Aquí reportamos protocolos para detectar proteínas endógenas y exógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas y cuantificar estos niveles de proteínas en centrómeros-cinetocoros mediante tinción inmunofluorescente indirecta mediante el uso de fijación (fijación de paraformaldehído, acetona o metanol).
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Artículo de método
Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro
En este artículo
Resumen
Resumen
"Centrómeros" y "cinetocoros" se refieren al sitio donde los cromosomas se asocian con el huso durante la división celular. La visualización directa de las proteínas centrómero-cinetocoro durante el ciclo celular sigue siendo una herramienta fundamental en la investigación de los mecanismos de estas proteínas. Los métodos avanzados de obtención de imágenes en microscopía de fluorescencia proporcionan una resolución notable de los componentes del centrómero-cinetocoro y permiten la observación directa de componentes moleculares específicos de los centrómeros y cinetocoros. Además, los métodos de tinción inmunofluorescente indirecta (IIF) con anticuerpos específicos son cruciales para estas observaciones. Sin embargo, a pesar de los numerosos informes sobre los protocolos IIF, pocos discutieron en detalle los problemas de las proteínas específicas del centrómero-cinetocoro. 1-4 Aquí reportamos protocolos optimizados para teñir proteínas endógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas mediante el uso de fijación de paraformaldehído y tinción de IIF. Además, reportamos protocolos para la detección de proteínas CENP-A exógenas marcadas con Flag en células humanas sometidas a fijación de acetona o metanol. Estos métodos son útiles para detectar y cuantificar proteínas endógenas centrómero-cinetocoro y proteínas CENP-A marcadas con Flag, incluidas las de las células humanas.
Introducción
"Los centrómeros" se define clásicamente como regiones de recombinación meiótica suprimida en genética y más tarde reconocidos como la constricción principal de cromosomas mitóticos, que desempeña un papel esencial en la segregación cromosómica precisa durante la mitosis. "Kinetochores" se describieron como las estructuras de capas múltiples que se unen a los microtúbulos en la superficie de centrómeros, como se revela por microscopía electrónica; "cinetocoros" se definen como más tarde el complejo macromolecular que se localiza en el centrómero de los cromosomas mitóticos. A pesar de una divergencia dramática de secuencias de ADN centroméricas entre los vertebrados,....
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Protocolo
1. Cultivo de células y transfección
- Ponga una tapa de vidrio (22 mm x 22 mm) en una placa de poliestireno de 6 pocillos. escudo opcionalmente una cubierta de vidrio con poli-L-lisina, 0,1% w / v, en agua (ver Lista de Materiales / Equipo) para mantener las células mitóticas en la cubierta de vidrio siguiendo los siguientes pasos:
Nota: Las condiciones óptimas deben determinarse para cada línea celular y aplicación.- superficie de cultivo capa asépticamente con poli-L-lisina, 0,1% w / v, en agua (0,4 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos de poliestireno). Agite suavemente para asegurar un recubrimiento de la superficie de cultivo.
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Resultados
El análisis de inmunofluorescencia de endógena CENP-A es compatible con la hipótesis de que se requiere Cul4A-E3 ligasa para la localización de CENP-A a centrómeros
Nuestros estudios recientes demostraron que se requiere la actividad ligasa Cul4A-RBX1-COPS8 E3 para la ubiquitinación de la lisina 124 (K124) en el CENP-A y localización de CENP-A a los centrómeros. 17 Inicialmente, el complejo de interfase-centrómero (ICEN) fue aislado por anti-CENP-a: inm.......
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Discusión
En los últimos años muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos de microscopía cuantitativa de células fijadas. 42 El progreso en la biología centrómero-kinetochore a menudo requiere una comprensión de la función específica del centrómero o-kinetochore específico de proteínas de las cuales subcelular regulación espacial-temporal refleja las cambiantes funciones de estas proteínas durante el ciclo celular. Por lo tanto, aquí hemos desarrollado métodos de tinción de IIF y un ensayo cuantitativo IIF para.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH GM68418 subvención.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | reactivo de transfección I |
| Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | reactivo de transfección II |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Medios de suero reducidos, calientes en 37 grados; C baño de agua antes |
| de usar DMEM con alto contenido de glucosa (Dulbecco' Águila modificada' s medio) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | DMEM de alta glucosa, caliente en 37 ° C baño de agua antes de usar |
| Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, origen de EE. UU. | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (suero fetal bovino) |
| Poly-L-Lisina SOLUCIÓN | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lisina, 0,1% p/v, en agua |
| Agua destilada ultrapura | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Agua estéril de grado de cultivo de tejidos |
| Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cubertor de vidrio (22 mm x 22 mm) |
| Clúster de cultivo celular de 6 pocillos | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | placa de poliestireno de 6 pocillos |
| Penicilina, Estreptomicina; Líquido | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicilina-estreptomicina |
| PAP PEN | Sitio de unión | AD100.1 | Pluma de barrera hidrofóbica (para una barrera repelente al agua en la tinción inmunofluorescente) |
| Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol para el análisis de células mitóticas |
| TN-16, inhibidor de microtúbulos (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 para el análisis de células mitóticas |
| BSA (albúmina sérica bovina) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Reactivo bloqueante |
| Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergente para permeabilización |
| Paraformaldehído | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fijador |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | Para tinción nuclear |
| p-fenilendiamina | SIGMA-SLDRICH | P6001 | Para medio de montaje |
| VWR Micro Slides, esmerilados | VWR International | 48312-013 | Micro portaobjetos |
| Anticuerpo anti-CENP-A | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anticuerpo anti-CENP-B | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:200 (IIF, fijación de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fijación de paraformaldehído)Anticuerpo |
| anti-CENP-B | abcam | ab25734 | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:200 (IIF, fijación de metanol/acetona)-1:400 (IIF, fijación de paraformaldehído) |
| Anticuerpo anticentrómero (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Antisuero de centrómero humano; relación de dilución de 1:2000 (IIF) |
| Anticuerpo anti-CENP-H | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:200 (IIF) |
| Anticuerpo anti-CENP-H | BD | 612142 | Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:200 (IIF) |
| Anticuerpo anti-CENP-I | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
| Anticuerpo anti-KNL1 | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF) |
| Anticuerpo anti-Hec1 | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:100 (IIF) |
| Anticuerpo anti-Hec1 | GeneTex | GTX110735 | anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF) |
| Anticuerpo anti-Ska1 | abcam | ab46826 | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:100 (IIF) |
| Anticuerpo anti-Flag | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anticuerpo anti-Flag | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
| Anti-CUL4A anticuerpo | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
| Anticuerpo anti-RBX1 | Cell Signaling | 4397 | Anticuerpo policlonal de conejo; relación de dilución de 1:2000 (WB) |
| Anticuerpo anti-GAPDH | Chemicon | MAB374 | Anticuerpo monoclonal de ratón; relación de dilución de 1:5000 (WB) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad) |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad) |
| Leche en polvo descremada (sustituto aprobado de la leche en polvo de clavel) | Fisher Scientific NC9255871 | (Reorden n.º 190915; Lote # 90629) | |
| Microscopio de fluorescencia motorizado Leica DM IRE2 de leche descremada | Microscopio de fluorescencia motorizado | Leica | |
| Lente de inmersión en aceite HCX PL APO 63x | Leica LEICA | HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X lente de inmersión |
| aceite HCX PL APO 100x Lente de inmersión en aceite | Leica LEICA | HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X Lente de inmersión en aceite |
| Leica EL6000 Fuente de luz compacta | Leica | Fuente de luz compacta externa para excitación fluorescente | |
| ORCA-R2 Cámara CCD digital | Hamamatsu | C10600-10B | |
| Openlab versión 5.5.2 Software de imágenes científicas | Perkin Elmer/Improvision | Para la observación, adquisición, cuantificación y análisis de imágenes | |
| Velocity versión 6.1.1 Software de análisis de imágenes 3D | Perkin Elmer/Improvision | Para la observación, adquisición, cuantificación y análisis | |
| de imágenes Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA | Roche | 11873580001/11836170001 | Comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasa |
| PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Reactivo de ensayo de proteínas comercial I para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS |
| al 2%)Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Reactivo de ensayo de proteínas comercial II para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS al 0,1%) |
| Immobilon-FL | EMD Millipore IPFL00010 | membrana de PVDF para la transferencia | |
| IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF) |
| IRDye 680 IgG anti-conejo de cabra Li-Cor | Biosciences | 926-32221 | Anticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF) |
| DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF) |
| Anticuerpo secundario conjugado con DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:20000 (IIF) |
| Anticuerpo | Cruz | SC-2005 | anticuerpo secundario conjugado con HRPanticuerpo secundario conjugado con dyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (secundario purificado por afinidad anticuerpo); relación de dilución de 1:10000 (IIF) |
| IgG-HRP anti-conejo | de cabra Santa Cruz | SC-2004 | Anticuerpo secundario conjugado con HRPanticuerpo secundario conjugado con dyLightAnticuerpo secundario conjugado con colorante fluorescente IR (anticuerpo secundario purificado por afinidad); relación de dilución de 1:10000 (IIF) |
| Openlab versión 5.5.2. Software de Imágenes Científicas | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
| Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
| Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Cuantificación de volocity) | PerkinElmer | Software B2 | |
| Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
| Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Sólido, Rosca de 9,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Bocina disruptora para sonicación |
| Branson Ultrasonics sonicador Microtip Tapered 6,5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip para sonicación |
| Odyssey CLx Sistema de imágenes infrarrojas | LI-COR Biosciences Sistema de | imágenes infrarrojas para la detección de | |
| Software de análisis de estudio de imágenes Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
| Sistema Versadoc MP4000 | Generador de imágenes de quimioluminiscencia | Bio-Rad | |
| Cantidad Un software de análisis 1-D | Bio-Rad | Software D | |
| SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad | Thermo | 34095 | Sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) ultrasensible |
Referencias
- DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
- Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N.
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Reimpresiones y permisos
