利用基因编码的基于FRET的胆汁酸传感器实时监测细胞内胆汁酸动态变化

摘要

我们提供了一种详细的实验方案，利用基因编码的BAS FRET传感器在活细胞中研究胆汁酸动态。该胆汁酸传感器是一种独特的工具，可用于在多种细胞类型中研究胆汁酸转运及其调控以及FXR的激活。

摘要

荧光共振能量转移（FRET）已成为监测单个细胞中蛋白质折叠、相互作用和定位的有力工具。基于FRET原理的生物传感器实现了在活细胞中以高时间和空间分辨率实时可视化亚细胞信号事件。本文介绍了基因编码的胆汁酸传感器（BAS）的应用，该传感器由两个荧光团与法尼醇X受体配体结合域（FXR-LBD）融合而成，从而形成一种可被多种胆汁酸及其他（合成）FXR配体激活的胆汁酸传感器。该传感器可靶向至不同的细胞区室，包括细胞核（NucleoBAS）和细胞质（CytoBAS），以实现对局部胆汁酸浓度的测量。该方法无需使用荧光标记或放射性核素，即可快速、简便地定量细胞内胆汁酸的流入、流出以及内源性胆汁酸的亚细胞分布。此外，BAS FRET传感器还可用于监测FXR配体的结合情况。最后，我们展示了该FRET生物传感器可与其他光谱不同的荧光团成像相结合，从而在同一细胞中联合分析细胞内胆汁酸动态变化与i）目标蛋白的定位和/或丰度，或ii）细胞内信号传导过程。

引言

荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）被广泛用于以高时间和空间分辨率深入理解活细胞中的细胞功能¹。在FRET过程中，激发态的供体荧光团的能量会转移至受体荧光团。FRET效率高度依赖于供体与受体荧光团之间的距离及其相对取向，因此可灵敏地反映影响这两个荧光团的构象变化。该现象被用于构建基于FRET的生物传感器，以实现对小分子的成像。其浓度变化可通过受体与供体荧光团发射光强度比值的升高或降低进行监测²。例如，基于FRET的钙离子生物传感器可实现对活细胞内游离钙离子浓度的快速且稳定的检测³。基于FRET的生物传感器其他优势还包括可在单个活细胞中进行成像、具有非侵入性、并可靶向不同类型的细胞及细胞器⁴。

细胞内胆汁酸动态的许多方面目前仍知之甚少。例如，关于结合型与非结合型胆汁酸转运调控机制的研究仍十分有限。现有的监测该转运过程的技术主要依赖基于荧光素酶的报告系统、放射性标记的胆汁酸或荧光标记的胆汁酸类似物。其中，后者需要对胆汁酸进行化学修饰，可能影响其原有性质；基于荧光素酶的报告系统则时间分辨率较差。此外，这些技术通常导致样本损耗，且不适用于单细胞成像。因此，若能采用基于FRET生物传感器的方法实现活体单细胞水平的转运活性成像将具有显著优势，尤其是该方法具备比例检测（ratiometric detection）的优点⁵....

方案

1. 瞬时转染

注意：CytoBAS 和 NucleoBAS（参见材料表）已在多种细胞类型中成功使用（U2OS、Huh7、HepG2、H69、MDCK 和 HEK293T 细胞）。使用该传感器的主要要求是其必须在细胞内表达，因此编码该传感器的 DNA 需进入细胞。

1. 从一个80%汇合度的25 cm² 培养瓶中收集细胞。将细胞悬浮于适合特定细胞系的完全培养基中（U2OS和Huh7细胞使用含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素的培养基）。
2. 以所需密度将细胞接种至无菌的8孔腔载玻片（0.8 cm²）中。实验当天细胞汇合度应达到亚汇合状态（60–80%），但此条件并非必需。
3. 每孔加入完全培养基至终体积400 µl。静置培养24小时，使细胞贴壁。
4. 在无菌离心管中配制转染混合液：加入0.5 µg NucleoBAS或CytoBAS DNA至100 µl无血清/抗生素的培养基中，充分涡旋混匀。随后加入转染试剂，并通过涡旋混合。转染试剂的选择取决于细胞类型，高效试剂需根据细胞种类优化，可能需要预先测试。
   1. 例如，可使用2.5 µl 1 mg/ml聚乙烯亚胺（PEI），室温孵育DNA/PEI混合物15分钟。
5. 将转染混合液以滴状加入细胞中，并用手轻轻晃动培养板以混匀。对于约9.6 cm....

结果

本研究中展示的FRET-BAS传感器基于法尼醇X受体（FXR）的配体结合结构域（LBD-FXR），其上连接有两种荧光蛋白（citrine和cerulean）以及一个LXXLL基序。该传感器可用于在活细胞中以高时空分辨率研究胆汁酸的转运过程（图1A）。通过对citrine和cerulean引入突变，促进分子内复合物的形成（图1B）。胆汁酸及其他FXR配体结合至FXR后，通过构象变化改变citrine与cerulean之间的距离。在活体哺乳动物细胞中，这导致FRET效率升高（citrine信号增强，cerulean信号减弱）（图1C、图1D）。在利用共聚焦显微镜进行的活细胞定量强度型FRET实验中观察到，表达缺乏胆汁酸转运蛋白的NucleoBAS的U2OS细胞经牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA，30 µM）处理后未出现FRET变化，而经GW4064（5 µM）处理后，其平均citrine/cerulean比值显著升高（图1C

讨论

本文介绍了一种新型遗传编码胆汁酸传感器的详细使用方案，该传感器能够监测活细胞中胆汁酸转运的时空动态。该生物传感器由青色荧光蛋白（cerulean）和黄色荧光蛋白（citrine）组成，二者与FXR-LBD融合，从而形成基于荧光共振能量转移（FRET）的胆汁酸传感器（BAS）。

当具备细胞培养以及FACS或（共聚焦）显微镜操作的基本经验时，胆汁酸传感器的使用相对简单且便捷。然而，某些方面可能需要进行故障排查。当将胆汁酸传感器与胆汁酸转运蛋白联合使用时，建议使用经活性炭过滤处理的血清培养细胞。活性炭可通过吸附作用进一步降低血清中的胆汁酸水平。特别是在表达诸如NTCP等摄取转运蛋白的情况下，这一点至关重要，可防止在培养过程中传感器被饱和，因为这是实验中传感器灵敏度降低最常见的原因。因此，研究人员构建了另一种传感器（NucleoBAS N354K/I372V），其含有可改变胆汁酸敏感性的突变，从而扩大了动态检测范围⁸。为了判断传感器是否已经饱和，可将实验细胞中的黄荧光蛋白/青色荧光蛋白（citrine/cerulean）比值与未表达任何胆汁酸转运蛋白的对照细胞中的比值.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CytoBAS	Addgene	62860
NucleoBAS	Addgene	62861
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Lonza	BE12-614F	高糖，不含L-谷氨酰胺
青霉素-链霉素（pen/strep）	Lonza	17-602E
L-谷氨酰胺（200 mM）	Lonza	17-605E
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	102-70
胰蛋白酶-EDTA（10倍浓度）	Lonza	CC-5012
T-25 细胞培养瓶	VWR international	392-0253	层粘连蛋白包被
T-175 细胞培养瓶	VWR international	392-0238	层粘连蛋白包被
6孔板	VWR international	734-0229	聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白包被
10 cm 培养皿	VWR international	392-0243	层粘连蛋白包被
二乙氨基乙基（DEAE）-葡聚糖	Sigma-Aldrich	D9885
聚乙烯亚胺（PEI）	Brunschwig	23966-2
G418（遗传霉素）50 mg/ml	Invitrogen	10131-027
潮霉素B，50 mg/ml	Invitrogen	10687-010
克隆环（6 × 8 mm）	Bellco	2090-00608
L-15 莱博维茨培养基	Invitrogen	21083-027	不含酚红
聚苯乙烯圆底管（5 ml），流式管	Falcon BD	352008	无盖，非无菌
Falcon 2,063 管（5 ml）	Falcon BD	352063	snap cap，无菌
Nunc Lab-Tek 8孔盖玻片	Thermo scientific	155409	无菌
活性炭处理的FBS	Life technologies	12676011
GW4064	Sigma-Aldrich	G5172
TCDCA	Sigma-Aldrich	T6260
CDCA	Sigma-Aldrich	C9377
其他化学品	Sigma-Aldrich	n.v.t.