Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.
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Artigo de método
Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas
Neste artigo
Resumo
Resumo
As capacidades de diferenciação de células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) permitem uma aplicação terapêutica potencial para terapias de substituição de células. Terminalmente tipos de células diferenciadas pode ser utilizado para o tratamento de várias doenças degenerativas. Diferenciação in vitro destas células no sentido de tecidos do pulmão, fígado e pâncreas requer como um primeiro passo na geração de células da endoderme definitivas. Este passo é para a posterior diferenciação em direcção tipos de células terminalmente maturados tais como células beta produtoras de insulina, hepatócitos, ou outros tipos de células derivadas de endoderme limitante da velocidade. As células que são comprometidas com a linhagem endoderme altamente expressar uma grande variedade de factores de transcrição, tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA, e o receptor da superfície CXCR4. No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente. Aqui, nós descrevemos um método para a purificação de uma população de células CXCR4 + após a diferenciaçãona DE usando microesferas magnéticas. Esta purificação remove adicionalmente células de linhagens indesejados. O método de purificação suave é rápido e fiável e pode ser usado para melhorar as aplicações a jusante e diferenciações.
Introdução
As células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) têm a capacidade de se diferenciar em virtualmente qualquer tipo de células do corpo humano. Assim, os protocolos in vitro de diferenciação podem ser usadas para gerar numerosos tipos de células, tais como adultos cardiomiócitos 1, 2 hepatócitos, células beta 3, 4 ou epitelial de pulmão de células neuronais 5. Isso faz com que os CES uma ferramenta valiosa para o tratamento potencial de várias doenças degenerativas 3.
A diferenciação in vitro dos CES no sentido de tecidos ....
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Protocolo
1. Diferenciação de ESC Humano para o Endoderma Definitive
- Cultivar as células estaminais embrionárias humanas (CES) em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Revestimento um novo 6 poços da placa de cultura de células com 1 ml de uma matriz de membrana basal e incubar a cultura-louças durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. Para obter detalhes específicos por favor, ligue com as instruções dos respectivos fabricantes.
- Confirmar que os CES humanas cultivadas atingiram 80% -90% de confluência ao microscópio utilizando uma ampliação baixa (por exemplo, 4X). Aspirar o meio das cavidades por sucção fora o meio c....
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Resultados
Após a diferenciação CES sofrer alterações drásticas no gene e a expressão da proteína. A Figura 1 representa genes marcadores típicos que podem ser utilizados para verificar uma diferenciação endoderme bem sucedida. Alvos principais para a análise de expressão gênica são GSC, Foxa2 e Sox17. Em uma análise de expressão gênica relativa especialmente Foxa2 e Sox17 são aumentados em> 2.000 vezes quando compa.......
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Discussão
protocolos de diferenciação utilizados actualmente raramente resultam em células diferenciadas 100%. Por razões que ainda têm de ser abordadas algumas células resistir ao processo de diferenciação. Dependendo da eficiência do protocolo utilizado diferenciação e a propensão do CES alinhar um certo número de células pluripotentes residuais são vulgarmente observadas mesmo após a diferenciação em endoderme definitiva. Estas células residuais pode prejudicar diferenciações a jusante ou uma análise mais aprofundada, como tra.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
A assistência técnica hábil de Jasmin Kresse é reconhecido agradecimento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linha de células-tronco embrionárias humanas Hues8 | Harvard Departamento de células-tronco e biologia | Linha celular adequada para geração de endoderme | |
| Linha de células-tronco embrionárias humanas Hes3 | ES Cell International | Linha celular adequada e robusta para geração de endoderme | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC meio de cultura |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, humano | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| Separador OctoMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | campo magnético |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | inibidor de ROCK |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Reagente de Dissociação Celular Suave | Stemcell Technologies | 7174 | Sem enzimas solução de passagem, alternativa: Matriz de tripsina / EDTA |
| * Matriz | de 354277 | Corning | < br / > * resolver e armazenar em alíquotas a -80 ° C conforme descrito no manual do fornecedor. Após o uso, descongele no gelo, dilua em 25 ml de nocaute gelado DMEM/F-12. Adicione 1 ml a cada poço de uma placa de 6 poços e incube por 45 min em temperatura ambiente. Remova o matrigel e use imediatamente. |
| Separador MACS | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| Columns Miltenyi Biotec | 130-042-302 | ||
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga | Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta | Life Technologies | ||
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt | Life Tecnologias | ||
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg | Life Technologies | ||
| SOX17 Ensaio TaqMan | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg | Life Technologies | ||
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag | Life Technologies | ||
| Humano POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg | Life Technologies | ||
| Humano POU5F1 REV ctgcagtgtgggtgtcgggca | Life Technologies | ||
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc | Life Technologies | ||
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct | Life Technologies | ||
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc | Life Technologies | ||
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g | Life Technologies | ||
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c | Life Technologies | ||
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g | Life Technologies | ||
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a | Life Technologies | ||
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t | Life Technologies | ||
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R& D Systems | AF1924 |
Referências
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P. W., Wu, S. M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al.
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Reimpressões e permissões
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