直流电刺激与多电极阵列记录小鼠脑片中类癫痫样活动

摘要

研究表明，阴极经颅直流电刺激可对耐药性癫痫发作产生抑制作用。本研究设计了一种体外实验装置，用于评估小鼠脑片制备中癫痫样活动的直流电刺激与多电极阵列记录，并对直流电刺激参数进行了评价。

摘要

阴极经颅直流电刺激（tDCS）对耐药性癫痫发作具有抑制作用。为实现有效干预，需设定适当的刺激参数（例如，方向、电场强度和刺激持续时间）需要在小鼠脑片制备中进行检测。测试并调整电极相对于小鼠脑片位置的方向是可行的。本方法保留了丘脑-扣带回通路，以评估直流电刺激（DCS）对前扣带皮层类癫痫样活动的影响。多通道阵列记录结果显示，阴极直流电刺激显著降低了由4-氨基吡啶和荷包牡丹碱诱导的类癫痫样活动的诱发电反应幅度和持续时间。本研究还发现，在刺激15分钟后施加阴极直流电刺激可导致丘脑-扣带回通路产生长时程抑制。本研究探讨了直流电刺激对丘脑-扣带回突触可塑性及急性类癫痫样活动的影响。当前实验流程可用于测试包括方向、电场强度和刺激持续时间在内的最佳刺激参数 体外 小鼠模型。此外，该方法能够在细胞和网络水平上评估双环醇（DCS）对皮层类癫痫样活动的影响。

引言

癫痫是一种常见的神经系统疾病。30%的癫痫患者会出现耐药性发作。¹经颅直流电刺激（tDCS）提供了一种非侵入性方法，用于调控大范围脑区的网络活动，例如癫痫发作。临床研究显示，tDCS 可有效治疗难治性癫痫发作² 并且能够对癫痫发作产生短期和长期的抑制作用^3-5然而，tDCS作用的治疗机制仍不明确。所呈现的脑切片模型是一种 体外 研究tDCS治疗机制如何改变类癫痫脑活动症状的方法。因此，为了达到最佳治疗效果，需要在实验模型中测试特定的刺激参数，包括电场方向、场强和刺激持续时间。既往研究表明，电场方向对于获得治疗效果至关重要。⁶因此，测试并调整电极相对于被测脑片位置的方向是可行的。

额叶癫痫和前扣带皮层（ACC）发作常表现为药物难治性^7,8。一些研究已报道了经颅直流电刺激（tDCS）在扣带皮层中的应用^9-11。研究表明，tDCS 通过调节前扣带皮层的活动，可影响警觉性、决策能力和情绪，并能调节该脑区的神经元兴奋性和癫痫样放电活动¹²。因此，tDCS 对前扣带皮层发作的抑制作用可能有助于临床治疗及替代疗法的评估。

本实验方案描述了在记录室中为脑片的直流刺激（DCS）准备电极的方法，以及该方法对使用多电极阵列（MEA）记录类癫痫样活动的影响。

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方案

涉及动物受试者的实验程序已获得中国台湾台北市中央研究院动物实验管理与使用委员会的批准。

1. 多电极阵列记录实验溶液与设备的准备

1. 制备人工脑脊液（aCSF；124 mM NaCl、4.4 mM KCl、1 mM NaH₂PO₃、2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、25 mM NaHCO₃ 和 10 mM 葡萄糖），用 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体持续通气平衡。
2. 使用两种类型的多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEA 和 8 × 8 MEA。前一种探针覆盖包含皮层、纹状体和丘脑的区域，后一种探针仅覆盖皮层区域。
3. 使用具有 0.1 Hz 至 3 kHz 带通滤波器（增益设为 1,200 倍）的 60 通道放大器，以 10 kHz 的采样率采集数据。
4. 在 MEA 腔室内放置两根镀有 AgCl 的银丝用于直流刺激（DCS）。使用这些镀 AgCl 的银丝，通过隔离式刺激器产生电场。
5. 放置一根钨电极（直径 127 µm，长度 7.62 cm，8° 交流锥形尖端，阻抗 5 MΩ）用于丘脑刺激，并将参考电极置于 MEA 腔室内。通过由脉冲发生器控制的隔离式刺激器输送钨电极的刺激电流。

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结果

丘脑扣带回脑片制备及多电极阵列记录系统搭建

小鼠的MT-ACC脑片是一种特殊的脑片制备方法，可用于研究丘脑-扣带回通路的电生理特性。图1A展示了MT-ACC脑片的制备过程。迅速取出小鼠脑组织并置于冰冷的含氧人工脑脊液（aCSF）中（图1A, a, b）。为暴露皮层下结构，将每侧半球从正中线向外侧切割2.0 mm，以获取矢状位脑组织块（图1A, c, d）。在脑组织块上进行两次斜向腹侧切割，以保留丘脑-扣带回通路。第一次横切位于脑组织块前部，与纹状体中可见的纤维束平行；第二次横切从脑组织块后部开始，起始于小脑与视觉皮层之间的连接处，终止于前连合与视束中点之间。完成切割后，将脑组织块粘附于一个呈120°角的塑料切片板上，并在背侧直接穿过皮层进行一次切削（图1A, e-g）。随后将带有脑组织块的切片板固定于振动切片机中，并浸.......

讨论

在本研究中，测试了直流电刺激（DCS）的持续时间和方向对前扣带皮层（ACC）类似癫痫样活动的影响。为了在小鼠脑片中获得稳定的数据，保持内侧丘脑-前扣带皮层（MT-ACC）通路的完整性并避免其受损是关键，尤其是在进行两次倾斜的腹侧切割和一次皮层背侧切割的步骤中。此外，制备脑片所需的时间也可能影响脑片的活性，应尽可能缩短该时间以保持脑组织的新鲜和活力。先前的研究表明，目标组织可能发生电化学损伤 体内 制备¹⁵。一个 体外 脑切片制备可用于 避免此问题。在一种 体外 制备过程中，组织不直接接触电极，从而最大限度地减少电化学效应¹⁶将DCS的效果与不同方向放置的电极进行了比较。当电极方向分别为90°和270°时，DCS对诱发电活动无影响（图3因此，该对照实验排除了电化学反应对DCS产生副作用从而损伤组织的可能性。脑片的保护性复苏方法是另一个关键；本研究中的aCSF配方为保护性切片方法提供了一种替代方案，对保存4至8周龄动物脑片中的神经元具有高度有效性。该方法并不适用于所有年龄段的动物。 Tris.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>麻醉剂：
异氟烷	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>aCSF（总量：1 L）：
D(+)-葡萄糖	默克	1.08337.1000	10 mM
碳酸氢钠	MERCK	1.06329.0500	25 mM
氯化钠	MERCK	1.06404.1000	124 mM
(+)-L-抗坏血酸钠 >=98%	SIGMA	A4034-100G	0.15 g/2 c.c
硫酸镁，无水，ReagentPlus	SIGMA	M7506-500G	2 mM
二水合氯化钙	默克	1.02382.1000	2 mM
磷酸二氢钠一水合物	MERCK	1.06346.1000	1 mM
氯化钾	五月 & Baker LTD，达格南，英格兰	MS 7616	4.4 mM
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>药物：
(+)-荷包牡丹碱	TOCRIS	0130	5 µM 在 aCSF 中
4-氨基吡啶	TOCRIS	0940	250 µM 在 aCSF 中
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>脑切片制备：
振动切片机	振动切片机	系列 1000	将组织块切成500微米厚片 µm 厚切片
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>MEA系统：
多电极阵列（MEA）探针：6 × 10 平面 MEA	Multi Channel Systems	60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6×10	电极直径，30 µ米；电极间距，500 µ米；阻抗，50 千欧Ω 在 200 Hz 时
多电极阵列（MEA）探针：8 × 8 MEA	Ayanda Biosystems	60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8	锥形电极；直径，40 µ米；针尖高度，50 µ米；电极间距，200 µ米；阻抗，1,000 千欧姆Ω 在 200 Hz 时
使用60通道放大器，带通滤波器设置为0.1 Hz至3 kHz，放大倍数为1,200倍。	多通道系统	MEA-1060-BC
MC Rack 软件以 10 KHz 采样率	多通道系统		用于数据采集和记录的软件
脉冲发生器的控制	多通道系统	STG 1002
切片固定套件和压紧装置	华纳仪器	SHD-26H/10；WI64-0250
蠕动泵-minipuls3	Gilsom	MINIPULS3	灌注速率：8 ml/min
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>刺激系统：
独立刺激器	A-M Systems	Model 2100	强度 ±350 μA，持续时间为200 μ秒
钨电极	A-M Systems	575300	置于丘脑