여기에서는 외성장 배양 분석으로 일차 마우스 심외막 세포를 분리하고 생체 외 심장 배양 시스템을 사용하여 표피 유래 세포(EPDC)의 기능적 이동을 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 EMT(epicardial epithelial-to-mesenchymal transition) 및 운동성의 유전적 및 화학적 조절자를 식별하는 데 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
심 외막 세포 선 단층 심장, 심근 세포의 증식을 자극 분비 인자를 제공하고 직접 개발 및 심혈관 질환 중에 조상 기여. 다수의 인자가 심장 외막 유래 세포 (EPDC) 동원에 연루되어 있지만, 그 이후의 이동과 분화를 지배하는 메커니즘이 제대로 이해된다. 여기, 우리는 EPDC 운동성 및 분화를 연구하는 생체 외 및 생체 전략을 제시한다. 먼저, 마우스 배아 심장에서 생장 배양 주 외막 세포를 얻는 방법을 설명한다. 또한 장기 배양 시스템에서 표지 EPDC 입체 마이그레이션을 평가하기 상세한 프로토콜을 소개한다. 우리는 심장 외막에 myocardin 관련 전사 인자의 유전 삭제 EPDC 마이그레이션을 감쇠 이러한 기술을 사용하여 증거를 제공합니다. 이 방법은 EPDC의 후보 수식을 평가하기위한 플랫폼 역할생물학은 심장 수리를 위해 유용 할 수 있습니다 EPDC 동원의 새로운 규제를 식별하는 유전 물질 또는 화학 물질 화면을 개발하는 데 사용할 수 있습니다.
서론
심장 외막은 중피 세포의 단일 층입니다 라인 심장과 영향 심장 개발, 성숙 및 수리. 분비 신호 높은 코디 교환을 통해, 심근과 외막 사이에 친밀한 대화 심장 성장 및 비 - 심장 근세포 계통 (1)의 형성에 필수적이다. 심 외막 유래 세포 (EPDC)의 상피 - 투 - 중간 엽 전이 (EMT) (2)를 통해 심 외막 세포의 일부에서 등장는 subepicardial 공간 및 기본 심근 침입, 크게 관상 동맥 혈관 벽화 세포와 심장 섬유 아 세포로 분화하고,에 조금 적게, 내피 세포 및 심근 3-9.
심 외막 EMT 및 EPDC 침입 조절 메커니즘 분비 리간드 10-13, 세포 표면 수용체 및 부착 분자 (14, 15), 가열 공기 조절기 등 다양한 분자의 조정 동작에 기인 한혀끝 - 기초 극성 16, 17, 작은 GTP 아제 18, 19, 및 전사의 lators은 2,20,21 요인. EPDC 이주의 분자 이펙터 많은 정의되었지만, 전략의 개발을 촉진 할 수있다 배아 EPDC 가동화를 자극하는 생리적 신호의 더 나은 이해를 개선 심장 수리 어른이 공정을 조작한다.
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프로토콜
참고 : 마우스 모든 실험은 로체스터 대학 동물 자원에 대학위원회에 의해 승인되었다.
1 심 외막 파생물 문화 분석 (그림 1A)
- 준비
- 5 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성) 중간 (199) (M199)를 보충하여 주 외막 세포 격리 5 ml의 배지 A를 준비한다.
- 매체 사전 따뜻한 100ml를 37 ° C의 물을 욕조에 행크스 '균형 소금 솔루션 (HBSS).
- 콜라겐 - 코팅 된 챔버 슬라이드를 30 분 동안 실온으로 가온하도록 허용.
- 챔버 슬라이드의 각 웰에 100 ㎕의 매체 A를 추가하고 부드럽게 고르게 코트 콜라겐 표면에 회전합니다. 8-12 우물을 반복합니다. 코팅 챔버 후 용지를 제거합니다.
- 분취 액을 50 ㎖의 HBSS를 각각 함유하는 두 개의 10cm 2 플레이트로 HBSS를 예열.
- 11.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 댐에서 배아 마음을 격리 할 것.(30)
- 복강 내 주사를 통해 13 ㎎ / ㎖ 케타민 / 0.88 밀리그램 / 1 배 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 ㎖의 자일 라진 칵테일의 ....
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결과
심장 외막이 효율적으로 외부 위치를 활용하고 개발 소성 및 EPDC의 고유 철새 동작을 이용하여 부산물 문화 분석을 이용하여 분리 할 수 있습니다. 쥐의 배아 마음 전에 아래 콜라겐 코팅 챔버 슬라이드에 심 외막 EMT 배양 등의 측에 E11.5에서 분리되어 26 (그림 1A, B). 외식 마음은 계약을 계속; 그러나, 심장 외막은 콜라겐 매트릭스 준수와 문화의 24 시간 (그림 1C)에서 심근으로부터 마이그레이션합니다. 심 외막 세포 중피 정체성 (도 1C-E)를 나타내는 조약돌 같은 형태로 떨어져 마음에서 나오는 관찰 할 수있다. 문화의 24 시간 후 심장 외막 고갈 마음은 유전자 또는 단백질 발현 분석을 위해 제거됩니다.
epitheli 관찰.......
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토론
여기에서 우리는 가지가 기본 심 외막 세포를 분리하고 생체 심장 문화 EPDC 이동을 추적하는 자세한 방법을 설명합니다. 가지 문화를 들면, 심장 외막 고갈 마음을 제거 할 수있는 적절한 시간 실험 사이에 약간 다릅니다. 하룻밤 배양 후 외식의주기적인 모니터링이 심 외막 가지의 정도를 측정하고 섬유 아세포를 표시하기 전에 마음을 추출하는 것이 좋습니다. 순도를 보장하기 위해, 마음이 아닌 심 외막 계통의 축적을 방지하기 위해 explanting의 24 시간 내에 제거해야합니다. 유출 기관도 오염 세포 유형 27,40을 줄일 수있는 챔버 슬라이드에 마음을 전송하기 전에 두 심방을 멀리 트리밍. 태아 하트는 시간의 좁은 기간 동안 마우스 쓰레기 분리와 같은 조건에서 배양되므로 표시하기위한 시간의 outgrowths 한 심장에서 실험 내에서 서로 상대적으로 유사하다. 따라서 모든 마음 ㄴ한다이식편의 대부분은 심 외막의 outgrowths을 나타낼 때, 예를 제거. 어떤 경우에는, 세포 외막이 이식.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
EMS는 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다 [부여 번호 R01HL120919] 미국 심장 협회 [허가 번호 10SDG4350046] 국립 보건원 [허가 번호 UL1 TR000042]에서 로체스터 CTSA 수상의 대학; 그리고 AAB CVRI에서 시작 기금. MAT는 하워드 휴즈 의학 연구소 메드 - 속 - 대학원 이니셔티브에서 의학 및 치과 로체스터 대학의 대학에 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다; 그리고 NIH [허가 번호 GM068411]에서 기관 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상.
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재료
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| 행크스 밸런스드 솔트 솔루션 | 하이클론 | SH3003102 | HBSS |
| 미디엄 199 | 하이클론 | SH3025301 | M199 |
| 둘베코' s 인산염 완충 식염수 | Hyclone | SH3002802 DPBS | |
| 소태아 세럼 | 쌍둥이자리 | 100-106 | FBS |
| 페니실린/스트렙토마이신 솔루션 | 하이클론 | SV30010 | |
| 코닝 바이오코트 콜라겐 I, 4웰 배양 슬라이드 | 코닝 | 354557 | |
| 멀티웰 24웰 플레이트 | Falcon | 08-772-1 | |
| 해부 현미경 | Leica | M50 | Leica KL300 LED 장착 |
| 소스 컨포칼 현미경 | Olympus | 1X81 | muli-argon 레이저 405/488/515, FV10-MCPSU 레이저 405/440/635, 559 레이저, 그리고 수은 램프가 장착되어 |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| 변형성장 인자 베타 1 | R& D 시스템 | 100-B-001 | TGF-&베타; 1 |
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| Trizol 시약 | 적용 Biosystems | 15596-026 | 주의, 위험 물질 |
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| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
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| 일회용 기본 금형 | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| 케타민 | 호스피라 | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
참고문헌
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is require....
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