Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging strategi som bygger på Bioluminescent Kalcium indikator GFP-aequorin

Published: January 8, 2016 doi: 10.3791/53705
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1
1Equipe: Imagerie Cérébrale Fonctionnelle et Comportements (ICFC), Institut des Neurosciences Paris-Saclay (Nero-PSI), UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud, 2Interdisciplinary Program in Neuroscience, Graduate College, University of Iowa, 3Department of Anesthesia, Carver College of Medicine, University of Iowa

Summary

Här presenterar vi en ny Ca2 + -imaging tillvägagångssätt med hjälp av en självlysande reporter. Detta tillvägagångssätt använder en kondenserad konstrukt GFP-aequorin som binder till Ca 2+ och emitterar ljus, vilket eliminerar behovet av ljusexcitering. Betydligt denna metod medger lång kontinuerlig avbildning, tillgång till djupa hjärnstrukturer och hög tidsupplösning.

Abstract

Funktionell in vivo imaging har blivit en kraftfull metod för att studera funktion och fysiologi av hjärnceller och strukturer av intresse. Nyligen har en ny metod för Ca2 + -imaging hjälp av självlysande reporter GFP-aequorin (GA) har utvecklats. Denna nya teknik bygger på en sammanslagning av GFP och aequorin gener, som producerar en molekyl som kan binda kalcium och - med tillägg av sin cofaktor coelenterazine - avger starkt ljus som kan övervakas genom en foton samlare. Transgena linjer som bär GFP-aequorin-genen har tagits fram för både möss och Drosophila. I Drosophila, har GFP-aequorin-genen placeras under kontroll av GAL4 / UAS binära uttrycket system som möjliggör riktade uttryck och bildbehandling i hjärnan. Denna metod har senare visat sig kunna upptäcka både inåt Ca2 + -transients och Ca2 + -released från inner butiker. Viktigast det möjliggör en större längd i kontinuerlig inspelning, bildbehandling på större djup i hjärnan, och inspelning med hög temporal upplösning (upp till 8,3 ms). Här presenterar vi den grundläggande metoden för att använda självlysande avbildning att registrera och analysera Ca2 + -activity inom svamp organ, en struktur centralt för inlärning och minne i gylfen hjärnan.

Introduction

Den grundläggande mönster och funktion aktivitet i hjärnan och dess diskreta strukturer har länge varit ett område med intensiva studier inom området neurovetenskap. Kanske några av de tidigaste framgångsrika metoder som används för att behandla denna fråga var direkt fysiologisk mätning av förändringen i elektrisk aktivitet - men alternativa metoder som möjliggör levande avbildning av förändringar i spännings, pH eller kalciumkoncentrationer (som mått på aktivitet) har medfört nya möjligheter till studiet av nervaktivitet 1. Avbildningstekniker har ett brett utbud av fördelar såsom minskad invasiv och förmågan att övervaka aktiviteten inom hela hjärnstrukturer. Dessutom hos djur med lätthanterliga genetik inklusive bananflugan Drosophila, utvecklingen av genetiskt kodade kalcium indikatorer, såsom Cameleon, GCaMPs och övriga 1 har gjort det möjligt för forskare att övervaka enskilda nervceller, neuronala populationer och hela hjärnanstrukturer. Även mer traditionella fluorescerande kalciumavbildningsmetoder med hjälp av GCaMPs (GFP smält till kalmodulin) eller FRET (GFP och YFP smält till kalmodulin) har visat sig vara användbara tekniker som ger god spatial och temporal upplösning, den bakomliggande processen av ljus excitation framkallar vissa begränsningar på dess experimentella applikationer. På grund av ljusets natur excitation, autofluorescens, fotoblekning och fototoxicitet är oundvikligen produceras, vilket följaktligen begränsar djupet av de strukturer som kan avbildas, hur länge inspelningar samt realtids kontinuiteten i inspelningen. Med andra ord måste inspelningar ofta utföras intermittent för att undvika dessa oönskade bieffekter.

På grund av dessa utmaningar har ytterligare alternativa metoder för kalcium avbildning utvecklats. En av de mest lovande metoderna är självlysande avbildning, som bygger på ljus som produceras genom en enzymatisk reaktion efter kalciumbindande. Bioluminescent avbildning kräver inte lätt excitation och därmed inte upplever samma svårigheter som konventionell kalcium avbildning. Bioluminescent reporter Aequorin - isolerad från Aequorea Victoria, samma maneter från vilket GFP också isolated- binder kalcium via sina tre EF handen strukturer och undergår en konformationsförändring, vilket leder till oxidation av dess kofaktor coelenterazin och frisläppandet av blått ljus (λ = 469 nm) 2,3. Aequorin har en mycket låg affinitet för kalcium (Kd = 10 nM), vilket gör den idealisk för övervakning av kalcium transienter eftersom det ger mycket lite bakgrundsljud och inte stör den intracellulära kalciumbuffertsystem 4. Även aequorin har tidigare använts för att övervaka processen för neural induktion i Xenopus ägg 5 ljuset som produceras är för svag för att användas för realtids avbildning av nervaktivitet. I ett försök att ta itu med denna utmaning, Philippe Br &# 251; låt och kollegor vid Pasteurinstitutet skapade en genetisk konstruktion fusing GFP och aequorin gener, imitera det nativa tillståndet inom maneter 4. Detta fusions genprodukten binder kalcium återigen via de tre EF handen strukturer av aequorin, som genomgår en konformationsförändringar som leder till oxidation av coelenterazin, som överför energi icke-radiativt till GFP. Denna energiöverföringsresulterar i frisättning av grönt ljus (λ = 509 nm) från GFP, istället för blått ljus från aequorin. Sammansmältningen av GFP och aequorin ger också större proteinstabilitet hjälpa fusionsprotein producerar ljus 19 till 65 gånger starkare än aequorin ensam 4. Med hjälp av en självlysande tillvägagångssätt i hjärnan utökar nuvarande försöket med kalcium imaging både när det gäller längden på kontinuerlig inspelning och antal strukturer i hjärnan som kan spelas in. I stora drag i samband med tidigare arbete det innebär att både global och en störrekan övervakas olika regionaliserad "aktivitet" i hjärnan (genom fullmakt av kalcium transienter). Ännu viktigare aktivitet kan övervakas under längre tid, i realtid och fortlöpande, som lätt lämpar sig för att uppnå en fullständig förståelse av basala funktion i hjärnan.

Under de senaste åren har vårt labb och andra utvecklade transgena flugor som uttrycker GFP-aequorin under kontroll av den binära expressionssystemet (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6. Vi har använt GFP-aequorin bioluminescens för att spela in aktivitet som produceras av naturliga stimuli såsom doft 7,8, såväl som studerade cellkomponentema modulerar Ca2 + -activity i svampkroppar följande acetylkolinreceptorstimulering genom direkt nikotin tillämpning 9. Dessutom har vi också använt GFP-aequorin att ta itu med ett antal experimentella frågor som inte har kunnat tas upp tidigare, som på lång siktavbildning av spontana kalcium transienter och visualisering av djupare hjärnstrukturer 10. På senare tid har vi använt GAL4 / UAS-system för att uttrycka däggdjurs ATP-receptorn P2X 2 11 en katjon kanal i projektions nervceller (PN) och använde LexA-systemet för att uttrycka GFP-aequorin i svamporgan (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (en artighet av B. Pfeiffer, Janelia Farm, USA). Detta har gjort det möjligt för oss att aktivera PNS genom applicering av ATP, som i sin tur aktiverar svampkropparna (en nedströms målet för den PNS), imitera flera fysiska förhållanden, såsom svar på en lukt stimulans. Sammantaget denna teknik kombinerar P2X 2 och GFP-aequorin utökar de experimentella möjligheterna. I stora drag det ger en möjlighet att bättre förstå aktivitetsmönster i hjärnan, att inleda nya studier om hur olika stimuli och störningar kan ändra den basala mönstring av aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av prover

  1. Beredning av lösningar och ställa in
    1. Behåll alla Drosophila melanogaster linjer vid 24 ° C på vanliga livsmedel medium. Bakre och hålla dem vid låg densitet i flaskan för att generera standardiserad storlek och vikt av flugor.
      1. Tillsätt 10 nyproducerade honor med 10 män i en flaska, låt dem para sig och överföra dem varje 2 dagar till en ny flaska. Därefter 10 dagar senare, när flugorna börjar Eclose, skörda flugorna varje dag. Håll en exakt redogörelse för ålder flugor och hålla dem i gott skick.
      2. På dag 3, separera hanar från honorna och hålla honorna 20 flugor per flaska. Spela flugorna på 4 eller 5 dagar gammal.
    2. Bered Ringers lösning med följande koncentrationer: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, och 36 mM sackaros och justera pH hos lösningen till exakt 7,3. Förbered perfusionslösningar av 25 μ, M nikotin och 100 mM KCl i Ringers lösning.
    3. Förbered 1000 mikroliter pipettspets: med ett rakblad form tips till en vinkling (ca 35 ° från slutet av spets) och avlägsna överskott av bas än 1 ½ cm från spetsen.
    4. Förbered box för förvaring (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) prov under inkubation. Placera två svampar (12 cm x 8 cm x 3 cm) mättade med vatten i botten [för att förhindra prov uttorkning] under en liten rack apparat för att placera prover på när deras framställning är klar.
    5. Förbered flugor prover så att de innehåller minst en kopia av UAS-GFP-aequorin och en kopia av en Gal4 linje för att driva uttryck av GFP-aequorin. OK107 Gal4 linje (en linje driver uttryck främst i svamp organ) korsas med UAS-GFP-aequorin i denna beredning.
      OBS: Insidan av boxen måste vara vattentäta och utsidan måste blockera ljus från att komma in rutan för att förhindra nedbrytning av coelenterazin under inkubation.
  2. Prepdelser av prover
    1. Ice söva Drosophila genom att överföra dem till en glasflaska och hålla på is under 2 minuter innan de flyttas till den kylda petriskål för positionering i pipettspetsen. Förbered pipettspetsar på lätt fuktad filterpapper i 100 ml petriskål på is under dissektion mikroskop.
    2. Försiktigt med pincett plats flyga inuti pipettspetsen.
    3. Med hjälp av en pensel tryck försiktigt och anpassa farten så att huvudet är helt förbi kanten på spetsen och rygg regionen delvis exponeras genom sektionen avlägsnas under spetsformning (Figur 2B).
    4. Kombinera en liten (ca 3-4 | il) partierna av de två komponenterna i tand lim. Applicera limmet försiktigt runt fram och bak huvudet och nacken ner till och runt pipettspetsen kanten - undvika hjässan. Låt limmet torka i 2 minuter.
    5. Placera pipettspetsen med limmad fly genom hålet i inspelningen kammaren (Figur 2D) och gently på för att säkra på plats.
    6. Kombinera de två komponenterna av kisel lim (ca 3-4 | j, l). Applicera lim på den platta sidan av kammaren längs kanten där kammaren och pipettspetsen möts för att förhindra läckage av Ringers lösning. Låt limmet torka i 2 minuter.
  3. Dissektion
    1. Fäst tejp över perfusionen kanalen, kortsidan och sträcker sig till baksidan av kammaren.
    2. Placera kammare med fluga på dissekering kloss under mikroskop sväng på lysrör. Pipettera 1 ml av Ringers lösning in i kammaren.
    3. Använd fin kirurgisk kniv för att ta bort nagelbanden. Gör parallella snitt från baksidan av huvudet till antenn region. Skär sedan längs kanten av ögat sedan göra en vinkelrät snitt ovanför antenn som förbinder de tidigare snitt. Gör en slutlig snitt parallellt med det på baksidan av huvudet. Använd de fina vassa pincett för att ta bort nagelband (Figur 2C).
    4. Använd fin vassa pincett för att försiktigt ta tag end rensa bort exponerad andnings vävnad tills hjärnan och [fluorescerande] svampkroppen är tydligt visualiseras.
    5. Använd ultraskarp pincett för att försiktigt tag och nypa neuroepiteliala vävnad som täcker hjärnan för att möjliggöra genomträngning av coelenterazine.
      OBS: Alternativt papain kan användas för att permeabilize neuroepithelia 9.
    6. Med användning av en pipett, tvätta två gånger med Ringers lösning för att avlägsna eventuellt skräp från dissekering och plats provet i den fyllda rutan.
    7. Pipettera 1 ml av Ringers lösning innehållande 5 pM bensyl-coelenterazin in i kammaren. Stäng lådan och tillåta inkubation med coelenterazin vid RT under ett minimum av 2 timmar.

2. Imaging

  1. Inrätta
    1. Starta inspelningen systemet: vrid på mikroskop, dator, kamera och dräneringssystem och ställ rum miljökontroller till 25 ° C.
    2. Öppna Mätning och Automation Explorer program på datorn. Klicka på “ Apparater och gränssnitt ", dubbelklicka på" NI Motion Devices "och slutligen högerklicka på" PCI-7334 "och välj" initiera enhet ".
    3. Öppna Photon Imager. Skapa en ny mapp och namnge första inspelade filen. Kamera måste nå -80 ° C innan systemet kommer att fungera.
    4. Konfigurera perfusionssystemet - lägg KCl, nikotin, och Ringers lösning till reservoarer och justera så att varje utsläpp lösning vid 2 ml / min. Tvätta med Ringers lösning före start experimentet.
  2. Förbered provet
    1. Placera imaging montera blockera maträtt på berget under mikroskop vid 5x förstoring och sätt perfusion röret in i kanalen genom punktering.
    2. Ställ mikroskop för att fluorescerande läge då centrum och ta svamp organ (MBS) i fokus. Justera till 20X och åter centrum och fokus.
    3. Position dräneringsapparat över dränering pool, justera höjden på dränerings shunten så att spetsen är bara Above pool, och kör Ringers lösning under 30 sekunder för att säkerställa tillräcklig dränering.
    4. Dra ner sköld för att täta apparaten från ljus. Använda det automatiska systemet i fotonkameran finjustera fokus och ta ett referens fluorescerande bild av MBS.
  3. Inspelning
    1. Justera foton hastigheten till inspelning önskad hastighet (från 50 msek till 1 sekund eller mer). Välj fotonläge och öppen slutare. Spela genotyp, kön, ålder och provnummer i loggposter. Justera positionen ROI lådor över blomfoder och cellkroppar (CCB) och mediala lober genom att klicka på ROI rutor och dra medan du håller kontroll.
    2. Spela in baslinje under omkring 5 till 10 min (efter önskemål).
    3. Applicera nikotin för en minut. Obs start / stopp i loggen. Tvätta med Ringers lösning under 5 min.
    4. Vänta 5 minuter för återvinning och förbereda KCl loggposten och timer.
    5. Applicera KCl för 1 min. Obs start / stopp i loggen. Tvätta med Ringers lösning under 1 min.
    6. Växlafluorescerande läge, ta slutlig fluorescerande bild, och stäng av Ringers lösning.
    7. Tryck på "Stop". Dialogruta kommer att be att stänga av systemet. Välj "Nej" för att fortsätta inspelningen.
    8. Öppna sköld, flytta dräneringssystem, switch objektiv till 5X, ta bort perfusion röret. Ta prov / inspelning maträtt från scenen, rensa bort 20X lins genom att skölja och torka linsen två gånger med vatten.
    9. Tryck den vita play-knappen längst upp i programfönstret för att påbörja nästa inspelning.

3. Analys och Video Creation

  1. Extrahera fotonvärdena
    1. Öppna fotonanalysprogrammet (t.ex. Photon Viewer) och öppna första prov kalkylbladsfil.
    2. Välj fliken display kontroll. Välj ROI genom att klicka på området samtidigt som du håller kontroll. Justera storlek, orientering och form av regioner av intresse att omfatta GFP upplyst CCB och mediala lober.
    3. Lägg till ett tilläggal ROI genom att klicka på "Definiera ROI" och klicka och dra på skärmen för att skapa nya ROI.
    4. Välj "Film" -fliken för att spela foton video. Justera "sec bredd" och "sek steg" som önskas. Justera ROI placering såsom nödvändigt.
    5. Välj representativa skärmdumpar av GFP fluorescens, nikotin respons och KCI svar. Beskär skärmdumpar och klistra bild till en presentationsbild för senare analys och jämförelse.
    6. Justera både "sec bredd" och "sek steg" till inspelningshastigheten på några sekunder. Välj längden på analys genom att flytta grå markörer på övre panelen konsolen region innan stimulans initiering och strax efter svar slut.
    7. Välj "Häng vyer när du spelar" press "<< REW" och tryck på "PLAY>". Välj fliken "Count Rate Chart" och justera enheter som önskat och linje färger som matchar ROI färg.
    8. När analysen är klarTryck på "Exportera Count Rate data". Välj skärmdumpar av kombinerade inspelningar CCB och mediala lob regionen av intresse från båda sidor. Beskär skärmdumpar och klistra bild i ett bildspel med svars bilder. Denna bild kommer att senare användas i slutändan.
  2. Exempel Analys: en metod för analys av extraherade foton uppgifter detaljerade
    1. Öppna kalkylbladsfiler i "räknehastighet Export" mappen.
    2. Formatera cellerna första kolumnen tid att visa tiden i timmar och minuter.
    3. Referens motsvarande bild för provet. Ta bort alla värden utom kolumnerna för tid och två företrädare ROI.
    4. Bestäm nikotin stimulerings starttid - finns i loggpost filen i huvud mapp- bort ytterligare data före start eller markera värdet.
    5. Hitta högsta / toppvärde för både CCB och mediala lob och markera / highlight.
    6. Bestäm svar start- och sluttid för bådeCCB och mediala lob genom att skapa en uppskattning med hjälp av tidpunkt från motsvarande grafiskt svar på bilden och välj verkligt värde med värdeförändring i närheten av dessa punkter. Markera området mellan dessa punkter i både CCB och mediala lober. Alternativt kan du använda ett makro 9.
    7. Kombinera alla prover av en experimentgrupp på ett nytt kalkylblad.
    8. Passa på topp genom att bestämma radvärde är för varje CCB toppvärde. Subtrahera de lägre värden från det högsta raden värdet för att bestämma ungefärlig radvärde när detta exempeldata måste kopieras till. Kontrollera att alla toppvärden är i linje.
    9. Kopiera arket två gånger och ta bort antingen mediala lob kolumner eller CCB kolumner skapar sidor endast CCB eller mediala lob värden.
    10. Ta bort data efter alla CCB svar har avslutats. Skapa fyra rader märkt Totalt Fotoner, svars Längd (varaktighet), Peak Amplitude och responslatens. Kopiera och klistra in den här igen under originalen.
    11. Använd funktionen SUMMA för bestämning av de totala fotoner under svar. Använd funktionen COUNT för att bestämma längden på respons. Kopiera och länka högsta värdet cell för att bestämma topp amplitudvärdet. Använd funktionen COUNT - välj från början av perfusion av nikotin till början av svaret - att avgöra Response latens.
    12. Kopiera värden med hjälp av länkfunktionen och multiplicera (alla utom toppamplitud) genom inspelningshastighet på några sekunder.
    13. Bar / box grafer kan skapas för beräknade parametrar såsom Totalt Fotoner, Peak Amplitude och svar Längd, om så önskas (ex .: figur 5B, C, D).
    14. I kolumnen efter rådata foton svar det genomsnittliga rådatapunkter för varje tidpunkt med hjälp av genomsnitts funktion. Om så önskas kan följa med en kolonn om fastställande av standardavvikelsen för medelvärdet (SEM), för vart och ett av de genomsnittliga fotonvärdena vid en tidpunkt.
    15. Använd den genomsnittliga kolumnen för att konstruera en genomsnittlig svars profile [Graf] för CCB urvalsgrupp. För att göra detta väljer du kolumnen som anger tiden som x-axelvärden och kolonnen av den genomsnittliga foton värden som y-axeln och slutligen välja verktyget Scatterplot graf skapande.
    16. Upprepa denna analys förfarandet med data från de mediala lober.
  3. Skapa bilder för video
    1. Öppna foton tittaren.
    2. Välj display kontroll flik. Klicka på ROI samtidigt som du håller för att välja, ta bort och / eller minimera den.
    3. Ändra "sec bredden" (ackumuleringstid) som önskvärt att bestämma innehållet i varje bildruta.
    4. Ändra "sec steg" för att definiera överlappningen av varje ram.
    5. Välj "åsikter export medan du spelar" press "<< REW" och sedan "PLAY>". Bilderna för video kommer att exporteras till mappen "visa export" som en serie .png-filer.
  4. Med hjälp av Virtual Dub att göra video: en metod för video creation detaljerad
    1. Skapa en ny mapp med namnet "résultats" i mappen visa exporten som innehåller bilderna.
    2. Ta script (renommer.VBS) i mappen med bilder.
    3. Dubbelklicka på renommer.VBS att köra.
    4. Bilder kommer automatiskt att döpas numeriskt och kopieras till mappen "résultats".
    5. Öppna VirtualDub.exe.
    6. Välj öppna videofil - välj första bilden (efterföljande bilderna automatiskt laddas).
    7. Välj video - välj bildhastighet justera enligt önskemål.
    8. Välj video - välj komprimering väljer Cinepak Codec med radien.
    9. I fil väljer du Spara som AVI videon kommer att skapas automatiskt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammansmältningen av GFP till aequorin tillåter oss att visualisera vår region av intresse före självlysande avbildning genom excitation av GFP i fluorescerande läge på mikroskop (Figur 3A, 4A, 6A, 6E). Ett av de enklaste sätten att stimulera svamp organ är genom aktivering av jonotropa nikotinacetylkolinreceptorer. Även acetylkolin är den endogena liganden för denna receptor har vi funnit att nikotin ger mer reproducerbara svar i svampkroppar. Detta beror delvis på att de specifikt uttrycka nikotinacetylkolinreceptorer, och sålunda genom användning av nikotin kan vi undvika aktivering av muskarinacetylkolinreceptorer uttryckta på andra ställen i hjärnan. Dessutom är nikotin mer stabil än acetylkolin, och medger sålunda bättre och mer tillförlitlig stimulans kontroll. En typisk reaktion inleds med den snabba aktivering av både blomfoder, cellkroppar (CCB) och mediala lober (ML) (se figur 4A för märkt bild). Generellt CCB svaret varar längre och uppvisar en större bioluminiscent respons än loberna, såsom visas i de sekventiella paneler av svaret (fig 3C-H). Figur 4B visar en 10 sek ackumulering av fotoner som registrerats vid en tidsupplösning på 100 ms (10 Hz) under toppen av ett svar på en 1 min perfusion av 25 iM nikotin. Efter en washout och återhämtningsperiod på 10 minuter en andra stimulering av en 1 min perfusion av 100 mM KCl initieras (figur 4C, E) som tillåter oss att bekräfta lönsamhet vårt urval. De kvantitativa svar kan analyseras genom att välja ROI under analysen i foton betraktaren. Köra analysen i fotonen tittaren producerar både grafer visar antalet fotoner som avges i vald ROI över tiden (Figur 4D och E) samt exporteras kalkylblad av dessa värden. Figur 4D är en example av graferna produceras av foton tittaren plotta fotoner som avges i ROI 2 [grön] (höger CCB) och ROI 4 [blå] (höger medial lober). Liknande uppgifter för KCI svar som visas i figur 4E. Exporterade data kan användas för att rekonstruera kurvan av svaret (figur 5A) och för att extrahera ytterligare data om olika parametrar såsom varaktighet, toppamplitud, och total respons (figur 5B-D). Nyligen med hjälp av Gal4-UAS och LexA system som vi har utarbetat en metod för att framkalla en mer naturlig reaktion. I korthet är ATP-gated P2X 2 katjon kanal uttryckt i projektions nervceller (PN) och GFP-aequorin (GA) uttrycks i svamporgan - ett mål av PNS, detta ger oss möjlighet att selektivt excitera PNS fastän tillämpning av ATP, som kan i sin tur producera respons i svamporgan (fig 6).

Figur 1 Figur 1. Kännetecken för Bioluminescent Reportrar (GFP-Aequorin). (A) Schematisk bild av GFP och aequorin fusionsgenen med uppströms aktiveringssekvens. (B) Modell av blått ljus utsläpp genom aequorin som svar på höga nivåer av Ca2 +. (C) Modell av grönt ljus utsläpp genom GFP-aequorin som svar på höga nivåer av Ca2 +. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Experimentell inrättas. (A) Fly läge i pipettspetsen. (B) En illustration av adekvat limningsteknik stabilisera huvudet och tätning av området mellan fluga kroppen och pipettspetsen. (C) Schematisk bild av dissektion att öppna huvudet kapsel. (D) 1 ml kammare på att hålla blocket med perfusion slang in. Totalt kammar dimensioner: längd: 7,4 cm, bredd: 2,7 cm, höjd: 0,55 cm. Inre kammar dimensioner: längd: 1,7 cm, bredd: 1,4 cm, höjd: 0,35 cm, och radie av kammarhålet: 0,1 cm. (E) Vy över fluga huvud visar GFP-positiv signal i MB: låg svagt ljus med fluorescens som härrör från OK107 drivna GFP-aequorin efter borttagning av nagelband. (F) Mikroskop med foton kamera och perfusionssystem. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Representant svar på 25 iM nikotin i svamp organ. (A) Fluorescerande bild avGFP-aequorin uttryck i svamp organ GA2 / +; OK107 / + kontroll fly hjärnan (skala bar = 50 pm). (B) Peak bioluminescerande respons i svamp organ. (C) före stimulering. (D) Start respons. (E) Peak svar. (F) Fortsatt CCB svar. (G) Fallande CCB svar. (H) Slut på svar (BH: skala bar = 33 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Representativa analys av provinspelning (A) Lysrör bild av svamp kropp GA2 / +,. OK107 / + kontroll flyga med fyra ROI väljs över CCB och mediala lober (skala bar = 50 pm). (B) 10 sek ackumulering av bioluminescent reaktion till 25 iM nikotin - foton utslag registreras på 100 ms. (C) 10 sek ansamling av självlysande svar på 100 mM KCI registrerades vid 100 ms. (D) Diagram av registrerade antalet fotoner som avges under nikotin svar inom ROI 2 och 4 täcker rätt CCB och mediala lober respektive. (E) Diagram av registrerade antalet fotoner som avges under KCl svar inom ROI 2 och 4 täcker rätt CCB och mediala lober, respektive. I d och e motsvarar den vänstra Y-axeln till det totala antalet fotoner inom hela synfältet, medan den högra Y-axeln motsvarar fotoner inom ROI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Bild Figur 5. Representativa parametrar analys av provinspelning representant excel analys av den självlysande svar på nikotin aktivering av svampkroppen i GA2 / +,. OK107 / + kontroll fluga. (A) Photon svar över tiden i CCB och mediala lober. (B) Varaktighet av svaren i CCB och mediala lober. (C) Högsta foton värde (maximal amplitud) under svar inom CCB och mediala lober. (D) Totalt fotoner inom CCB och mediala lober hela svaret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Två olika respons i svamp kroppar efter stimulering av PNS thrgrundlig ATP och P2X 2. Prov 1 flyga uttrycker P2X 2 i PNS och GFP-aequorin i svamp organ (GH146 / +; P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (ad) (A) Fluorescerande bild av svampkroppar med ROI (skala. bar = 50 nm). (B) Bioluminescent bild av sin maximala känslighet i svamp organ efter aktivering av PNS från P2X 2 stimulerade med 500 iM ATP, som observerats främst i mediala lober. (C) Bioluminescent bild av topp KCl svar. (D ) Tidsförloppet av fotonemission inom ROI regioner, hela svaret Prov 2 fluga uttrycker P2X 2 i PNS och GFP-aequorin i svamp organ (GH146 / +;. P2X 2 / MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP (eh (F) Bioluminescent bild av det inducerade svar i svamp organ efter a). (E) Fluorescerande bild med ROI (skala bar = 50 pm).ctivation av PNS från P2X 2 stimulerades med 1 mM ATP, både lober och CCB. (G) Bioluminescent bild av topp KCl svar. (H) Tidsförloppet för fotonemission inom ROI regioner, hela svaret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nyligen utvecklade bioluminescent baserade GFP-aequorin tillvägagångssätt presenteras här tillåter in vivo-funktionell inspelning av Ca2 + -activity i olika neuroner, såväl som, om så önskas, i andra typer av celler såsom njure stellatceller såsom rapporteras i Cabrero et al., 2013 5.

Ändringar, felsökning, ytterligare komponenter, och kritiska steg

Drosophila Husbandry

GFP-aequorin transgenen (pG5A) 4 insattes i pUAST vektorn för att skapa tre oberoende transformanta linjerna 6. Alla linjer testades för sin mareld, och alla kunde svara på in vivo Ca2 + -activity 6. Nyare experiment har dock påpekat att GA2 rad införas på tredje kromosomen genererar mer robust signal än GA1 rad införas on den andra kromosomen. Här var de representativa resultat som uppnåtts genom användning av UAS-GA2 korsade med MB-specifik linje OK107. Dessutom nyligen B. Pfeiffer har genererat en GFP-aequorin konstruktionen placeras under kontroll av 20XUAS regulatoriskt element (20X-G5A-2) och denna konstruktion har godkänts i vårt labb. Kortfattat, ger det en mycket stark signal, starkare än vår standard GA2, vilket bör därför vara mer effektivt och användbart för att ytterligare övervaka Ca2 + -activity i djupare strukturer i hjärnan, exempelvis ellipsoiden kroppen. Dessutom kan det också vara användbart för avbildning av små mängder av neuroner eller i axon terminaler (synaptiska kontakter).

Förberedelser för Imaging

Även flugan måste is bedövas under positionering och limning, är det viktigt att minimera tiden på isen. Flugor bör överföras till en glasflaska och förvarades på is under 2 minuter innan de flyttas till den kylda petriskålför placering i pipettspetsen. Vi har märkt att förlängd tidsperiod av anestesi minskar lönsamheten för provet och kan dämpa svaret. Optimalt, vi håller tiden is anestesi under 5-10 min.

Tejpning och limning är kritiska steg. Det är mycket viktigt att säkra flugan huvudet på plats för dissekering och avbildning samt att förhindra läckage av Ringers lösning i pipettspetsen och / eller ut från inspelningen kammaren. Dental lim (och i mindre utsträckning kisel lim) kommer att bli klibbiga och därefter börjar torka, så snart som de två komponenterna kombineras. Därför är det kritiskt att applicera limmet dröjsmål för att undvika svaga bindning och klumpning av limmet. I vissa fall har vi märkt att alternativa varianter av tejp och lim, när den är i kontakt med Ringers lösning, kan frigöra föroreningar in i Ringers lösning, som kan påverka farten och dess svar, i synnerhet så för experiment dedikerad till than studie av luktsystemet, med hjälp av olika dofter. Följaktligen försiktig här om att ersätta material (se material för specifika sorter vi använder).

Flera olika former av coelenterazin har utvecklats i syfte att optimera sin verksamhet som ljusets hastighet emission, Ca2 + -affinity (känslighet), eller intensiteten hos ljusemissionen 12. Till exempel är mer stabil, vilket således mer lämpade för långtids avbildning som flera timmar den nativa coelenterazin, medan bensyl-coelenterazin (benämnd även h-coelenterazin) resulterar i en snabbare och högre ljusemission med kortare halveringstid. För ytterligare information om olika former av coelenterazin, se webbadressen i materiallistan.

Imaging

Mareld signaler kan övervakas med en elektron multiplikator CCD-kamera (EM-CCD, kyld till -80 ° C) monteras på ett mikroskop. Denna inställning måste be inrymt i en tät mörk låda för att undvika oönskade (omgivande) ljusförorening. Installationen som beskrivs i detta manuskript använder en 20X nedsänkning-objektivlins tillåter ett synfält på 400 x 400 ^ m (512 x 512 pixlar). För att förbättra signalbrusförhållandet, var data som förvärvats med en 0,100 sek integreringstid (10 Hz), och 2 x 2 binning användes (1 pixel = 1,2 x 1,2 pm). Att förvärva och lagra data, var varje detekterad foton tilldelade x, y-koordinater och en tidpunkt. Mellan 500 och 600 nm våglängd, EM-CCD-kamera (se exakt beskrivning i Materials List) har en kvantumeffektivitet på 96%.

En av de mest avgörande parametrarna för den funktionella hjärnavbildning in vivo är den temporala upplösningen. Hittills står för de flesta fluorescensbaserad Ca2 + -imaging teknik såsom GCaMP och came en tidsupplösning av omkring 4 Hz (250 ms / ram). Nyligen, med bioluminescens baserade GFP-aequorin vi har kunnat raise förvärvstiden upp till 100 ms / ram med EMCCD kameran och ända upp till 120 bilder / sek (8,3 ms / ram) med elektron multiplikator ICDD kamera 10. Vid denna temporala upplösningen närmar sig den hos de elektrofysiologiska tekniker (i intervallet från omkring 1 msek). Även hög tidsupplösning är både informativ och avgörande för studierna tillägnad synaptisk transmission och stimulans inducerad aktivitet, förlängt långsammare än nödvändigt Ca2 + -kinetics förekommer även inom nervceller, till exempel Ca 2 + frisättning från intracellulära Ca 2 + -stores (för en översikt: Berridge et al, 2003 13.). För denna senare typ, är en långsammare tidsupplösning fortfarande acceptabelt, medan omvänt, de i allmänhet kräver en bättre Ca2 + -affinity från sensorn som skall detekteras. Detta krav har uppnåtts med GFP-Aequorin att detektera frisläppandet av de intracellulära Ca2 + -stores på axonet terminalen av lukt receptORS nervceller 7,8. Alternativt, beroende på de önskade försöksbetingelser, långsammare förvärvstiden kan användas. Till exempel, i långa O / N-inspelningar, har vi använt en 2 sek integrations gånger på grund av det stora antalet datapunkter som samlats (Minocci et al., 2013). I korthet, är en praktisk funktion med bioluminescens att den temporala upplösningen kan enkelt justeras i enlighet med de önskade försöksförhållanden.

Alternativa kammare (flugans inställnings) har utvecklats för att underlätta målen för försöket. Till exempel, för studier baserade på naturliga lukt stimulans, antennen måste hållas fria, därför en strategi som den utvecklats av A. Fiala 14 är bäst lämpad (vi använde en liknande strategi för Murmu et al. 2010). I korthet, i denna metod, är i farten tjudrad (limmade) på en minutien tapp vid halsen, som är limmad till en plasttäckremsa som innehåller ett litet hål. En tätning är skapadrunt toppen av huvudet på flugan. Därefter görs en droppe av ringsignal avsatt på huvudet, och huvudet kapsel dissekeras. På ett sådant sätt, är antennerna hålls fria och finns tillgängliga för att avkänna lukter. På samma sätt, på lång sikt inspelningen, som O / N eller ens några dagar 10 flugan behöver hållas så fria från tvång som möjligt, och i vissa fall matas (till exempel: med en kapillär papper indränkt i en 5% glukos lösning). Under dessa omständigheter Fiala strategi är också mer lämplig än den strategi i den blå pipettspetsen (snorkling metoden).

Alla läkemedels program kan styras externt med en 6 sätt flera ventiler gravitation perfusion systemet. Flödet kan regleras med användning av volymetriska perfusion regulatorer kalibrerade före varje inspelningssession för ett flöde på 2 ml / min. Dränering apparat extraherar vätska vid en hastighet av 2 ml / min från registreringskammaren via peristaltisk pump som medger ett kontinuerligt flöde.

Ivissa villkor, på grund av dyra kostnaden för läkemedel och / eller mängden läkemedel att använda, skulle en vilja tillämpa endast små mängder av föreningar. Således är det nödvändigt att direkt tillämpa den i badet i stället för genom perfusionssystemet. I detta fall måste luckan vara stängd under denna process för att undvika ljuskontaminering.

Analysmetoder

Räknar per sekund eller pulser per sekund per koordinat har både använts av vår grupp för analys. Räknar per sekund är kanske bäst för ljusa svar i hela strukturer medan pulser per sekund och per koordinat (vilket motsvarar en normalisering av svaren på storleken på ROI) är bäst lämpad och korrekt för små populationer av celler. Båda av dem kan lätt väljas i analysprogram.

En av de viktigaste fördelarna med att använda mareld tillvägagångssätt är det sätt som förvärvas och lagras data (x, y, t parametrarvarje emitteras fotoner). I själva verket, medan andra avbildningstekniker används standardläge som förvärvat full bild (i allmänhet i en tiff-format), med detta system, förvärvar vi bara relevant och viktig signal genom att lagra endast pixelkoordinater som har aktiverats av ljuset under en förhand bestämd tidsvaraktighet (som motsvarar ackvisitionstiden eller temporal upplösning). Följaktligen är lagring av uppgifter verkligen "light" jämfört med lagring en hel bild, och därmed gör det lättare att analysera data. För dataanalys, använder vi en tillhörande programvara (foton viewer), som möjliggör inställning av ansamling tidpunkt som önskas. Då kan justeras visningen av en bild av signalerna som önskas i ett mål att på ett övertygande sätt presentera data. Parallellt resultaten kvantifieras på samma upplösning tiden anskaffningstiden.

Betydelse och biologiska tillämpningar av självlysande avbildning

Som nämnts ovan självlysande kalcium imaging erbjuder tre huvudsakliga fördelar med att fluorescerande kalciumavbildningstekniker: (1) en djupare områden av hjärnan kan avbildas, (2) avbildning kan ske kontinuerligt under längre löptider som flera timmar som O / N och även i vissa fall upp till två dagar, och (3) på senare tid, med en högre tidsupplösning, upp till 120 bild / sek (8,3 msek). Den största begränsningen av den självlysande inställning beror på dess oförenlighet med konfokal belysning, som följaktligen inte möjligt för oss att fastställa den exakta djup (z-planen) av de aktiverade strukturer eller nervceller.

Den första fördelen med självlysande avbildning, avbildning av djupa hjärnregioner, har tidigare visats i 2007 av avbildning av en hög kalium inducerad kalcium svar inom ellipsoiden kroppen (eb), en djup struktur som ligger i mitten av hjärnan, utan föregående elektrofysiologiska eller funktionella rapporter 6 Ca2 + -activity i eb efter applicering av pikrotoxin (en blockerare av GABA A-receptorer) som visar att GABAergiska ring neuroner i eb är verkligen hämmande neuroner (beskrivs i ett mer aktuellt exempel :. Blöja et al, artikeln lämnas).

Den andra fördelen, längre och kontinuerlig tidsregistrering, har utnyttjats i flera studier från vårt laboratorium. Lukt stimulering har använts för att undersöka aktiviteten hos hjärnans nervceller i tidigare studier 11,15,16. Använda längre sikt avbildning har dock vårt labb kunnat visa tidigare oredovisade förändringar i kinetik inom luktreceptor nervceller till lukter. Den första studien av Murmu et al., (2010) visade att medan korta luktstimuli (1-3 sek) uppvisade liknande kinetik och en måttlig skillnad i amplitud, en längre lukt stimulans (5 sek) orsakade en mycket större amplitud samt en ändras i kinetik / structure av svaret som tillskrevs intracellulära kalcium butiker. En senare studie visade att medan 5 varandra tillämpningar av 1 sek lukt pulser på 5 minuters intervall inte ändra sin kalciumsvar, ökning av längden av stimulans till 5 sek ledde till progressiv dämpning av svaret, vilket tyder på en anpassningsprocess. Även denna anpassning fenomen föreföll initieras av GABAergic reglering av tidigare identifierade kalcium butiker 8. Viktigt dessa data visar också att i detta experimentella tillstånd, kan GFP-aequorin är Ca2 + -givare upptäcka och följa kalcium frigörs från intracellulära Ca 2 + -stores. En ytterligare unik studie från vårt labb används självlysande avbildning O / N för att spela basala (spontan) aktiviteten i hela neuronala och gliaceller populationer i hjärnan samt aktiviteten i svampkroppar 10. Dessa inspelningar visade överraskande spontan aktivitet i antennal mechanosensory och motorkärna (AMMC) och Antenn lob. Dessutom oväntad cell självständig verksamhet i glia inträffar hela natten. Inom svamp kroppen studien identifierade både punktat aktivitet och två distinkta toppar, en kort och en lång vars förekomst förändrats med 10 års ålder.

I den senaste undersökningen i vårt labb, använde vi självlysande avbildning att undersöka effekterna av manipulering av sekundära signalmolekyler inblandade i minnet, och hur de påverkar kalciumsvaret inom svamporgan 9. I själva verket, även om dumhuvud och kålrot identifierades mer än 30 år sedan och är kända för att reglera nivån av cAMP, deras effekter på cellulära och fysiologiska mekanismer och i synnerhet på Ca2 + respons in vivo fortfarande till stor del okända. Med GFP-aequorin strategi, har vi kunnat samtidigt spela in både blomfoder (den dendritiska structures) och cellkropparna, liksom de axonal prognoser på nivån på lober, och därmed gör det möjligt att korrelera nivån och den kinetiska av svaret på de olika avdelningarna i denna mycket komplexa struktur.

Den senaste ansökan utvecklar vi efterliknar en naturlig reaktion genom artificiellt aktiverar neuronpopulationer presynaptiska till strukturen av intresse. För att göra detta har vi uttrycka P2X 2 receptor, en ligand-gated katjon kanal, som reagerar för ATP, i presynaptiska nervcellen och uttrycka GFP-aequorin i den post-synaptiska neuronal population. Segregationen av dessa två element i olika neuronala populationer kräver två separata expressionssystem. För detta ändamål en LexA konstruktion innehållande GFP-aequorin har skapats. I våra preliminära experiment med detta system som vi har uttryckt P2X 2 i en delmängd av PNS med hjälp av Gal4-GH146 med UAS-P2X 2 och GFP-aequorin i svampkroppenmed hjälp av LexA MB247 linje i kombination med LexA-13X-GFP-aequorin. Vi har framgångsrikt inspelad kalciumsvar i svampkroppen med stimuleringar av 1 mM ATP till P2X 2 receptorn i PNS (figur 6).

Sammanfattningsvis har mareld GFP-aequorin strategi visat sig vara användbar för inspelning av stimulus inducerade Ca2 + -activity, analogt med andra Ca2 + -indicators. Men ännu viktigare, tillåter det också detektion av spontana Ca2 + -activity i hjärnan. Detta tillvägagångssätt öppnar framtida möjligheter för variga experiment lång och hela hjärnavbildning som kan öka djupet av vår förståelse av de fysiologiska fenomen och aktivitetsmönster i hjärnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S3014
CaCl2 Merck 1023911000
HEPES Sigma-Aldrich 7365-45-9
KCl prolabo 26 764.298 normapur
MgCl2 prolabo 25 108.295 normapur
sucrose Sigma-Aldrich S0389
Nicotine Sigma-Aldrich N3876
ATP Sigma-Aldrich A2383 Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate
benzyl-coelenterazine Prolume, nanolight  Cat #301 Coelenterazine h http://www.prolume.com/
dental glue 3M ESPE™ 46954 Protemp IV
silicon glue 3M ESPE™ 36958 Express 2 Regular Body Quick
tape 3M Scotch 122s 3M Scotch Magic Tape
pipette tips Corning Incorporated 4868 100-1,000 µl Univesal Pipette Tip
chamber and holder (stage) hand made
incubation box hand made
forceps (No. 5) Fine Science Tools 11252-00 Micro-dissecting forceps
curved forceps Sigma-Aldrich F4142 Micro-dissecting forceps
glue applicator  hand made 
knife Fine Science Tools 10316-14 5 mm Depth 15° stab
EM-CCD camera  Andor DU-897E-CS0-#BV iXon (cooled to -80 °C)
Microscope Nikon Eclipse-E800
immersion objective lens Nikon 20X Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence Leica MZ Fl III leica dissection scope and florescent lamp
tight dark box Science Wares Custom built by Science Wares
peristaltic pump  Gilson Minipuls 2
tubing Fisher Scientific depends on thickness Tygon R3603, St-Gobain
perfusion system Warner 64-0135  (VC-66CS) Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel
perfusion regulators Leventon 201108 Dosi-flow 3
measurement and automation explorer Sciences Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon imager  Science Wares & National Instruments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
photon viewer Science Wares & National Instuments N/A software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel Microsoft N/A software https://www.microsoft.com
virtual dub open access  N/A software http://virtualdub.sourceforge.net/
UAS-GA2 Martin et al., 2007, Ref. 1  N/A No stocks {currently} publicly available 
pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP   B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.  (STOCK #1117340) pfeifferb@janelia.hhmi.org
P2X2 Lima and Misenboeck, Ref. 11  N/A No stocks {currently} publicly available 
OK107 Bloomington stock center 854 http://flystocks.bio.indiana.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
  2. Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
  3. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
  4. Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
  5. Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
  6. Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
  7. Martin, J. -R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
  8. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
  9. Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
  10. Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
  11. Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
  12. Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  13. Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
  14. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
  15. Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
  16. Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
  17. Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).

Tags

Neuroscience Utgåva 107 Ca självlysande reporter GFP-Aequorin svamp kropp P2X Drosophila spontan aktivitet
<em>In Vivo</em> Functional Brain Imaging strategi som bygger på Bioluminescent Kalcium indikator GFP-aequorin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin,… More

Lark, A. R., Kitamoto, T., Martin, J. R. In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (107), e53705, doi:10.3791/53705 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter