تصف هذه المخطوطة كيف يوفر توصيل الجينات المحلية بوساطة النواقل الفيروسية طريقة جذابة للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا في الجهاز العصبي المركزي. يحدد البروتوكول جميع الخطوات الحاسمة لإجراء حقن ناقل فيروسي في المادة السوداء للفئران لتطوير نموذج حيواني قائم على النواقل الفيروسية لمرض باركنسون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تطوير وبناء الجرذ نموذج ألفا synuclein لمرض باركنسون عن طريق حقن المجسم من النواقل الفيروسية المؤتلف المرتبطة الغدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
من أجل دراسة المسارات الجزيئية من مرض باركنسون (PD) ووضع استراتيجيات علاجية جديدة والمحققين العلمي تعتمد على النماذج الحيوانية. وقد أدى تحديد الجينات المرتبطة PD إلى تطوير نماذج PD الوراثية. الأكثر المعدلة وراثيا نماذج الماوس α-SYN تتطور تدريجيا α-SYN علم الأمراض ولكن تفشل في عرض واضحة فقدان الخلية الدوبامين والعجز السلوكية التي تعتمد على الدوبامين. تم التغلب على هذه العقبة الاستهداف المباشر من المادة السوداء مع النواقل الفيروسية overexpressing الجينات المرتبطة PD. توصيل الجينات المحلي باستخدام ناقلات فيروسية يوفر وسيلة جذابة للتعبير عن الجينات المحورة في الجهاز العصبي المركزي. يمكن استهداف مناطق محددة في الدماغ (مثل المادة السوداء)، والتعبير يمكن أن يتسبب في الإعداد الكبار ومستويات التعبير العالية يمكن أن يتحقق. وعلاوة على ذلك، نظم ناقلات مختلفة على أساس مختلف الفيروسات يمكن استخدامها. يحدد البروتوكول كل خطوات حاسمة لأداء ناقل فيروسيالحقن في المادة السوداء من الفئران لتطوير ألفا synuclein نموذج حيواني ناقلات القائم على الفيروسي لمرض الشلل الرعاش.
المقدمة
لدراسة الفيزيولوجيا المرضية لPD ووضع استراتيجيات علاجية جديدة، هناك حاجة ملحة لنماذج حيوانية تشبه عن كثب أمراض الأعصاب، علم وظائف الأعضاء والحركية أعراض PD البشري. ارتفاع القيمة التنبؤية، وأفضل ونحن يمكن أن تترجم علاجات جديدة من النماذج الحيوانية للمرضى.
أدى اكتشاف ألفا synuclein (α-SYN) كأول جين بارك في عام 1997 لتطوير النماذج الأولى PD الوراثية. وقد تم إنشاء العديد من الفئران المعدلة وراثيا overexpressing البشري من النوع البري (WT) أو متحولة (A30P، A53T) α-SYN على مدى العقد الماضي. وقد أثبتت مستويات overexpression α-SYN أن تكون حاسمة في تطور علم الأمراض. أيض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتم تنفيذ جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس من 24 نوفمبر 1986 (86/609 / EEC) والتي وافقت عليها لجنة أخلاقيات العلوم الحيوية في جامعة لوفان (بلجيكا).
1. المؤتلف AAV إنتاج وتنقية
ملاحظة: تم تنفيذ rAAV إنتاج النواقل وتنقية من قبل لوفين الفيروسية المتجهات الأساسية (LVVC) كما هو موضح سابقا (17).
- لفترة وجيزة، transfect subconfluent منخفضة (<50) مرور ملتصقة خلايا كلوة 293T باستخدام 25kD الخطية polyethylenimine....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وصفت الخطة الشاملة للتجربة في الشكل 1
overexpression rAAV 2/7 بوساطة من A53T α-SYN يدفع العجز الحركي تعتمد على الدوبامين.
لدراسة ما إذا كان مستوى α-SYN overexpression غير كافية لإحداث العاهات الحركية في الفئران، ونحن تعرض الفئران لاختبار اسطوانة لتقييم استخدام forelimb العفوي (الشكل 3A). من .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول. عيار ناقلات فضلا عن نقاء ناقلات يؤثر بشكل مباشر على نتائج المظهرية للنموذج. التتر ناقلات المفرطة أو دفعات ناقلات النقاء كاف قد يؤدي إلى سمية غير محددة. ولذلك، فإن استخدام دفعات ناقلات جودة عالية وناقلات الرقابة المناسبة أمر لا غنى عنه. وعلاوة على ذلك، وتحديد المواقع بدقة من رأس فأر في إطار التجسيمي وتحديد دقيق لإحداثيات ضروري في استهداف المادة السوداء. بعد حفر ثقب في الجمجمة في موقع الحقن، فمن المهم لادخال الإبرة مباشرة الى الدماغ الفئ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب تعلن أنه لا يوجد نزاع قائم أو محتمل في المصالح.
شكر وتقدير
الكتاب أشكر يوريس فان Asselberghs وآن فان Santvoort للحصول على المساعدة الفنية الممتازة. وقد تم تمويل البحث من قبل IWT-VLAANDEREN (IWT الثانوي المهني / 80020)، وFWO VLAANDEREN (G.0768.10)، من خلال برنامج EC-FP6 "ديمي" (LSHB-CT-2005-512146)، ومشروع MEFOPA FP7 RTD (الصحة -2٬009-241٬791)، وبرنامج FP7 "INMiND" (الصحة-F2-2011-278850)، جامعة الكويت لوفين (قوات الاحتلال الإسرائيلي-KP / 07/001، OT / 08 / 052A، IMIR PF / 10/017)، و مؤسسة MJFox (التحقق من صحة هدف عام 2010). A. فان دير بيرين وجيم Casteels هي زملاء ما بعد الدكتوراه من صندوق الفلمنكية البحث العلمي. ك فان Laere هو زميل السريرية كبار من صندوق الفلمنكية البحث العلمي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنثى فئران ويستار بعمر 8 أسابيع | جانفيير | / | 200-250 جم |
| كيتامين (نيماتيك) يوروفيت | لصحة | 804132 | |
| ميديتوميدين (مهجع) | أوريون فارما / يانسن لصحة | 1070-499 | |
| ؛ مخدر موضعي لفروة الرأس والأذنين: Xylocaï ني 2٪ جل | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Bupr & eacute; نورفين (طبيب بيطري) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1٪ isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| إطار رأس تجسيمي | Stoeling | / | |
| Hamilton حقنة (مقياس 30 -20 مم -PST 2) | هاميلتون / الفلتر | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma / Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T & alpha ؛ -SYN vector | LVVC ، KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| الصوديوم penttobarbital (Nembutal) | Ceva Sant & eacute ؛ | 0059-444 | |
| ميكروتوم | ميكروم | HM650 | |
| الأرنب متعدد النسيلة synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1: 5,000 |
| أرنب متعدد النسيلة TH Ab | Chemicon | 152 | 1: 1,000 |
| كاشف أوكسي أورثوسيليكات FOCUS 220 التصوير المقطعي | القائم على Lutetium Siemens / Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | في المنزل | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 ملغ/كغ i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| مصل الجنين | الأبقار Life Technologies | N & deg; 10270-106 | |
| 25 kD خطي بولي إيثيلينيمين (PEI) | Polysciences/ | ||
| OptiPrep كثافة التدرج المتوسط: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N & deg; 51985-026 | |
| Paxinos 1 Watston steretactic Atlas ، الطبعة الرابعة | Elsevier | / |
المراجع
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implic....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
