流型引导的高密度条形码抗体微阵列制备

摘要

本方案概述了大规模、多重二维DNA或抗体阵列的制备方法，该阵列在细胞信号传导研究和生物标志物检测中具有潜在应用价值。

摘要

抗体微阵列作为一种成熟的技术，目前正面临其他一些已建立或新兴的高通量技术的挑战。在本报告中，我们通过采用一种新颖的制造方法并引入新的功能，对抗体微阵列技术进行了革新。我们所构建的高密度抗体微阵列，是通过单链DNA的垂直定向流动图案化，并借助DNA-抗体偶联物介导的后续转化而实现的。本方案概述了流动图案化DNA、制备与纯化DNA-抗体偶联物，以及评估所制备微阵列质量的关键步骤。该方法在均匀性和灵敏度方面可与传统微阵列相媲美，且无需依赖微阵列打印机，可在大多数研究实验室中完成。另一主要优势在于，我们的微阵列单元尺寸比打印阵列小10倍，当与通用微芯片设计结合时，能够实现对单个细胞来源功能蛋白的分析。这种条形码技术可广泛应用于生物标志物检测、细胞信号转导研究、组织工程以及多种临床应用领域。

引言

抗体微阵列已广泛应用于蛋白质组学研究数十年，用于检测靶向蛋白质的存在，包括蛋白质生物标志物^1-3。尽管该领域目前正面临质谱（MS）等其他高通量技术的巨大挑战，抗体微阵列仍具有广阔的应用空间，主要原因是这类设备具有简单的数据解读方式，并易于与其他检测方法联用。近年来，将微阵列集成到微芯片支架中，为抗体微阵列的发展带来了新的机遇^4-7。例如，集成于单细胞微芯片中的条形码微阵列已被用于细胞间通讯研究^8,9。该技术相较于其他现有微阵列技术具有显著优势：其阵列单元尺寸为10–100 μm，远小于传统微阵列常用的150 μm。更小的阵列单元通过系统化的流体图案化方法构建而成，从而形成紧凑型微阵列，能够检测单个细胞分泌的蛋白质及细胞内蛋白质。另一优势在于其简单且无需专用仪器的实验装置。这一点尤为重要，因为大多数实验室和小型公司可能无法获得微阵列核心设施。此类条形码抗体微阵列具有更高的检测通量，可用于单细胞水平的高度多重化检测，同时实现与传统夹心酶联免疫吸附测定（ELISA⁸）相当的高灵敏度和特异性。该技术已在检测胶质母细胞瘤^9-11、T细胞¹²以及循环肿瘤细胞¹³的蛋白质方面得到广泛应用。此外，条形码DNA微阵列单独也被用于神经元和星形胶质细胞的精确定位，以模拟脑组织的in vivo组装结构¹⁴。

....

方案

警告：本方案中使用的多种化学品具有刺激性，接触皮肤后可能造成危害。在进行本方案前，请查阅材料安全数据表（MSDS），并穿戴适当的个人防护装备。步骤 (1.1.1) 中使用的piranha溶液具有强腐蚀性，配制时应将过氧化物缓慢加入酸中，同时搅拌。操作该溶液时必须极其谨慎，应在通风橱中进行，并佩戴适当的眼部防护装备和耐酸手套。三甲基氯硅烷（Trimethylchlorosilane, TMCS）是一种具有腐蚀性且易燃的化学品，用于步骤 (1.1.6) 之后的可选步骤中。操作该化学品时应在通风橱中进行。

注意：条形码玻片的制备和关键的流体图案化操作应在洁净室中进行，以最大限度减少颗粒物污染。灰尘颗粒可能堵塞PDMS模具的端口和微通道，从而干扰流体图案化过程。

1. 一维DNA条形码芯片的构建

1. 条形码流动图案SU-8母版的制备
   注意：垂直流动图案的图纸（图1A-B）使用计算机辅助设计（CAD）软件创建，并在铬版掩模上呈现。掩模的透明区域对应于SU-8母版的结构特征。
   1. 将一片硅片（直径100 mm）在3 H₂SO₄: 1 30% H₂O₂（piranha溶液）混合液中彻底清洗，并加热至96 °C。随后用去离子水和异丙醇冲洗硅片，并用氮气吹干。

结果

PDMS模具的设计（图1A-1B）使用CAD软件（AutoCAD）绘制。所示的两种设计均包含用于流动图案化的通道，一个为水平方向，另一个为垂直方向。每种设计的左右部分呈对称结构；任一侧均可作为入口或出口。20条通道中的每一条均从一端蜿蜒延伸至另一端。每种设计均被打印在铬版光掩模上（图1C）。图中显示了在晶圆上制备的SU-8模具母版（图1D）。为了实现PLL或DNA的流动图案化，将PDMS模具连接至氮气气流装置（图1E）。

本方案中使用了三个流体图案化步骤。第一步是将聚-L-赖氨酸（PLL）固定在玻璃基底上，随后的两个步骤均用于引入寡核苷酸溶液。在表1中列出了溶液1-3的寡核苷酸组成。每种寡核苷酸的工作浓度为50 µM，每种溶液的总体积为39 µl。这些溶液通过混合13 µl的每种寡核苷.......

讨论

流道图案设计是制备二维（2-D）微阵列的第一步关键步骤。为了在玻璃基底上生成两个相互重叠的DNA图案，第一次设计的通道特征应与第二次设计的通道特征相互垂直（图1A-B）。设计还需考虑微阵列的后续应用。在单细胞分析中，微阵列用于检测被封闭在微腔室中的单个细胞所表达的蛋白质，因此通道尺寸需与对齐于二维（2-D）阵列的微腔室相匹配。每个设计均被绘制于光掩模上，并采用标准光刻技术在硅片上的SU-8材料中加工出通道结构（图1C-D）。该结构作为聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制的母模。母模制备完成后，将其键合至多聚赖氨酸（PLL）包被的载玻片上，并连接氮气气流装置（图1E）。我们所使用的装置结构简单，且易于整合到任何具备压力可控氮气源的实验室中。我们采用多个低成本的三通阀连接至氮气罐组成气路系统。图案化过程中，气流压力必须保持在较低水平（0.5–1 psi），以避免玻璃载片从模具上发生剥离。PDMS模具中的漏气会破坏图案的完整性。

本方案中的DNA流动图案化步.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Sylgard 184 硅酮弹性体基础剂	Dow Corning	3097366-1004
Sylgard 184 硅酮弹性体固化剂	Dow Corning	3097358-1004
SU-8 2025 光刻胶	MicroChem	Y111069
硅晶圆	University Wafers	452
聚-L-赖氨酸包被玻片	Thermo Scientific	C40-5257-M20
寡核苷酸	Integrated DNA Technologies		*由 Integrated DNA Technologies 定制订购，详见 表 2。
聚-L-赖氨酸粘附储备液	Newcomer Supply	1339
双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯  (BS3)	Thermo Scientific	21585
1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Quality Biological	114-058-101
Äkta Explorer 100 快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 系统	GE (Amersham Pharmacia)	18-1112-41
Superose 6 10/300 GL 柱	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
捕获抗体	多种	多种	*抗体选择取决于具体应用
琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺 (S-HyNic)	Solulink	S-1002
琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺 (S-4FB)	Solulink	S-1004
N,N-二甲基甲酰胺	Sigma-Aldrich	227056
柠檬酸，无水	Acros	42356
氢氧化钠	Fisher Scientific	S318
Amicon Ultra 超滤离心管，10 kDa 截留分子量	EMD Millipore	UFC201024
旋涂仪	Laurell Technologies	WS-650-MZ
带推杆的活检打孔器（1.0 mm 直径）	Ted Pella, Inc.	15110-10
金刚石刻划笔（Style 60）	SPI supplies	6004
三甲基氯硅烷	Sigma Aldrich	92361