için 2 yetişkin zebrafish toplamak; ve 3 ila 4 zebra balığı parçalara beyin bölgelerinde Neurospheres oluşturmak için.
- Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol kullanılarak yetişkin zebrafish (8-12 aylık) euthanize. Sonraki 7, balık batırmak% 5, 5-10 saniye boyunca, etanol ve hızlı bir şekilde cerrahi bıçak kullanılarak solungaçları düzeyinde dekapitasyon diseksiyon yatakta yer.
- Hayvanın kalp atışı yavaş yavaş yavaşlatır ve dolaşımı durana kadar aşırı dozda tricaine metansülfonat (300 mg / L) yönetmek, hayvanlar euthanize, ardından buzlu suya batırın.
- aşağı kafa dorsal yüzü çevirin, ve makas kullanılarak ağzına kesim tarafında uzunlamasına kesim yapmak. Forseps kullanarak kafatasının taban açığa ve tüm komşu doku kaldırmak. tektum yönelik omurilik başından kafatası yanal duvarların kesin.
- makas kullanılarak, kesme ve optik sinirler kaldırmak ve daha sonra tektum seviyesinde kafatası en dış kısımda, her iki tarafı da çıkarın. Baş ventral yüzü yukarı çevirin. Kafatasının en üst kısmı geri kalanını soyulabilir, forseps kullanma.
- Yeni bir tabak wi içine kafatası kalan kısmı ile beyin birlikte aktarındiseksiyon orta (1.1) th. bozulmamış tüm beyin yapılarını tutarak, mikro bıçağın plastik tutacağı kullanarak diseksiyon orta beyin dokusunu temizleyin.
- Bu açıdan bakıldığında, bütün zebrabalıkları beyni kullanarak protokolü devam ediyor.
- Alternatif bütün zebrabalıkları beyin ya da taze neşter ile disseke telencephalon, tektum / diensefalon veya beyincik gelen neurospheres oluşturmak için spesifik beyin bölgelerinde için bu protokolü adapte. Şekil 3 ve 11 referans faiz göre tanımlanan beyin bölgesini incelemek için bir nöral özel floresan Zebra balığı nöral transgenik satırını kullanın.
Yetişkin Beyin 3. Tek Hücre Ayrılma
- Bir biyolojik güvenlik kabini sonraki tüm işlemlerini gerçekleştiriyoruz. diseksiyon orta 800 ul içeren bir 1.5 ml tüp içine beyin doku transferi (adım 1.1 hazırlanmış). Beyin dokusu dokunmadan, pipetleme diseksiyon orta çıkarın.
- papain çözeltisi (adım 1.4) 500 ul ilave edin ve 10 dakika için 37 ° C 'de beyin dokusu sindirimi. hücre canlılığı azaltabilir olarak daha uzun 15 dakika inkübe etmeyin.
- inkübasyondan sonra, alttan ~ 0.25 inç 1000 ul pipetlemeyin ucu kesilmiş kullanarak 15 ml konik tüp içine papain çözüm 500 ul ile beyin dokusuna aktarın. Yavaşça yavaşça aynı ucu ile yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme beyin doku ayırmak. pipetlemeyin yukarı ve 15'den fazla kez aşağı ve hücre canlılığı değiştirebilir olarak, bu adımı sırasında hava kabarcıkları üretemeyen yok.
- Bir kesilmemiş 1.000 ul düzenli ucunu kullanarak 10 yukarı pipetleme tarafından takip dakika ve aşağı 10-13 kez 37 ° C'de tekrar beyin dokusu kuluçkaya yatmaktadır. pipetlemeyin yukarı etmeyin ve en fazla 15 kat aşağı, hücre ölümünü önlemek için.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) 800 xg yıkama çözeltisi (adım 1.5), ve santrifüj 2 ml hücre süspansiyonu eklenerek enzimatik sindirim durdurun. Dikkatle s decantupernatant ve 1000 ul düzenli ucu ile pipetleme ve aşağı şiddetle bir parmak ve sonra tüp dokunarak kalan çözelti içinde pelletini. Daha sonra, yıkama çözeltisi 2 ml ekleyin.
- Bu aşamada, tek bir hücre süspansiyonu elde edilmiştir mikroskop altında bakın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı ve taze Z-ortamla (adım 1.10) 1 ml kullanarak pelet yeniden askıya.
- Tripan mavisi 12 ve kullanarak leke hücreler mavi ölü hücreleri hariç tutarak hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre süspansiyonunun 200 ul ve her bir kuyu taze Z ortamla 300 ul, 24 oyuklu bir plaka hazırlanması. ~ 500 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri. Zebra balığı, beyin-türevi Neurospheres 37 ° C'de iyi bir büyüme olmadığı,% 5 CO2 içinde 30 ° C'de bir inkübatör içinde kültürlendi hücreleri korumak.
İlköğretim Neurospheres 4. Nesil </ P>
- Nitro (div1) 'de 1 gün sonra, mikroskop altında yetişkin tüm beyin elde edilen tek bir hücre süspansiyonu gözlemlemek ve moloz de merkezinde biriken olup olmadığını not edin. Dikkatle orta yaklaşık 100 ul pipetleme herhangi bir enkaz kaldırmak (mümkünse daha az). Sonraki taze Z-ortamla 100 ul ekleyin. Tek hücre süspansiyonları, bu süre (Şekil 2A div1) de dikkat edilmelidir.
- In vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmek. ucu kesilmiş 1.000 ul pipet kullanarak, toplamak ve iyi bir yeni her bir kuyudan hücre süspansiyonu 250 ul aktarın. Tüm kuyulara taze Z-ortamla 250 ul ekleyin. kültür hücreleri genişleyen önce, iyi boyunca yukarı pipetleme ve aşağı çok yavaşça süspansiyon homojenize.
- Yineleyin in vitro aşağıdaki 4 gün (DiV4) için 4.1 ve 4.2 adımları tekrarlayın. neurospheres büyüklüğünde bir progresif artış vi olmalıdırDIV3 ve DiV4 (Şekil 2B ve C) merkezi ve iyi kenarlarında kişidir.
Not: Primer Neurospheres geçit veya multipotency değerlendirmek farklılaşması için işlenebilir. Alternatif olarak, farklılaşma sürecinde belirli genlerin rolünü tanımlamak için nucleofection ya lipo transfeksiyon 11 işlenebilir.
İlköğretim Neurospheres 5. Pasajlanması
- Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın ve mekanik olarak 1 ml pipet DiV4 Neurospheres ayrıştırmaları. çok hızlı hava kabarcığı oluşumu hücre ölümünü artmış olabilir aşağı yukarı pipetlemeyin ve vermeyin.
- Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve 24 oyuklu plakanın her oyuğuna primer kültür yüzey 250 ul 800 hücre / ul dağıtın.
- her bir kuyunun Z-ortamla 250 ul ekleyin.
- Aşama 4.2 belirtildiği gibi, in vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmekd 4.3.
İlköğretim Neurospheres 6. Farklılaşma
- 10 dakika süre ile,% 70 etanol içine daldırma ile kaplama gözlük sterilize, 12 oyuklu plakanın her oyuğuna yerleştirerek oda sıcaklığında daha sonra kuru örtücü camlar.
- yaygın genişletmek ve tüm cam kapak kapsayabilir şekilde kapak camın merkezde hücre dışı kaplama çözeltisi (aşama 1.11) 300 ul ekle. Daha sonra, (nemlendirilmiş hücre kültür inkübatörü kullanılarak), 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- İnkübasyondan sonra, hücre dışı Kaplama çözeltisini çıkarın ve 37 ° C'de 2 saat boyunca cam kapak kurutun.
- Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın. Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme tarafından (geniş uç ucu ile) 1 ml pipet ile kuyu başına tüm DiV4 birincil neurospheres ayırmak.
- Tohum daha önce hazırlanmış hücre dışı matris ile kaplanmış coverglasses 4 x 10 3 hücre / ml'lik bir hücre yoğunluğunda (6.1-6 adımında neurosphere hücre süspansiyonları ayrıştırılır.3) ve alt-tabakaya bağlı kadar% 5 CO2 içinde 30 ° C'de, en az 30 dakika boyunca devam edin. Daha sonra, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir şekilde,% 5 CO2 içinde 30 ° C'de 24 saat boyunca hücrelerin kültürlenmesi önce ön-ısıtılmış taze Z farklılaşma durumu ortamı (aşama 1.9) içinde 1 ml.
- Her iki gün, hücre farklılaşmasının zamanında Z-farklılaşma koşulu orta yarısı değiştirin.
İlköğretim Neurospheres 7. Gen Manipülasyonu
- 4 ° C'de 80 x g'de 8 dakika boyunca santrifüjlenerek DiV3-4 primer Neurospheres (adım 4.3) toplayın. Ticari oligonucleoatides lipozom transfeksiyon için hazırlanırken previouly 11 veya DNA plazmid vektörlerinin Nucleo-transfeksiyon nitelendirdi.
- Reaksiyon karışımı, 100 ul (82 ul nucleofactor çözeltisi ve ek 18 ul), 4 x 10 3 hücre / ul hücre yoğunluğunda yeniden süspanse neurosphere pelet.
- neurosphere asıltı Mix(1 ug / ml olarak plazmid stoklarının) seçim DNA plazmid vektörü 5 ul üzerinde. nucleotransfection bir Nucleofector küvet içine neurosphere / DNA karışımı, transferi ve Nucleofector kiti ile, imalatçının talimatlarına uygun olarak bir program Nucleofector seçin.
- Hemen nucleofection sonra hücrelere önceden ısıtılmış Z durumu ortam (1.10), 500 ml bir hacim kazandırmak ve yukarıda tarif edildiği gibi, hücre yenileme ve / veya farklılaşma özelliklerini incelemek için, transfekte Neurospheres plaka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yetişkin Zebra balığı Neurosphere Kültür Genel Şeması
Burada yetişkin zebrabalıkları beyninden yapılan bir neurosphere oluşturucu deneyinin protokolünün tüm adımları açıklamaktadır. İlk olarak, yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin zebra balığı tüm beyin veya bu telencephalon, tektum ve serebellum (Şekil 1A-C) gibi çeşitli parçalara beyin bölgelerinde, ya toplanmıştır. Yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin tek bir hücre süspansiyonu daha sonra yüzen ve kendini yenileyen Neurospheres (Şekil 1D, E) oluşturmak için kullanılmıştır. Son olarak, Neurospheres çoğalması ve Zebra balığı nöral kök / progenitör hücrelerin farklılaşması rollerini araştırmak amacıyla aşağı okuyan ve up-regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük olmayan kodlama RNA'ların 11 ifadesinin etkili olmuştur.
Zebra balığı birincil neurospheres birkaç pasajlar şu kendini yenileyebilir. Geçit 1 ve 2'de Neurospheres oluşturmak için, 5.1-5.4 6-8 günlük bir toplam, iki kez tekrarlandı adımlar. DiV2-4 kaynaktan, neurospheres büyüklüğü çapı yaklaşık 50 um çıkmıştır. İkincil ve üçüncül Neurospheres de geçit 1 ve 2'de, sırasıyla, (Şekil 2D) sonra elde edildi. Passage 3 at, zebra balığı neurospheres 50 mikron çapında kritik boyutta büyümeye ancak koyamadık ve bizim kültür koşulu yerine nöral kök hücreler 4 saf bir popülasyona göre kök / progenitör hücrelerin bir havuz seçer düşündüren, kendini yenilemeyi başaramadı .
neurosphere Farklılaşma
Her iki whol türetilen primer, sekonder ya da tertier NeurospheresYetişkin zebrabalıkları e, beyin ya da telencephalic arasında, serebellar ve tectal alanı farklılaşma potansiyelleri için test edildi. Farklılaşma durumları (DiVd1-DiVd3) in vitro 1 ila 3 gün arasında, yapışkan hücrelerin tek bir tabakası (Şekil 3A, B) gözlenmiştir. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, DiVd4 de, çıkıntılar ve glia hücreleri gibi aksonal immünohistolojik veya gen ekspresyonu ile görünür ve ayırt edildi nöral kök / progenitör hücrelerin ayırt ettiğini değerlendirmek, 11 analiz eder. Benzer şekilde, nöronlar ve glial hücreler farklı beyin bölgeleri (Şekil 3B, E) izole edilen nöral kök / progenitör hücrelerin ayırt.
Balığı Neurospheres Gen İfade Manipülasyon
Biz bütün zebrafish beyin-de nöronal ve glial farklılaşma üzerine miR-107 rolünü test ettik yarıp genç nöral kök / progenitör hücreleri (Şekil 4). Biz aksonal süreçler (Şekil 4A, B) anormal büyümesi ile gösterildiği gibi, anti-miR-107 tarafından miR-107 downregülasyonu, neurosphere oluşumunu ama değişmiş nöronal farklılaşma etkilemediğini göstermiştir. RT-PCR, gen ekspresyonu miR-107 inhibisyonu glial etkilemeden neuroblast işaretleyici Neurogenin-1 (NGN-1) ve MAP-2 ve α-tubulin akson özel moleküllerin her ikisi de bir artış ekspresyonuna neden olduğu doğrulamıştır hücre işaretleyici ifade (S-100, GFAP, olig2) (Şekil 4C). Bu duruma göre, MIR-107 ifade kazancı miR-107-mimik değerlendirmek, neuroblast- ve akson-spesifik bir işaretleyici ekspresyonu (Şekil 4D) bir azalmaya neden, in vitro olarak, miR-107 hareket eder, nöronal bir farklılaşma düzenleyici olarak zebra balığı nöron içinde 11.
/53617/53617fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Protokol safhaları şematik temsili prosedürler ve ilgili zamanlama (a, b), tek bir hücre süspansiyonu eldesi (C, tüm beyin veya telencephalic, tectal ve yetişkin zebra balığı beyin beyincik bölgelerinin ya diseksiyon içerir ), kayan neurospheres (D) neurospheres farklılaşması (E) üretimi.
Şekil 2: balığı beyin türevli Neurospheres oluşturulması. (A - C) tüm beyin türevli primer dalgalı neurospheres Örnek Faz kontrast görüntüleri 3. gün, günde 1 (div1, A) gözlendi (DIV3, B) ve 4 gün (DiV4, C). NE nispi sayısını temsil (D) GrafikPasajlar 1 ve 2'de urospheres geçit 2 sonra geçit 0. neurosphere sayısı ile karşılaştırıldığında, büyük ölçüde oluşumu olduğu Neurospheres azalmıştır. Ölçek çubuğu: 25 mikron.
. Şekil 3: balığı beyin türevli Neurospheres Farklılaşma (A - C, E) 1 içinde Z farklılaşma ortamında kültürlenmiştir tüm beyin türevli neurospheres Faz kontrast görüntüleri (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) ve 4 (C ve D, DiVd4) gün. Zebra balığı: 12 aylık Tg (DsRed GFAP) tüm beyin (E) Dorsal görünümü. telencephalon (Tel), tectum (Tec) ve beyincik (Cer) disseke ve gösterildiği gibi toplanmıştır. (D) Geçiş 0 (P0) de tectum, telencephalon ve beyincik türetilen DiVd4 neurospheres, 1 (P1 görüntüleri) Ve 2 (P2). Ölçek çubuğu: 25 mikron.
Şekil 4:. Belirtilen oligonükleotidler ile Div4 tedavi Div4d Neurospheres gösteren MiR107 manipülasyon Oluşan Neurospheres analizi (A) Faz kontrast görüntüleri. Üst panellerde siyah kutular alt panellerde büyütülmüş alanı gösterir. (B) Üst grafik veya miR107 olmadan oluşturulan neurospheres sayısının ölçümü temsil eder. Neurospheres büyüklükleri (20-30 mikron, 31-50 mikron çapında> 51 mikron) tarafından alt gruplara edilir. Alt grafik neurospheres tedavi ve alt yukarıdaki gibi gruplandırılmış gelen aksonal projeksiyonlar miktarının gösterir. Daha önce Div4 gösterilen oligonükleotitler ile tedavi edilen Div4d neurospheres ile gösterilen genlerin (C, D) QRT-PCR ifade analizi. veriler temsil± SEM, * p <0.05, n = 3 Scr demek: karıştırmak. Ölçek çubuğu: 25 mikron.
| Sorun | olası neden | Çözüm |
| çok ölü hücrelerden Kurtarma | enzimatik tedavi öncesi beyin hazırlanmasında Zaman gecikmesi | Diseksiyon kurmak emin olun ve medya balık ödün önce hazır (ayrıca sterilite kontrol, sıcaklık) |
| Sıkı papain tedavisi | Mekanik ayrıştırma doku çok kümeleri geride bırakarak önlemek için canlı bir tek bir hücre süspansiyonu üretmek için yeterince hassas, ama yeterince güçlü olması gerekir. inkübasyon / santrifüj dönemleri için önerilen süreleri ve sıcaklıkları saygı | |
| Neurospheres görünür ya da kötü büyümek değil | yanlış sıcaklık | c sağlayan 30 ° C'ye ayarlanmış olduğu inkübatör kontrolorrect sıcaklığı. |
| enkaz ile kaldırıldı Büyüyen küreler | her bir kuyu için, enkaz aspirasyon ortamı en iyi performans için yer alır. senin pipetle ortama girmemek | |
| Bazı reaktif bütünlüğü (B27 takviyesi, EGF, FGF) zayıflar | Bu bütünlük hücre büyümesi sınırlayıcı faktörlerin oluşturmaktadır. seri numarası kontrol edin ve yolu örnekleri korundu. / Çözülme önlemek kültürde günümüzde kullanılan örnek reaktif döngüleri dondurulabilir | |
| Tek tek hücrelerin varlığı | transfer modu / neurospheres genişleme çok sert | çok küreler kuyuda oluşan çünkü bu adım bir genişleme / seyreltme adımdır. tek hücre içine neurosphere ayrışmasını önlemek için transfer sırasında sert küre toplamaktan kaçının |
| matrigel üzerindeki hücrelerin yokluğu | Matrigel düzgün / çözülmüş seyreltildi değildi | -20 ° C ila Matrigel çözülme, 4 ° C'de en az 30 dakika gerektirir ve dikkatli bir şekilde zor akışlı Pipet kalır |
| matrigel yok yapışma | Hücre süspansiyonu hacmi Matrigel kat hücre kaplamasına olanak sağlayacak kadar küçük olması gerekir | |
| Hücre birikimi için daha fazla zaman tanımak (yukarı büyük hacimler kullanılması durumunda 2 saat kadar) | ||
| Taze farklılaşma ortamı çok soğuk | Hücre bağlantı ortamı değiştirilirken, farklılaştırma ortamı biriken hücreler termal şokunu önlemek için, 30 ° C de ısıtıldı gereken | |
| Kötü nucleofection | Ölü hücreler | nucleofection yaparken size hava kabarcıkları üretemeyen emin olun. Maxi-hazırlıklarını kullanarak yüksek kalitede DNA vektörleri kullanın. En az 1 - nucleofection sonra 2 saat, taze Z-farklılaşma durum orta ya da Z-durum orta kullanarak kültür ortamı değiştirin. |
| Birkaç pozitif neurospheres | Farklı boyutlarda Neurospheres düşük nucleofection yol açabilir. DIV2 ve DIV3 de kullanılması Neurospheres nucleofection için idealdir. Hücre yoğunluğu 4 x 10 3 Neurospheres ml -1 100 ml'lik bir reaksiyon aşmamalıdır. |
Tablo 1: Sorun Giderme Önerileri bunların üstesinden Protokol, Olası Sorunlar ve Çözümleri Her Step, listeleniyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün amacı nöral kök / progenitör hücrelerin hücresel ve moleküler özellikleri incelemek için izole etmek ve kültür yetişkin zebrafish beyin kaynaklı Neurospheres etmektir. Burada, yetişkin zebrafish beyin, multipotent nöral hücreleri seçmek ve üç sinir hücre tipleri, yani astrositler, nöronlar ve oligodendrositleri oluşturmak için nasıl rapor. tekrarlanabilir neurosphere oluşturan deneyi şimdiye kadar zebrabalıkları kurulmuş olmasaydı bu yana protokol son derece önemlidir.
Protokolde birkaç kritik adımlar saygı gerekir ve sorun giderme önerileri (Tablo 1) recapitutaled edilmiştir. İlk olarak, hücre ölümü yetişkin zebrafish beyin diseksiyonu ve tek bir hücre süspansiyonu prosedürü hem sırasında oluşur. hücre ölümü uzatmak sınırlamak için temiz ve keskin araçları kullanmak yanı sıra kesinlikle mevcut pro önerilen zamanlama ve inkübasyon sıcaklığı saygı esastırtokol. İkincisi, neurosphere kültür taze hazırlanmış medya ile ve dikkatli bir pipetleme tekniği ile yapılmalıdır. Üçüncü olarak, hücre yoğunluğu önerileri güvenilir yenileme veya neurosphere hücrelerinin farklılaşmasını elde etmek için takip edilmelidir. Bunu akılda tutarak, hücre kültürü teknikleri yetenekli kimse protokolünü kullanmak ve yetişkin zebrafish beyin kaynaklı neurospheres izolasyonu, kültürü ve gen manipülasyonu yürütmek gerekir.
Zebra balığı küre oluşturan deneyleri önceden memeli türlerinde 4 açıklanan aynı sınırlamalar muzdarip: kendi doğal beyin niş kendi izolasyonu takip değişmiş nöral kök / progenitör hücrelerin 1) davranışı; 2) Neurospheres kök hücrelerin bir homogenus popülasyonu değildir, ancak kök hücreleri, projenitör hücreler ve post-mitotik farklılaşmış hücreleri içerir. Bizim protokol aclonal neurosphere kültürleri oluşturur belirterek dahası değer. kültürlerin hücre yoğunluğuKüre oluşturucu deneylerinde önemli bir parametre kültürü, klonal yarı klonal ya aclonal olup örneğin, klonalite, belirlediği. Klon koşulları doğru karakterize ve kültürde mevcut kök ve progenitör hücrelerin farklı havuzları ölçmek için izin verir. Şimdiye kadar hücre klonalite deneyleri gerçekleştirmek mümkün olmamıştır ve biz diğer progenitör hücre havuzlarından sinir kök hücreleri ayırt edebilen önce kültür koşulları daha da optimizasyon gerekiyor.
Balığı neurosphere kültürleri deneyler büyük bir aralığı için de kullanılabilir. Nöral hücre kaderine (Şekil 4 ve 11) doku spesifik belirlenmesinde miR-107 fonksiyonunu değerlendirmek çalışmada gösterildiği üzere, nöron içinde gen ekspresyon analizinin yanı sıra gen ekspresyonunun değiştirilmesine izin verir. Ek uygulamalar neuroge nöral kök / progenitör genlerin rolü test etmek amacıyla, bu tür CRISPR / Cas9 sistemi olarak genom düzenleme stratejileri içerirNesis ve beyin onarımı 13. Son olarak, bizim protokol zebrabalıkları neurospheres nöronlar ve glia hücrelerinin bölgeye özgü özellikleri incelemek ve zebra balığı beynin 14 farklı ventriküler etki nöral hücre heterojenite hücresel ve moleküler temelini keşfetmek imkanı açılması, beynin farklı bölgelerinde elde edilebileceğini göstermektedir .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS 1x | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM/F12 1x | Life Technologies | 11330-032 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C6852-25g | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N-2 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 supplement (100x) liquid |
| HEPES | Life Technologies | 15630 | 1 M |
| D-(+)-Glucose 45% | Sigma | G8769 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Insulin | Sigma | I5500-50 mg | |
| DNAse | Sigma | DN25-10mg | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Matrigel | Becton Dickinson | 356234 | |
| PFA | TCI | P0018 | |
| PBS | AmericanBio | AB11072-04000 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma | A5040 | stock solution of 4 mg/ml. |
| Trycold gel | Sigma | TGP8 | gel pack |
| Amaxa Basic Nucleofector Kit | Lonza | VPI-1004 | |
| Trypan blue stain | Life Technologies | 15250061 |
References
- Rietze, R. L., Reynolds, B. A. Neural stem cell isolation and characterization. Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).
- Winter, M., et al. Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing. Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes. Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).
- Chen, Z., et al. Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio). PloS one. 8, e57539 (2013).
- Hinsch, K., Zupanc, G. K. Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis. Neuroscience. 146, 679-696 (2007).
- Ristori, E., et al. A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis. Dev Cell. 32, 546-560 (2015).
- Louis, S. K., SIegel, A. C. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods. Methods Mol Bio. 740, (2011).
- Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J.
- Marz, M., et al. Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon. Glia. 58, 870-888 (2010).
