Summary
هنا نقدم الرواية كا 2+ -imaging النهج باستخدام مراسل إضاءة الحيوية. يستخدم هذا النهج تنصهر بناء GFP-aequorin الذي يربط الكالسيوم 2+ وتنبعث الضوء، مما يلغي الحاجة لالإثارة الخفيفة. كبير يسمح هذا الأسلوب التصوير المستمر الطويل، والوصول إلى هياكل الدماغ العميقة وقرار زمنية عالية.
Abstract
وظيفية في مجال التصوير فيفو أصبح نهجا قويا لدراسة وظيفة وعلم وظائف الأعضاء من خلايا المخ وهياكل الفائدة. في الآونة الأخيرة تم تطوير طريقة جديدة لكا 2+ -imaging باستخدام مراسل إضاءة الحيوية GFP-aequorin (GA). وتعتمد هذه التقنية الجديدة على التحام GFP وaequorin الجينات، مما ينتج عنه قادرة جزيء من الكالسيوم ملزمة و- مع إضافة coelenterazine العامل المساعد ل- انبعاث الضوء الساطع التي يمكن رصدها من خلال جمع الفوتون. تم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا تحمل جينات GFP aequorin لكل من الفئران وذبابة الفاكهة. في ذبابة الفاكهة، فقد تم وضع الجينات GFP aequorin تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير GAL4 / UAS السماح للتعبير استهدافا والتصوير داخل الدماغ. وفيما بعد تبين أن هذه الطريقة لتكون قادرة على الكشف عن كل من الداخل كا 2+ -transients والكالسيوم 2+ -released من مخازن الداخلية. الأهم من ذلك أنها تتيح لمدة أكبر في تسجيل مستمر، والتصوير في أعماق أكبر في الدماغ، وتسجيلها في قرارات الزمنية عالية (تصل إلى 8.3 مللي ثانية). هنا نقدم الطريقة الأساسية لاستخدام التصوير إضاءة الحيوية لتسجيل وتحليل الكالسيوم 2+ -activity داخل الهيئات الفطر، هيكل مركزي في التعلم والذاكرة في الدماغ الطاير.
Introduction
وكانت الزخرفة وظيفة من النشاط في الدماغ وهياكلها الأساسية منفصلة فترة طويلة مجال الدراسة المكثفة في مجال علم الأعصاب. ربما بعض من أقرب النهج الناجحة المستخدمة لمعالجة هذه المسألة كان القياس الفسيولوجي المباشر للتغيير في النشاط الكهربائي - طرق لكن البديلة التي تسمح التصوير الحي للتغيرات في تركيز الجهد، ودرجة الحموضة أو الكالسيوم (كبديل للنشاط) قد جلبت قدرات إضافية ل دراسة نشاط الخلايا العصبية 1. تقنيات التصوير تحمل مجموعة واسعة من المزايا مثل انخفاض الغازية والقدرة على رصد النشاط داخل هياكل الدماغ كله. وعلاوة على ذلك في الحيوانات مع علم الوراثة الانقياد بما في ذلك ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة، وضع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا، مثل CAMELEON، GCaMPs وغيرها 1 قد يسمح للباحثين لرصد الخلايا العصبية واحدة، السكان العصبية والدماغ كلهالهياكل. في حين أن أكثر أساليب التصوير الكالسيوم الفلورسنت التقليدية باستخدام GCaMPs (GFP تنصهر إلى كالمودولين) أو الحنق (CFP وYFP تنصهر كالمودولين) وقد ثبت أن تقنيات مفيدة توفير القرار المكانية والزمانية جيدة، وعملية الكامنة وراء الإثارة الخفيفة تولد بعض القيود على ه التجريبية التطبيقات. ونظرا لطبيعة الإثارة الخفيفة، تألق ذاتي، صور تبيض والضيائية تنتج حتما، مما يحد بالتالي عمق الهياكل التي يمكن تصويرها، ومدة التسجيلات فضلا عن الاستمرارية في الوقت الحقيقي من التسجيل. وبعبارة أخرى، يجب في كثير من الأحيان أن يؤديها التسجيلات بشكل متقطع لتجنب هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها.
وبسبب هذه التحديات، وقد وضعت وسائل بديلة إضافية من التصوير الكالسيوم. إحدى الطرق الواعدة هو التصوير إضاءة الحيوية التي تعتمد على الضوء المنتجة من خلال رد فعل الأنزيمي بعد الكالسيوم ملزمة. Bioluminescenلا يتطلب تي التصوير الإثارة الخفيفة وبالتالي لا تواجه نفس الصعوبات التي والتصوير الكالسيوم التقليدية. مراسل إضاءة الحيوية Aequorin - معزولة عن Aequorea فيكتوريا، ونفس قنديل البحر الذي GFP كان isolated- أيضا يتحد الكالسيوم عن طريق الهياكل يدها ثلاثة EF ويخضع لتغيير متعلق بتكوين، مما يؤدي إلى أكسدة coelenterazine العامل المساعد والإفراج عن الضوء الأزرق (λ = 469 نانومتر) 2،3. Aequorin لها قابلية منخفضة جدا من الكالسيوم (K د = 10 ميكرومتر) مما يجعلها مثالية لمراقبة العابرين الكالسيوم لأنها تنتج الضوضاء في الخلفية قليلا جدا ولا تتداخل مع نظام التخزين المؤقت الكالسيوم داخل الخلايا 4. على الرغم من aequorin تم استخدامها سابقا لمراقبة عملية تحريض العصبي في البيض القيطم 5 ضوء المنتجة خافت جدا لاستخدامها في التصوير في الوقت الحقيقي من نشاط الخلايا العصبية. في محاولة للتصدي لهذا التحدي، فيليب تص &# 251؛ ولوزملاؤه في معهد باستور خلق بناء الوراثي التفجير GFP وaequorin الجينات، ومحاكاة للدولة الأم داخل قناديل البحر 4. هذا المنتج الانصهار الجين يرتبط الكالسيوم مرة أخرى عن طريق الهياكل جهة EF ثلاثة من aequorin، التي تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين يؤدي إلى أكسدة coelenterazine، الذي ينقل الطاقة غير إشعاعيا إلى GFP. هذه النتائج نقل الطاقة في الإفراج عن الضوء الأخضر (λ = 509 نانومتر) من GFP، بدلا من الضوء الأزرق من aequorin. اندماج GFP وaequorin أيضا يمنح قدر أكبر من الاستقرار البروتين يساعد على إنتاج ضوء انصهار بروتين 19-65 مرات أكثر إشراقا من aequorin وحده (4). باستخدام نهج إضاءة الحيوية داخل المخ يوسع تطبيق التجريبي الحالي من التصوير الكالسيوم سواء من حيث مدة التسجيل المتواصل وعدد من الهياكل في الدماغ التي يمكن تسجيلها. على نطاق واسع في سياق العمل السابق وهو ما يعني أن على الصعيدين العالمي وأكبريمكن رصد مجموعة متنوعة من إقليمي "النشاط" في الدماغ (من خلال وكيل العابرين الكالسيوم). الأهم من النشاط يمكن رصدها لفترة أطول، في الوقت الحقيقي، وبصورة مستمرة، وهو يفسح المجال بسهولة إلى السعي لتحقيق فهم كامل وظيفة القاعدية في الدماغ.
في السنوات القليلة الماضية، لدينا مختبر وغيرها قد وضعت الذباب المعدلة وراثيا معربا عن GFP-aequorin تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5،6. وقد استخدمنا-GFP aequorin تلألؤ بيولوجي لتسجيل النشاط التي تنتجها المحفزات الطبيعية مثل رائحة 7،8، وكذلك دراسة المكونات الخلوية تحوير الكالسيوم 2+ -activity في الهيئات الفطر التالية مستقبلات الأستيل كولين التحفيز عن طريق تطبيق النيكوتينيك المباشر 9. بالإضافة إلى ذلك، فقد استخدمنا أيضا GFP-aequorin لمعالجة عدد من الأسئلة التجريبية التي لم تكن قادرة على معالجتها سابقا، مثل طويل الأجلالتصوير العابرين الكالسيوم عفوية والتصور من هياكل الدماغ أكثر عمقا 10. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمنا النظام / UAS GAL4 للتعبير عن ATP مستقبلات الثدييات P2X 2 11 قناة الموجبة، في الخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية) واستخدام نظام LexA للتعبير عن GFP-aequorin في الهيئات الفطر (MB247-LexA، 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (مجاملة من B. فايفر، Janelia مزرعة، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد أتاح ذلك لنا لتفعيل السندات الإذنية من خلال تطبيق ATP، والذي بدوره ينشط الهيئات الفطر (هدف المصب من السندات الإذنية)، ومحاكاة أكثر الظروف الطبيعية، مثل استجابة لحافز الرائحة. عموما هذا الأسلوب يجمع بين P2X 2 و GFP-aequorin توسع الاحتمالات التجريبية. على نطاق واسع لأنه يتيح الفرصة لفهم أفضل لأنماط النشاط في المخ، وبدء دراسات جديدة حول كيفية المحفزات واضطرابات مختلفة يمكن أن يغير من الزخرفة القاعدية من النشاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد العينات
- إعداد الحلول وإعداد
- الحفاظ على جميع خطوط البطن ذبابة الفاكهة في 24 ° C على معيار المتوسطة الطعام. الخلفية والاحتفاظ بها في منخفض الكثافة في القارورة لتوليد حجم موحد والوزن من الذباب.
- إضافة 10 الإناث البكر مع 10 ذكور في قارورة، والسماح لهم التزاوج ونقل لهم كل أيام 2 إلى قارورة جديدة. ثم في وقت لاحق 10 يوما، عندما تبدأ الذباب لeclose، حصاد الذباب كل يوم. الاحتفاظ بسجل دقيق لعمر الذباب والاحتفاظ بها في حالة جيدة.
- في يوم 3، فصل الذكور عن الإناث والحفاظ على الإناث 20 الذباب في قارورة. تسجيل الذباب في 4 أو 5 أيام من العمر.
- يعد حل قارع الأجراس مع التركيزات التالية: 130 ملي كلوريد الصوديوم، 5 مم بوكل، 2 مم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي HEPES، و 36 ملي السكروز وضبط درجة الحموضة من الحل لبدقة 7.3. تحضير محاليل الإرواء من 25 μ؛ M النيكوتين و 100 ملي بوكل في حل رينغر.
- إعداد 1000 ميكرولتر طرف ماصة: باستخدام شكل رأس شفرة حلاقة لوجهة نظر (حوالي 35 درجة من نهاية طرف) وإزالة قاعدة فائضة تتجاوز 1 ½ سم من الحافة.
- مربع لتخزين (23 سم × 17 سم × 8.5 سم) من عينة تحضير أثناء الحضانة. وضع اثنين من الإسفنج (12 سم × 8 سم × 3 سم) المشبعة بالماء في أسفل [لمنع جفاف العينة] تحت جهاز رف صغير لوضع العينات على النحو اكتمال إعدادها.
- إعداد الذباب عينات بحيث أنها تحتوي على ما لا يقل عن 1 نسخة من UAS-GFP-aequorin ونسخة واحدة من خط GAL4 لدفع التعبير عن GFP-aequorin. وعبرت خط OK107 GAL4 (خط القيادة التعبير في المقام الأول في الهيئات الفطر) مع UAS-GFP-aequorin في هذا الإعداد.
ملاحظة: يجب أن تكون داخل علبة من ماء والخارج ويجب أن تمنع الضوء من الدخول مربع لمنع تدهور coelenterazine أثناء الحضانة.
- الحفاظ على جميع خطوط البطن ذبابة الفاكهة في 24 ° C على معيار المتوسطة الطعام. الخلفية والاحتفاظ بها في منخفض الكثافة في القارورة لتوليد حجم موحد والوزن من الذباب.
- الإعداديةaration العينات
- كريم تخدير ذبابة الفاكهة قبل نقله إلى قارورة زجاجية والحفاظ على الجليد لمدة 2 دقيقة قبل نقله إلى طبق بيتري المبردة لتحديد المواقع في الطرف ماصة. إعداد نصائح ماصة على ورق الترشيح رطب قليلا في 100 مل طبق بيتري على الجليد تحت المجهر تشريح.
- بلطف مع ملقط مكان يطير داخل ماصة.
- باستخدام فرشاة دفع ومواءمة يطير مثل أن الرأس هو تماما الماضي حافة الحافة وتتعرض جزئيا في المنطقة الظهرية من قبل قسم إزالتها خلال غيض تشكيل (الشكل 2B) بلطف.
- الجمع بين صغيرة (حوالي 3-4 ميكرولتر) أجزاء من عنصرين من الغراء الأسنان. تطبيق الغراء بعناية في جميع أنحاء الأمامي والخلفي الرأس والرقبة وصولا الى وحول حافة طرف الماصة - تجنب تاج الرأس. اسمحوا الغراء جافة لمدة 2 دقيقة.
- مكان ماصة مع ذبابة اصق من خلال ثقب في تسجيل غرفة (الشكل 2D) وجنرالاضغط TLY لتأمين في المكان.
- الجمع بين عنصرين من الغراء السيليكون (حوالي 3-4 ميكرولتر). تطبيق الغراء على الجانب المسطح من الغرفة على طول الحافة حيث الغرفة وماصة لقاء لمنع تسرب محلول رينغر. اسمحوا الغراء جافة لمدة 2 دقيقة.
- تشريح
- يلصق الشريط عبر قناة نضح، حافة قصيرة وتمتد إلى الجزء الخلفي من الغرفة.
- وضع الغرفة مع ذبابة على كتلة تشريح تحت المجهر بدوره على مصباح الفلورسنت. الماصة 1 مل من محلول رينغر في الغرفة.
- استخدام سكين جراحية غرامة لإزالة بشرة. جعل شقوق متوازية من الجزء الخلفي من الرأس إلى المنطقة antennal. ثم قص على طول حافة العين ثم إجراء شق عمودي فوق هوائي يربط بين الشقوق السابقة. جعل مواز شق النهائي لأنه في الجزء الخلفي من الرأس. استخدام الملقط حادة غرامة لإزالة إهاب (الشكل 2C).
- استخدام الملقط حادة غرامة لفهم بلطف لد اضحة بعيدا تتعرض أنسجة الجهاز التنفسي حتى يتم تصور الدماغ و[الاستشعاع] الجسم الفطر بشكل واضح.
- استخدام الملقط حادة جدا لفهم بعناية وقرصة الأنسجة الظهارية العصبية التي تغطي الدماغ للسماح للنفاذ من coelenterazine.
ملاحظة: بدلا من ذلك غراء يمكن استخدامها لpermeabilize وneuroepithelia 9. - باستخدام الماصة، تغسل مرتين مع حل رينغر لإزالة أي حطام من تشريح وعينة مكان في المربع المظلم.
- الماصة 1 مل من محلول رينغر تحتوي على 5 ميكرومتر البنزيل-coelenterazine في الغرفة. إغلاق مربع والسماح الحضانة مع coelenterazine في RT مدة لا تقل عن 2 ساعة.
2. التصوير
- التثبيت
- بدء نظام تسجيل: بدوره على المجهر، والكمبيوتر، وكاميرا ونظام الصرف الصحي وتعيين غرفة الضوابط البيئية إلى 25 ° C.
- مفتوحة القياس وبرنامج أتمتة Explorer على جهاز الكمبيوتر. اضغط على “؛ أجهزة واجهات "، ثم انقر مرتين على" NI أجهزة الحركة "وأخيرا انقر بزر الماوس الأيمن فوق" PCI-7334 "وحدد" تهيئة الجهاز ".
- فتح فوتون تصوير. إنشاء مجلد جديد واسم أول ملف التسجيل. الكاميرا يجب أن تصل إلى -80 درجة مئوية قبل النظام سوف يعمل.
- إعداد نظام نضح - إضافة بوكل، النيكوتين، وحل قارع الأجراس في الخزانات وضبط ذلك كل التصريف حل في 2 مل / دقيقة. تغسل بمحلول رينغر قبل بدء التجربة.
- تحضير عينة
- مكان التصوير جبل طبق كتلة على جبل تحت المجهر في التكبير 5X وإدراج أنبوب نضح في القناة من خلال ثقب.
- تعيين المجهر لوضع الفلورسنت ثم مركز وجلب الهيئات الفطر (ميجا) إلى التركيز. التكيف مع 20X وإعادة الوسط والتركيز.
- أجهزة الصرف موقف على بركة الصرف الصحي، وضبط ارتفاع تحويلة الصرف بحيث غيض هو اعلاه فقطتجمع الإلكترونية، وتشغيل حل رينغر لمدة 30 ثانية لضمان الصرف الملائم.
- هدم درع لاغلاق الجهاز بعيدا عن الضوء. استخدام النظام الآلي في الفوتون تصوير إجراء تعديلات غرامة على التركيز والتقاط صورة الفلورسنت مرجع ميجا.
- تسجيل
- ضبط سرعة الفوتون إلى المطلوب سرعة تسجيل (من 50 ميللي ثانية حتى 1 ثانية أو أكثر). اختر وضع الفوتون ومصراع مفتوحة. سجل الوراثي، والجنس، والعمر، وعدد العينة في إدخالات السجل. ضبط صناديق موقف ROI على الكأس والهيئات الخلية (بنك) والفصوص وسطي بالضغط على صناديق العائد على الاستثمار وسحب في حين عقد السيطرة.
- خط الأساس القياسي لحوالي 5 إلى 10 دقيقة (حسب الرغبة).
- تطبيق النيكوتين لمدة 1 دقيقة. ملاحظة بدء / إيقاف في السجل. تغسل بمحلول رينغر لمدة 5 دقائق.
- الانتظار 5 دقائق لتحقيق الانتعاش وإعداد بوكل إدخال سجل وتوقيت.
- تطبيق بوكل لمدة 1 دقيقة. ملاحظة بدء / إيقاف في السجل. تغسل بمحلول رينغر لمدة 1 دقيقة.
- تحولإلى وضع الفلورسنت، تأخذ صورة الفلورسنت النهائية، وإيقاف حل رينغر.
- اضغط على "إيقاف". سوف مربع حوار يسأل لاغلاق النظام. حدد "لا" لمتابعة التسجيل.
- فتح الدرع، ونظام الصرف الصحي الخطوة، والتبديل الهدف العدسة ل5X، وإزالة أنبوب نضح. إزالة عينة / تسجيل طبق من مرحلة، تنظيف قبالة عدسة 20X قبل الشطف ومسح عدسة مرتين بالماء.
- اضغط على زر التشغيل الأبيض في الجزء العلوي من نافذة البرنامج لبدء تسجيل المقبل.
3. تحليل والإبداع فيديو
- استخراج القيم الفوتون
- فتح برنامج تحليل الفوتون (على سبيل المثال، فوتون عارض) وملف جدول بيانات العينة الأولى مفتوحة.
- حدد علامة التبويب التحكم بالعرض. تحديد العائد على الاستثمار من خلال النقر على المنطقة في حين عقد السيطرة. ضبط حجم والتوجيه وشكل المناطق ذات الاهتمام ليشمل GFP مضيئة بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي.
- إضافة إلى ذلكآل ROI بالنقر على "تحديد العائد على الاستثمار"، والنقر والسحب على الشاشة لإنشاء ROI الجديد.
- حدد "فيلم" علامة التبويب للعب الفوتون الفيديو. ضبط "عرض ثانية" و "خطوات ثانية" كما تريد. تعدل وضع ROI الضرورة.
- حدد قطات الشاشة تمثيلية من مضان GFP، استجابة النيكوتين والاستجابة بوكل. لقطات من المحاصيل وصورة معجون إلى شريحة العرض لتحليلها لاحقا والمقارنة.
- ضبط كل من "عرض ثانية" و "خطوة ثانية" لسرعة تسجيل في ثوان. حدد طول التحليل عن طريق تحريك علامات رمادية على اللوحة العلوية لمنطقة قوس قبل بدء التحفيز وبعد نهاية الاستجابة.
- حدد "تعليق وجهات النظر أثناء اللعب" الصحافة "<< REW" ثم اضغط على "PLAY>". حدد علامة التبويب "الكونت معدل الرسم البياني" وضبط وحدات النحو المرغوب فيه وألوان الخط لتتناسب مع لون ROI.
- عندما يتم الانتهاء من تحليل، اضغط على "تصدير عدد معدل البيانات". اختر لقطات من الشاشة جنبا إلى جنب التسجيلات بنك التعمير الصينى ومنطقة الفص وسطي من الاهتمام من كل جانب. لقطات من المحاصيل وصورة لصق شريحة مع الصور الاستجابة. وسوف تستخدم هذه الشريحة في وقت لاحق في التحليل النهائي.
- تحليل سبيل المثال: طريقة واحدة لتحليل البيانات المستخرجة الفوتون المفصل
- فتح ملفات جداول البيانات في مجلد "الكونت الصادرات معدل".
- إعادة الخلايا في العمود المسمى أول مرة لعرض الوقت في ساعة ودقيقة.
- الرجوع الشريحة المقابلة للعينة. إزالة كافة القيم باستثناء الأعمدة للوقت وممثل هما رويس.
- تحديد النيكوتين التحفيز وقت البدء - متوفرة في ملف إدخال سجل في main المجلدات إزالة البيانات الإضافية قبل أن يبدأ أو قيمة تسليط الضوء.
- البحث أعلى / قيمة الذروة لكل من بنك التعمير الصينى والفص وسطي وعلامة / تسليط الضوء.
- تحديد بداية ونهاية الوقت استجابة لكلابنك التعمير الصينى والفص وسطي عن طريق إنشاء التقدير باستخدام نقطة زمنية من المقابلة رسوم بيانية ردا على الشريحة وحدد القيمة الفعلية عن تغير في القيم في القرب من هذه النقاط. تسليط الضوء على المنطقة الواقعة بين هذه النقاط في كل من بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي. بدلا من ذلك، استخدام ماكرو 9.
- الجمع بين جميع العينات من المجموعة التجريبية واحد على جدول جديد.
- محاذاة على الذروة من خلال تحديد قيمة الصف هو لكل قيمة الذروة CCB. طرح أقل القيم من أعلى قيمة الصف لتحديد القيمة التقريبية التوالي حيث يجب أن منسوخ بيانات العينة. تحقق من أن كافة القيم هي ذروة الانحياز.
- نسخ ورقة مرتين وحذف إما الأعمدة الفص وسطي أو الأعمدة CCB إنشاء صفحات من بنك التعمير الصينى فقط أو الفص القيم وسطي.
- إزالة البيانات بعد كل الردود CCB قد انتهت. خلق أربعة صفوف وصفت إجمالي الفوتونات، طول الاستجابة (مدة)، السعة القصوى، والاستجابة الإختفاء. نسخ ولصق هذا مرة أخرى تحت الأصلية.
- استخدم الدالة SUM لتحديد مجموع الفوتونات خلال الاستجابة. استخدم الدالة COUNT لتحديد طول استجابة. نسخة وربط الخلية أعلى قيمة لتحديد قيمة السعة الذروة. استخدام وظيفة COUNT - حدد من البداية للنضح من النيكوتين إلى بداية استجابة - لتحديد الاستجابة الإختفاء.
- نسخة القيم باستخدام الدالة ربط وضرب (كل ما عدا السعة الذروة) عن طريق تسجيل سرعة في ثوان.
- قد يتم إنشاء شريط / مربع الرسوم البيانية لمعايير احتساب مثل عدد الفوتونات، السعة القصوى، وطول ردا على ذلك، إذا كان الأمر كذلك المطلوب (مثلا: الشكل 5B، C، D).
- في العمود بعد الخام الاستجابة الفوتون البيانات، متوسط نقاط البيانات الخام لكل نقطة زمنية باستخدام متوسط وظيفة. إذا المتابعة المطلوبة مع عمود تحديد الخطأ المعياري للمتوسط (SEM)، لكل من القيم الفوتون متوسط في نقطة زمنية.
- استخدام عمود متوسط لبناء بمتوسط عضوية استجابةه [الرسم البياني] لمجموعة عينة بنك التعمير الصينى. للقيام بذلك حدد العمود تحديد الوقت والقيم محور س وعمود من متوسط قيم الفوتون كما المحور الصادي وأخيرا حدد أداة مخطط التشتت إنشاء الرسم البياني.
- كرر هذا الإجراء مع تحليل البيانات من الفصوص وسطي.
- إنشاء صور للفيديو
- فتح المشاهد الفوتون.
- حدد علامة التبويب التحكم بالعرض. انقر على ROI حين عقد التحكم لاختيار إزالة و / أو تصغيره.
- تعديل "عرض ثانية" (الساعة تراكم) كما هو مطلوب لتحديد محتوى كل إطار.
- تعديل "خطوة ثانية" لتحديد التداخل في كل إطار.
- حدد "وجهات النظر التصدير في حين لعب" الصحافة "<< REW" ثم "PLAY>". سيتم تصديرها الصور للفيديو إلى المجلد "وجهة نظر الصادرات" على شكل سلسلة من الملفات بابوا نيو غينيا.
- استخدام لقب الظاهري لجعل الفيديو: طريقة واحدة للفيديو جreation مفصل
- إنشاء مجلد جديد اسمه "resultats" في المجلد عرض الصادرات التي تحتوي على صور.
- جلب النصي (renommer.VBS) في مجلد من الصور.
- انقر مرتين على renommer.VBS لتشغيل.
- سيتم تلقائيا إعادة تسمية الصور رقميا ونسخها إلى مجلد "resultats".
- فتح VirtualDub.exe.
- تحديد ملف الفيديو مفتوح - حدد الصورة الأولى (والصور اللاحقة تلقائيا تحميل).
- حدد فيديو - حدد الإطار معدل ضبط كما تريد.
- حدد الفيديو - ضغط حدد اختيار سينيباك الترميز التي نصف قطرها.
- في ملف اختر حفظ وافي سيتم إنشاء الفيديو تلقائيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الانصهار من GFP لaequorin يسمح لنا تصور منطقتنا من الفائدة قبل التصوير إضاءة الحيوية من خلال استثارة GFP في وضع الفلورسنت على المجهر (الشكل 3A، 4A، 6A، 6E). واحدة من أبسط الطرق لتحفيز الهيئات الفطر من خلال تفعيل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية ionotropic. على الرغم من الأستيل كولين هو يجند الذاتية من هذا المستقبل وجدنا أن النيكوتين ينتج استجابات أكثر استنساخه في الهيئات الفطر. هذا هو في جزء منه لأنها الإعراب صراحة عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية، وبالتالي باستخدام النيكوتين يمكننا تجنب تفعيل مستقبلات أستيل المسكارينية أعرب أماكن أخرى في الدماغ. وعلاوة على ذلك، النيكوتين هو أكثر استقرارا من أستيل كولين، وبالتالي يسمح أفضل وأكثر موثوقية السيطرة التحفيز. رد نموذجية تبدأ مع تفعيل سريع لكل من الكأس، خلية الهيئات (بنك) والفصوص وسطي (ML) (انظر الشكل 4A لصورة المسمى). عموما استجابة CCB يستمر لفترة أطول والمعارض استجابة للإضاءة الحيوية أكبر من الفصوص كما هو موضح في لوحات متتابعة للاستجابة (الشكل 3C-H). ويبين الشكل 4B تراكم 10 ثانية من الفوتونات المسجلة في القرار الزماني من 100 مللي ثانية (10 هرتز) خلال ذروة ردا على نضح 1 دقيقة 25 ميكرومتر النيكوتين. بعد فترة فشل واسترداد 10 دقيقة يبدأ التحفيز الثاني من نضح 1 دقيقة 100 ملي بوكل (أرقام 4C، E) والذي يسمح لنا لتأكيد صلاحية العينة. ويمكن تحليل ردود الكمية عن طريق تحديد العائد على الاستثمار خلال تحليل في الفوتون المشاهد. تشغيل تحليل في الفوتون المشاهد تنتج كلا من الرسوم البيانية التي تظهر عدد الفوتونات المنبعثة في ROI مختارة على مر الزمن (الشكل 4D وE) وكذلك جداول البيانات القابلة للتصدير من تلك القيم. الشكل 4D هو أمثللو من الرسوم البيانية التي تنتجها الفوتون المشاهد بالتآمر الفوتونات المنبعثة في ROI 2 [الأخضر] (الصحيح بنك) وROI 4 [الأزرق] (الفصوص وسطي اليمنى). بيانات مشابهة لاستجابة بوكل ممثلة في الشكل 4E. البيانات التي تم تصديرها يمكن استخدامها لإعادة بناء منحنى الاستجابة (الشكل 5A)، وكذلك لاستخراج بيانات إضافية حول معلمات مختلفة مثل المدة، والسعة الذروة، والاستجابة الكلية (الشكل 5B-D). في الآونة الأخيرة استخدام أنظمة GAL4-UAS وLexA لقد ابتكرنا طريقة لحصول على استجابة أكثر طبيعية. لفترة وجيزة، وأعرب عن ATP بوابات-P2X 2 قناة الموجبة في الخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية)، وأعربت GFP-aequorin (GA) في الهيئات الفطر - هدفا للالسندات الإذنية. وهذا يسمح لنا لإثارة انتقائي السندات الإذنية على الرغم من تطبيق ATP، والتي يمكن بدورها تنتج استجابة في الهيئات فطر (الشكل 6).
الشكل 1. خصائص إضاءة الحيوية مراسلون (GFP-aequorin). (A) رسم تخطيطي للGFP وaequorin الانصهار الجين مع تسلسل تفعيل المنبع. (B) نموذج من انبعاث الضوء الأزرق من قبل aequorin ردا على مستويات عالية من الكالسيوم 2+. (C) نموذج من انبعاث الضوء الأخضر من GFP-aequorin ردا على مستويات عالية من الكالسيوم 2+. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تعيين ما يصل التجريبية. (A) يطير المتمركزة في طرف الماصة. (B) مثال على تقنية اللصق كافية تحقيق الاستقرار في الرأس وختم المنطقة بين هيئة الطيران وطرف الماصة. (C) تخطيطي للتشريح لفتح رأس الكبسولة. (D) 1 مل الغرفة على عقد كتلة مع أنبوب نضح المدرجة. مجموع أبعاد الغرفة: الطول: 7.4 سم، العرض: 2.7 سم، الطول: 0.55 سم. الداخلية أبعاد الغرفة: الطول: 1.7 سم، العرض: 1.4 سم، الطول: 0.35 سم، ونصف قطر الثقب الغرفة: 0.1 سم. (E) عرض رأس ذبابة تظهر GFP إيجابية في إشارة ميجا: انخفاض ضوء خافت مع مضان المستمدة من يحركها OK107 GFP-aequorin بعد إزالة بشرة. (F) مجهر مع كاميرا الفوتون ونظام الارواء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. استجابة التمثيلية إلى 25 ميكرومتر النيكوتين في الهيئات الفطر. (A) صورة فلوري منوالتعبير عن GFP aequorin في الهيئات الفطر في GA2 / +، OK107 / + (شريط النطاق = 50 ميكرومتر) ذبابة سيطرة الدماغ. (B) استجابة للإضاءة الحيوية الذروة في الهيئات الفطر. (C) وقبل التحفيز. (D) ابدأ في الرد. (E) استجابة الذروة. (F) استمرار استجابة بنك التعمير الصينى. (G) انخفاض استجابة بنك التعمير الصينى. (H) نهاية الاستجابة (BH: شريط النطاق = 33 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تحليل الممثل للتسجيل العينة (A) صورة فلوري من الجسم الفطر من GA2 / +؛ OK107 / + السيطرة تطير مع الأربعة المختارة خلال بنك التعمير الصينى وسطي فصوص (با نطاق ROI لص = 50 ميكرون). (B) تراكم 10 ثانية من الاستجابة للإضاءة الحيوية إلى 25 ميكرومتر النيكوتين - استجابة الفوتون سجلت في 100 مللي ثانية. (C) تراكم 10 ثانية من الاستجابة للإضاءة الحيوية إلى 100 ملي بوكل سجلت في 100 مللي ثانية. (D) رسم بياني لعدد مسجل الفوتونات المنبعثة خلال استجابة النيكوتين داخل لROI 2 و 4 تغطي CCB الأيمن والفص وسطي على التوالي. (E) رسم بياني لعدد مسجل الفوتونات المنبعثة خلال استجابة بوكل داخل تغطي ROI ل2 و 4 الصحيحة بنك التعمير الصينى وسطي فصوص، على التوالي. في d و e، وترك Y-محور يتوافق مع عدد من الفوتونات في مجال الكامل للرأي، في حين يقابل اليمين العمودي إلى الفوتونات داخل ROI. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تحليل المعلمات التمثيلية للتسجيل تحليل العينات الممثل التفوق من الاستجابة للإضاءة الحيوية لتفعيل النيكوتينيك من الجسم الفطر في GA2 / +؛ OK107 / + ذبابة السيطرة. استجابة (A) الفوتون مع مرور الوقت في بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي. (B) مدة الردود في بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي. (C) أعلى قيمة الفوتون (السعة القصوى) خلال الرد خلال بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي. (D) مجموع الفوتونات داخل بنك التعمير الصينى والفصوص وسطي من الاستجابة بأكمله. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 6. اثنان استجابة مختلفة في الهيئات الفطر بعد التحفيز من السندات الإذنية عبتيough ATP وP2X 2. عينة 1 ذبابة معربا عن P2X 2 في السندات الإذنية وGFP-aequorin في الهيئات الفطر (GH146 / +، P2X 2 / MB247-LexA، 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (الإعلان) (A) صورة فلوري الهيئات الفطر مع ROI في (نطاق. بار = 50 ميكرون). (ب) صورة للإضاءة الحيوية للاستجابة الذروة في الهيئات الفطر بعد تفعيل السندات الإذنية التي كتبها P2X 2 حفز مع 500 ميكرومتر ATP، لاحظ في المقام الأول في الفصوص وسطي. (C) صورة للإضاءة الحيوية للاستجابة بوكل الذروة. (D ) وقت مسار الفوتون داخل المناطق ROI، في جميع أنحاء استجابة عينة 2 ذبابة معربا عن P2X 2 في السندات الإذنية وGFP-aequorin في الهيئات الفطر (GH146 / +؛ P2X 2 / MB247-LexA، 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (إيه ). (E) صورة فلوري مع ROI ل(مقياس بار = 50 ميكرون). (F) صورة للإضاءة الحيوية للاستجابة يتسبب في الهيئات الفطر بعدctivation من السندات الإذنية التي كتبها P2X 2 حفز مع 1MM ATP، في كل من الفصوص وبنك التعمير الصينى. (G) صورة للإضاءة الحيوية للاستجابة بوكل الذروة. (H) بالطبع وقت الفوتون داخل المناطق ROI، في جميع أنحاء استجابة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نهج GFP aequorin القائم على إضاءة الحيوية التي وضعت مؤخرا المقدمة هنا يسمح في الجسم الحي تسجيل ظيفية من الكالسيوم 2+ -activity في الخلايا العصبية المختلفة، وكذلك إذا رغبت في ذلك، في نوع آخر من الخلايا مثل الخلايا النجمية الكلى كما ورد في كابريرو وآخرون. 2013 5.
تعديلات، وإطلاق النار المتاعب، والمكونات الإضافية، والخطوات الحاسمة
ذبابة الفاكهة تربية
تم إدراج-GFP aequorin التحوير (pG5A) 4 في ناقلات pUAST لإنشاء ثلاثة خطوط transformant مستقلة 6. تم اختبار جميع خطوط للتلألؤ بيولوجي، و، وكلها كانت قادرة على الرد على الكالسيوم في الجسم الحي 2+ -activity 6. لكن التجارب أكثر الاخيرة أشار إلى أن خط GA2 إدراجها على الكروموسوم الثالث يولد إشارة أكثر قوة من س خط GA1 المدرجةن الكروموسوم الثاني. هنا، تم الحصول على نتائج ممثلة باستخدام UAS-GA2 عبرت مع خط OK107 MB-محددة. وعلاوة على ذلك، في الآونة الأخيرة قد ولدت B. فايفر على بناء-GFP aequorin وضعت تحت سيطرة 20XUAS العنصر التنظيمي (20X-G5A-2)، ويتم التحقق من صحة هذا التصور في مختبرنا. لفترة وجيزة، وأنه يعطي إشارة قوية جدا، أقوى من GA2 لدينا معيار، والتي بالتالي ينبغي أن تكون أكثر كفاءة ومفيدة لزيادة مراقبة -activity الكالسيوم 2+ في البنى العميقة من الدماغ، مثل الجسم الإهليلجي. بالإضافة إلى ذلك، قد يكون من المفيد لتصوير كميات صغيرة من الخلايا العصبية أو في محطات محوار (اتصالات متشابك) أيضا.
التحضيرات للتصوير
على الرغم من أن يطير يجب كريم تخدير أثناء تحديد المواقع ولصق، فمن المهم لتقليل الوقت على الجليد. يجب نقل الذباب إلى قارورة زجاجية وأبقى على الجليد لمدة 2 دقيقة قبل نقله إلى طبق بيتري المبردةلتحديد المواقع في الطرف ماصة. لقد لاحظنا أن الفترة الزمنية الممتدة من التخدير يقلل من جدوى من العينة، ويمكن التخفيف من الاستجابة. على النحو الأمثل، علينا أن نحافظ على الوقت التخدير الجليد أقل من 5-10 دقيقة.
تسجيل اللقطات ولصق خطوات حاسمة. ومن الأهمية بمكان لتأمين رأس ذبابة في مكان للتشريح والتصوير وكذلك لمنع تسرب محلول رينغر في تلميح الماصة و / أو الخروج من غرفة تسجيل. الغراء الأسنان (وإلى حد أقل الغراء السيليكون) سوف تصبح لزجة وتبدأ بعد ذلك لتجف في أقرب وقت يتم الجمع بين العنصرين. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن تطبيق الغراء على وجه السرعة لتجنب ضعف الترابط والتثاقل من الغراء. في بعض الحالات لاحظنا أن أصناف بديلة من الشريط والغراء، وعندما تكون في اتصال مع حل رينغر، قد تفرج عن الملوثات في حل رينغر التي يمكن أن تؤثر على الطاير وردها، وخاصة جدا لتجارب مخصصة لروقال انه دراسة نظام حاسة الشم، وذلك باستخدام الروائح المختلفة. وبناء على ذلك، ينبغي توخي الحذر هنا إذا مواد استبدال (انظر المواد اللازمة لأصناف محددة نستخدمها).
وقد وضعت عدة أشكال مختلفة من coelenterazine من أجل تحسين نشاطها مثل سرعة انبعاث الضوء، كا 2+ -affinity (حساسية)، أو شدة انبعاث الضوء (12). على سبيل المثال، coelenterazine الأم هي أكثر استقرارا، وبالتالي أكثر ملاءمة من التصوير على المدى الطويل إلى عدة ساعات، في حين أن البنزيل-coelenterazine (يسمى أيضا ح-coelenterazine) النتائج في انبعاث الضوء العالي بشكل أسرع وأقصر فترة نصف العمر. للحصول على معلومات إضافية حول أشكال مختلفة من coelenterazine، راجع عنوان الويب في قائمة المواد.
التصوير
يمكن رصد إشارات تلألؤ بيولوجي مع كاميرا CCD مضاعف الإلكترون (EM-CCD، يتم تبريده الى -80 درجة مئوية) تركيبها المجهر. هذا الإعداد يجب بالبريد يضم داخل مربع مظلم ضيق لتجنب أي غير مرغوب فيها (المحيط) تلوث الضوء. الإعداد وصفها في هذه المخطوطة يستخدم عدسة 20X الغمر موضوعية تسمح مجال الرؤية من 400 × 400 ميكرون (512 X 512 بكسل). لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء، تم الحصول على البيانات مع الوقت التكامل 0.100 ثانية (10 هرتز)، وكان يستخدم 2 × 2 binning (1 بكسل = 1.2 X 1.2 ميكرون). س للحصول على وتخزين البيانات، تم تعيين كل فوتون الكشف، ص الإحداثيات ونقطة زمنية. ما بين 500 و 600 نانومتر الطول الموجي، والكاميرا EM-CCD (انظر وصف دقيق في قائمة المواد) لديها كفاءة الكم من 96٪.
إحدى المعلمات الأكثر أهمية لتصوير الدماغ وظيفية في الجسم الحي هو قرار مؤقت. حتى الآن، فإن غالبية تقنية القائم على مضان الكالسيوم 2+ -imaging مثل GCaMP وCAMELEON يوفر القرار الزماني من حوالي 4 هرتز (250 ميللي ثانية / الإطار). في الآونة الأخيرة، مع القائم على تلألؤ بيولوجي GFP-aequorin كنا قادرين على الريسالبريد الوقت اقتناء ما يصل إلى 100 مللي ثانية / الإطار مع الكاميرا EMCCD وحتى تصل إلى 120 لقطة / ثانية (8.3 ميللي ثانية / الإطار) مع مضاعف الإلكترون الكاميرا ICDD 10. في هذا القرار الزماني النهج التي من التقنيات الكهربية (في مجموعة من حوالي 1 مللي ثانية). بينما قرار زمنية عالية على حد سواء بالمعلومات وحاسم للدراسات مخصصة لنقل متشابك والنشاط التحفيز التي يسببها، مدد أبطأ ضرورية بعد كا 2+ -kinetics يحدث أيضا داخل الخلايا العصبية، على سبيل المثال كا 2+ بيان من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ -stores (للمراجعة: Berridge وآخرون، 2003 13). لهذا النوع الأخير، وهو قرار أبطأ الزمني لا يزال مقبولا، في حين عكسيا، فإنها تحتاج عادة إلى أفضل الكالسيوم 2+ -affinity من أجهزة الاستشعار ليتم الكشف. وقد تحقق هذا الشرط مع GFP-Aequorin للكشف عن الافراج عن الكالسيوم داخل الخلايا 2+ -stores في محطة محور عصبي من باستقبال حاسة الشمالأملاح الخلايا العصبية 7،8. بدلا من ذلك، اعتمادا على الظروف التجريبية المطلوبة، يمكن أن تستخدم أبطأ اكتساب الوقت. على سبيل المثال، في المدى O / N التسجيلات، وقد استخدمنا مرات التكامل 2 ثانية بسبب وجود عدد كبير من نقاط البيانات التي تم جمعها (Minocci وآخرون، 2013). وباختصار، ميزة عملية واحدة مع تلألؤ بيولوجي هو أن القرار الزماني يمكن تعديلها بسهولة وفقا لظروف تجريبية المطلوب.
وقد وضعت دوائر بديلة (الإعداد الذبابة) لتسهيل أهداف التجربة. على سبيل المثال، للدراسات على أساس التحفيز الرائحة الطبيعية، ويجب أن تبقى الهوائي الحر، وبذلك نهج مثل تلك التي وضعتها A. فيالا 14 هو الأنسب (استخدمنا نهج مماثل لMurmu وآخرون 2010). بإيجاز في هذا النهج، والذبابة المربوطة (لاصق) على دبوس minutien في الرقبة، والتي يتم لصقها على زلة غطاء من البلاستيك تحتوي على ثقب صغير. يتم إنشاء الختمحول الجزء العلوي من الرأس من ذبابة. بعد ذلك، وتودع قطرة من المسابقة على الرأس، ويتم تشريح كبسولة الرأس. في مثل هذه الطريقة، يتم الاحتفاظ هوائيات حرة ومتاحة للاستشعار الروائح. وبالمثل، لتسجيل المدى الطويل، كما O / N أو حتى بضعة أيام 10 يحتاج الطاير أن تبقى كما مجانا الجبرية وقت ممكن، وفي بعض الحالات تغذية (على سبيل المثال: مع ورقة الشعرية غارقة في الجلوكوز 5٪ حل). في هذه الظروف نهج فيالا هو أيضا أكثر ملاءمة من النهج المتبع في طرف الماصة الأزرق (طريقة الغوص).
جميع الطلبات المخدرات يمكن السيطرة عليها من الخارج باستخدام طريقة 6 صمامات متعددة نظام الجاذبية نضح. يمكن التحكم في تدفق باستخدام المنظمين نضح الحجمية معايرة قبل كل دورة تسجيل لتدفق 2 مل / دقيقة. أجهزة الصرف استخراج السائل بمعدل 2 مل / دقيقة من غرفة تسجيل عن طريق مضخة تحوي السماح للتدفق المستمر.
فيبعض الشروط، ويرجع ذلك إلى تكلفة باهظة الثمن من المخدرات و / أو كمية من المخدرات للاستخدام، يود المرء أن تطبيق كميات صغيرة فقط من المركبات. وبالتالي، فمن الضروري تطبيقه مباشرة في الحمام وليس من خلال نظام الارواء. في هذه الحالة يجب إغلاق مصراع الكاميرا أثناء هذه العملية لتجنب التلوث الضوئي.
طرق التحليل
التهم لكل ثانية أو التهم لكل ثانية لكل الإحداثيات على حد سواء تم استخدامها من قبل مجموعتنا لتحليلها. التهم في الثانية وربما كان أفضل مناسبة لردود مشرقة في الهياكل بأكملها في حين التهم لكل ثانية ولكل تنسيق (الذي يمثل تطبيع الردود على حجم ROI) هو الانسب ودقيق للسكان صغيرة من الخلايا. كل منهما يمكن تحديد بسهولة في برامج التحليل.
واحدة من المزايا الرئيسية لاستخدام نهج تلألؤ بيولوجي هي الطريقة التي يتم الحصول عليها وتخزين البيانات (س، ص، ر معلماتالفوتونات المنبعثة لكل منهما). في الواقع، في حين أن أي تقنيات التصوير الأخرى المستخدمة الوضع القياسي كصورة كاملة المكتسب (عموما في شكل شجار)، مع هذا النظام، ونحن يكتسب فقط إشارة ذات الصلة وكبيرة عن طريق تخزين فقط إحداثيات بكسل والتي تم تفعيلها من خلال الضوء خلال مدة مسبقا محددة من الزمن (والتي تتطابق مع اكتساب الوقت أو القرار الزماني). ونتيجة لذلك، وتخزين البيانات هو حقا "خفيفة" مقارنة مع تخزين صورة كاملة، وبالتالي يجعل من الاسهل لتحليل البيانات. لتحليل البيانات، ونحن نستخدم البرامج ذات الصلة (الفوتون المشاهد)، والذي يسمح تحديد الوقت تراكم كما تريد. ثم عرض صورة من إشارات يمكن تعديلها كما هو مطلوب في الهدف لتقديم مقنع البيانات. بالتوازي كميا النتائج في الوقت نفسه قرار من الوقت اقتنائها.
أهمية والتطبيقات البيولوجية التصوير إضاءة الحيوية
كما ذكر أعلاه التصوير الكالسيوم إضاءة الحيوية التي تقدم ثلاث مزايا رئيسية لتقنيات التصوير الفلورسنت الكالسيوم: (1) المناطق العميقة من الدماغ يمكن تصويرها، (2) يمكن أن يحدث التصوير بشكل مستمر لفترات أطول كما عدة ساعات كما O / N وحتى في بعض الحالات تصل إلى يومين، و (3) في الآونة الأخيرة، مع القرار الزماني أعلى، تصل إلى 120 إطار / ثانية (8.3 ميللي ثانية). ومن المقرر أن عدم انسجامه مع إضاءة مبائر، التي بالتالي لا يسمح لنا لتحديد عمق الدقيق (ض خطة) للهياكل تنشيط الخلايا العصبية أو القيد الرئيسي للنهج إضاءة الحيوية.
الميزة الأولى من التصوير إضاءة الحيوية، والتصوير من مناطق الدماغ العميق، وقد تجلى سابقا في عام 2007 من قبل تصوير استجابة ارتفاع البوتاسيوم الناجم عن الكالسيوم داخل الجسم الإهليلجي (EB)، وهي بنية عميقة تقع في وسط الدماغ، مع عدم وجود قبل تقارير الكهربية أو وظيفية 6 2+ -activity في EB التالية تطبيق بيكروتوكسين (مانع من GABA A -receptors) مما يدل على أن GABAergic حلقة الخلايا العصبية للEB هي الخلايا العصبية المثبطة الواقع (الموصوفة في : حفاضات وآخرون، قدمت المقالة).
الفائدة الثانية وأطول وتسجيل الزمن المتواصل، تم استغلالها في العديد من الدراسات من مختبرنا. وقد استخدم التحفيز رائحة لدراسة نشاط الخلايا العصبية في الدماغ في الدراسات السابقة 11،15،16. باستخدام التصوير على المدى الطويل، ومع ذلك، فقد كان مختبرنا قادرا على إظهار التغييرات غير المبلغ عنها سابقا في حركية داخل الخلايا العصبية مستقبلات الشم للروائح. وأظهرت الدراسة الأولى التي Murmu وآخرون (2010) أنه على الرغم من المحفزات رائحة قصيرة (1-3 ثانية) أظهرت حركية مماثلة والفرق المعتدل في السعة، حافزا أطول رائحة (5 ثانية) تسبب في اتساع أكبر بكثير فضلا عن تغيير في حركية / البنيةلدى عودتهم من الرد الذي ينسب إلى مخازن الكالسيوم داخل الخلايا. وأظهرت دراسة لاحقة أنه في حين أن 5 طلبات متتالية من 1 ثانية البقول رائحة في 5 فترات دقيقة لم تتغير استجابة الكالسيوم، وزيادة طول الحافز إلى 5 ثانية أدت إلى تخفيف التدريجي للاستجابة، مما يشير إلى عملية التكيف. وعلاوة على ذلك هذه الظاهرة التكيف يبدو أن تبدأ من قبل تنظيم GABAergic من مخازن الكالسيوم التي سبق تحديدها 8. الأهم يثبت هذه البيانات أيضا إلى أنه في هذه الحالة التجريبية، وGFP-aequorin في كاليفورنيا 2+ أجهزة الاستشعار يمكن كشف ومتابعة الكالسيوم التي صدرت من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ -stores. دراسة فريدة من نوعها إضافية من مختبرنا تستخدم للإضاءة الحيوية O التصوير / N لتسجيل القاعدية (عفوية) النشاط في كامل السكان العصبية والدبقية في الدماغ وكذلك النشاط في هيئات الفطر 10. وكشفت هذه التسجيلات النشاط العفوي من المستغرب في النملennal مركز ميكانيكية حسية والحركية (AMMC) والفص antennal. وعلاوة على ذلك، الخلية غير متوقعة النشاط المستقل في الدبقية التي تحدث طوال الليل. داخل الجسم فطر حددت الدراسة كلا النشاط منقط واثنين من قمم مميزة، واحدة قصيرة وطويلة واحدة التي تغيرت مع التقدم في السن 10 حالات.
في أحدث دراسة في المختبر، ونحن استخدام التصوير إضاءة الحيوية لدراسة آثار التلاعب من الجزيئات يشير الثانوية المتورطين في الذاكرة، وكيف أنها تؤثر على استجابة الكالسيوم داخل الهيئات الفطر 9. في الواقع، على الرغم من غبي واللفت الأصفر حددت منذ أكثر من 30 عاما ومعروفة لتنظيم مستوى المخيم، في الجسم الحي الآثار على الآليات الخلوية والفسيولوجية وخاصة على -response الكالسيوم 2+ لا تزال مجهولة إلى حد كبير. مع نهج GFP aequorin، وكنا قادرين على تسجيل في وقت واحد كلا من الكأس (ومتطوره شجيريوفاق) وللأجسام الخلايا، فضلا عن التوقعات محور عصبي على مستوى الفصوص، وبالتالي تسمح لنا لربط مستوى والحركية للاستجابة في مقصورات مختلفة من هذه البنية المعقدة للغاية.
تطبيق أحدث أننا تطوير يقلد رد فعل طبيعي من خلال تفعيل مصطنع السكان العصبية قبل المشبكي إلى هيكل الفائدة. للقيام بذلك فإننا نعرب عن مستقبلات P2X 2، قناة الموجبة ليجند بوابات ويستجيب للاعبي التنس المحترفين، في الخلايا العصبية قبل المشبكي والتعبير عن GFP-aequorin في عدد الخلايا العصبية بعد متشابك. الفصل بين هذين العنصرين في مختلف السكان العصبية يتطلب نظامين التعبير منفصلة. تحقيقا لهذه الغاية على LexA بناء يحتوي تم إنشاء GFP-aequorin. في التجارب الأولية لدينا مع هذا النظام أبدينا P2X 2 في مجموعة فرعية من السندات الإذنية باستخدام GAL4-GH146 مع UAS-P2X 2 و GFP-aequorin في الجسم الفطرباستخدام سطر LexA MB247 جنبا إلى جنب مع LexA-13X-GFP-aequorin. لقد سجلت بنجاح الردود الكالسيوم في الجسم الفطر مع التحفيز من 1 ملي ATP لمستقبلات P2X 2 في السندات الإذنية (الشكل 6).
في الختام، وقد ثبت نهج GFP aequorin تلألؤ بيولوجي أن تكون مفيدة في تسجيل التحفيز التي يسببها الكالسيوم 2+ -activity، مماثلة لغيرها من الكالسيوم 2+ -indicators. ولكن الأهم من ذلك أنه يسمح أيضا للكشف عن الكالسيوم عفوية 2+ -activity داخل الدماغ. هذا النهج يفتح آفاقا مستقبلية للتجارب على المدى الطويل وتصوير الدماغ كله يمكن أن تزيد من عمق فهمنا للظواهر فيزيولوجية وأنماط النشاط في الدماغ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | hand made | ||
| incubation box | hand made | ||
| forceps (No. 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | hand made | ||
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80 °C) |
| Microscope | Nikon | Eclipse-E800 | |
| immersion objective lens | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | leica dissection scope and florescent lamp | |
| tight dark box | Science Wares | Custom built by Science Wares | |
| peristaltic pump | Gilson | Minipuls 2 | |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
