Introduction
Glomerulære filtrationshastighed (GFR) er det bedste parameter til at vurdere den samlede nyrefunktion. Den gyldne standard til at bestemme GFR afhængig urin eller plasma clearance af eksogene renale markører, såsom inulin 1. Men disse procedurer er tidkrævende og kompliceret og kræver indsamling af serielle blod og / eller urinprøver og posteriore laboratorieassays for analysen. Desuden er disse metoder invasive og belastende for dyrene, begrænsning af antallet af klokkeslæt og frekvens, hvor målingerne kan gentages. En række alternative metoder er blevet udviklet til at forenkle de klassiske procedurer til at afgøre GFR, men de er stadig afhængige af urin og plasma prøveudtagning 2-4 og / eller kræver dyb anæstesi 5,6, som er kendt for at påvirke renal hæmodynamik og funktion 7, 8. Slutprodukterne metabolisme, såsom creatinin, er også udbredt anvendt til at estimere nyrefunktion. Det er imidlertid kendt, at accurACY af disse endogene markører ikke er optimal, og desuden at analysere dem, urin eller blodprøver er også uundværlig.
Her beskriver vi en transkutan metode til at vurdere nyrefunktionen i bevidste dyr. Denne fremgangsmåde er enklere og hurtigere end traditionelle metoder samt kun minimalt invasiv. Med denne teknik, ved anvendelse af en miniaturiseret optisk anordning og det exogene nyremarkør fluoresceinisothiocyanat (FITC) -sinistrin, er det muligt at bestemme nyrefunktion næsten i realtid uden behov for plasma eller urin prøveudtagning og uden kirurgisk kateterisation for stof administration. På grund af disse egenskaber, er fremgangsmåden egnet til at udføre sekventielle målinger på det samme dyr.
FITC-sinistrin er nyremarkør filtreres frit af glomerulus, uden tubulær reabsorption eller sekretion. Den optiske del af miniaturiserede anordning består af to lysemitterende dioder (LED), der excitererden administrerede markør og en fotodiode til at detektere fluorescens udsendt gennem huden. De registrerede data gemmes i den interne hukommelse integreret i enheden, og de kan anvendes til at generere den FITC-sinistrin eliminationskinetik kurve. Strømforsyning varetages af en lille genopladeligt lithium batteri. For mere detaljerede oplysninger om enheden og dens enkelte komponenter henvises til Schreiber et al. 9. Anordningen monteres let på dyrekroppen ved anvendelse af en dobbeltsidet klæbende plaster bærer et transparent vindue for de optiske komponenter. Resultaterne er let tilgængelige efter optagelsen er overstået.
Med fremgangsmåden og protokollen tilvejebragt her, vi indfører en lovende teknologi, som kan erstatte den nuværende guldstandarden at bestemme GFR, ikke blot i forskning, men også i det kliniske område.
Protocol
Nødvendige eksperimenter for at udvikle protokollen blev udført i overensstemmelse med nationale regler og blev godkendt af den lokale etiske videnskab udvalg (Regierungspräsidium Karlsruhe).
1. Fremstilling af FITC-sinistrin injektionsopløsning
- Opløs FITC-sinistrin i fysiologisk saltvand for at fremstille en stamopløsning. Den anbefalede dosis hos mus er 7,5 mg / 100 g legemsvægt (BW), mens i rotter 5 mg / 100 g BW FITC-sinistrin foretrækkes. For mus, fremstille en opløsning af FITC-sinistrin stamopløsning med 15 mg / ml, mens den for rotter forberede ved en koncentration på 40 mg / ml.
Bemærk: FITC-sinistrin stamopløsning kan fremstilles i forvejen og opbevares ved -20 ° C beskyttet mod lys.
2. Animal Forberedelse
- Akklimatisere dyr i mindst en uge før deres indførelse i enhver eksperiment.
- Bedøver dyret anvendelse af 5% isofluran ved 5 l / min O 2
- Bekræft, at dyret er korrekt bedøvet ved at observere sin vejrtrækning, som bliver langsommere og dybere, og kontrollere manglende respons med en mangel på en tå respons.
- Når dyret sover, reducere anæstesi til 2,5% isofluran ved 2 l / min O 2 afgivelseshastighed og tage BW.
- Fjern skind fra flanken af ryggen af dyret ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Barber et område lidt større end det område, der vil blive besat af dobbelt-klæbende plaster, som har dimensioner på 3 cm x 6 cm.
- Efterfølgende anvende hårfjerning creme i en kort periode (2-3 min) for at fjerne det resterende pels.
- Vask grundigt området indtil cremen er blevet fuldstændigt fjernet, da cremen selv kan være fluorescerende.
Bemærk: Undgå at ridse huden på dyret, da det kan give irritation / ødem. Hvis afhåret område viser pigmentering på huden, barbere et større område, indtil en ikke-pigmenteret plet foroptiske del af indretningen er fundet. Det anbefales at barbere 24 timer i forvejen for at minimere anæstesi eksponering.
3. Enhed Forberedelse
- Placer den optiske anordning til måling af nyrefunktionen på én side af den dobbeltsidede klæbende plaster, positionering af optiske del over det gennemsigtige vindue (figur 1), der forlader den modsatte del med den beskyttende folie.
Bemærk: Ved arbejde med små gnavere, reducere størrelsen af plasteret, som vist på figur 2. - Vedhæfte et stykke dobbeltsidet klæbende plaster på matching størrelse til batteriet som vist i figur 3.
4. Fiksering af Enheden, Animal
- Beregn det passende volumen af injektion baseret på dyrets legemsvægt.
- Bedøver dyret med isofluran som tidligere angivet på §§ 2.1-2.3.
- Klip et stykke rørformet elastisk gazebind of ca 1 cm længere end bredden af den dobbeltsidet klæbende plaster, der skal anvendes.
- Træk den elastiske gazebind over hovedet på dyret og sted på ryggen, forlader barberet område afdækket.
Bemærk: Du kan også fastsætte enheden ved hjælp af kun tape, men vær opmærksom på unødigt pres på enheden. - Tilslut batteriet til enheden ved at tilslutte batteriet stik til den tilsvarende port på enheden. Efter at fjerne den beskyttende folie fra stykket af plasteret og montere batteriet på den øvre overflade af indretningen (figur 4A). Sørg for, at batteriet er sat rigtigt ved at kontrollere, at enheden begynder at blinke.
Bemærk: I rotter, kan batteriet også fastgøres direkte på den klæbende plaster, ved siden af enheden (figur 4B). - Fjern beskyttelsesdækslet fra plastret med betjeningsanordningen og lægges på det barberede område på bagsiden af dyret holde dens kanter, indtil det er korrekt fast.
- Dæk enhed med den rørformede elastiske gazebind klæbe det til den klæbende overflade af plasteret (figur 5).
- Korrekt strække den rørformede bandage på maven af dyret, der sikrer, at benene kan bevæge sig frit.
- For en bedre fiksering og beskyttelse af indretningen, anvende en strimmel af tape efter formen af indretningen, og som dækker trådene i batteriet.
- Mål baggrunden for 1 til 3 min, uden at lægge pres på enheden
5. FITC-sinistrin Administration og måleprocedure
- Om nødvendigt varme op halen af dyret ved hjælp af varmt vand før injektion eller en temperaturstyret varmeplade langs hele proceduren.
- Sprøjt gennem halevenen det passende volumen af FITC-sinistrin stamopløsning. Mængden af injektion afhænger dyr BW, og derfor skal beregnes for hver enkelt considering den ønskede dosis og koncentration af stamopløsningen, nævnte i afsnit 1.1.
- Sikre, at alle FITC-sinistrin opløsning indgives intravenøst og ikke subkutant.
Bemærkning: Alternativt kan FITC-sinistrin indgives ved anvendelse af en præ-implanterede intravenøst kateter kom ud ved nakken af halsen i gnavere eller via retro orbital injektion i mus. - Forsigtigt, dyret vender tilbage til sit hjem bur undgå kraftige bevægelser og noget pres på enheden, da det ville medføre bevægelse artefakter.
- Placer hjem bur i et roligt sted for at undgå, at dyret forstyrres.
- Udfør målingen i mindst 1 time, hvis arbejde med mus og 2 timer ved brug af rotter. I denne periode vil den optiske enhed måle gennem huden fluorescens udsendes af FITC-sinistrin.
Bemærk: Under optagelsen periode dyret skal være vært alene. Endvidere vandforsyning samt udragendestrukturer såsom wire låg, skal fjernes for at undgå beskadigelse af de elektroniske artefakter enheds- og bevægelse på grund af sammenstød med objekter.
Fjernelse 6. Enhed
- Når optagelsen er overstået, fjerne enheden uden bedøvelse; men hvis nødvendigt, bedøver dyret kortvarigt under 5% isofluran ved 5 L / min O 2 leveringshastighed i løbet 2 min.
- Omhyggeligt, pull off klæbebåndet først, derefter den rørformede bandage.
- frigøre forsigtigt dobbeltsidet klæbende plaster fra huden og sende dyret tilbage til sin normale hjem bur.
7. Læs ud af data
- Afbryd batteriet fra enheden, og fjern den selvklæbende plaster.
Bemærk: Dataene er gemt på enheden, indtil en ny måling starter. Når et batteri er tilsluttet de lagrede data overskrives med de nye optagelser. Derfor skal du ikke tilslutte batteriet, inden du henter data fraenhed. Der er en 10 sek afdragsfri periode beregnet til utilsigtet reconnections på batteriet. - Slut enheden til en pc ved hjælp af en mikro-USB-kabel og hente data ved hjælp af den medfølgende software. Udgangen filen er en .csv-fil, der kan åbnes og ændres med et regnearksprogram.
- Åbn datafilen med den specifikke software til optisk enhed og generere elimineringskinetik kurve ved hjælp af softwarens protokoller.
- Analyser kurven ved at følge de anvisninger, der med den optiske enhed. Kort, til evaluering af de data, indstille baggrunden signal måles før FITC-sinistrin administration og markere begyndelsen på den eksponentielle udskillelsesfase af markøren, hvilket normalt sker 15 min og 45 min efter bolusinjektion, i mus og rotter henholdsvis .
Bemærk: Softwaren vil automatisk vise FITC-sinistrin halveringstid (t 1/2) sammen med en R2-værdi, bestemt af en 1-Compartment model. t 1/2 kan anvendes til at beregne GFR ved at anvende en omregningsfaktor 9,10.
Representative Results
Opsætningen af transkutan måling er meget enkel og hurtigt: indretningen anbringes på dobbeltsidet klæbende plaster (figur 1) og justeres i størrelse efter behov (figur 2), batteriet fremstilles (figur 3) og er forbundet (figur 4).
Denne metode til at vurdere nyrefunktionen er allerede valideret i forskellige arter i forhold til den traditionelle tilgang af plasma clearance 9,11,12. Ifølge protokollen eksponeret her, Schreiber et al. demonstreret gyldigheden af teknikken i forskellige musemodeller, viser meget sammenlignelige resultater blandt den transkutane måling og plasmaclearance for alle de undersøgte grupper (tabel 1) 9. I dette arbejde den opnåede t 1/2 blev omdannet til GFR bruge en mus specifik semi-empiriske konverteringfaktor.
Konsistensen af transkutan vurdering af nyrefunktionen er også vist ved hjælp af forskellige stammer af mus. Sekventielle målinger inden 3 dage i det samme dyr viste en koefficient på variansen på 3,0-6,2% 13. I denne undersøgelse var der ingen konvertering til GFR men resultaterne blev udtrykt og fortolkes direkte i form af t 1/2.
Muligheden for at have resultaterne næsten i realtid er en af de store fordele ved denne metode. Efter optagelsen periode, er resultaterne umiddelbart tilgængelige for analyse og den medfølgende software viser udskillelse kurve FITC-sinistrin øjeblikkeligt (figur 6). Inden for samme software kan fås t 1/2 af FITC-sinistrin, som direkte kan anvendes som parameter til evaluering af nyrefunktionen konverteres i form af GFR. Figur 7 1/2 øges som følge af den reducerede udskillelse af stoffet og udseendet af kurven ændringer. Typisk betyder den målte kurve ikke vende tilbage til baggrundsniveau og præsenterer et forøget areal under kurven. I det samme dyr, kan målinger fra før til efter skade opleve en stigning i den maksimale fluorescensintensitet på grund af ophobning af markøren forårsaget af dets reducerede udskillelse. I tilstedeværelse af nyresvigt, kan den transcutant målte kurve af FITC-sinistrin vise en stabil tilstand på grund af svært nedsat funktion (Figur 7B).
Anvendelsen af miniaturiseret anordning i flere stammer af gnavere med forskellig sundhedsstatus har vist, at denne teknik er egnet og følsomme nok til at detektere ændringer due til nyresygdom og aldring. Tabel 2 viser en oversigt over de murine modeller undersøgt til dato med denne metode.
Figur 1. Placering af anordningen på dobbeltsidet klæbende plaster. Anordningen er monteret på klæbemiddellap positionering dens optiske del i det gennemsigtige vindue.
Figur 2. Tilpasning klæbemiddellappen for små gnavere. Til brug i små dyr anbefales det at reducere størrelsen af plasteret. A: Brug enheden som en guide til at skære plasteret korrekt. B: Når først den ønskede størrelse er opnået, anordningen kan placeres på den klæbende overflade af plasteret. Please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Forberedelse af batteriet. For at fastgøre batteriet til enheden, skære et lille stykke af dobbeltsidet klæbende plaster (A og B) og placere den på overfladen af batteriet (C). Klik her for et større version af denne figur.
Figur 4. Tilslutning og placering af batteriet under målingen. (A) I små gnavere, såsom mus, på grund af den reducerede plads, skal batteriet placeres på toppen af enheden. (B) I større dyr batteriet cen skal placeres ved siden af enheden. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Placering af rørformede elastiske gazebind i en rotte. Den rørformede bandage bør omfatte dobbeltsidet klæbende plaster uden at forstyrre den frie bevægelighed af lemmerne for komfort af dyret. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Repræsentative billede af en eliminering kurve af FITC-sinistrin. Signalet genereres af FITC-sinistrin detekteres transkulturelttidigt og lagres i den interne hukommelse på enheden. Når de registrerede data hentes på en pc, softwaren genererer en kurve sammenlignes med den fremlagt i billedet. Y-aksen viser den indspillede fluorescensintensitet [AU], der udsendes af den injicerede FITC-sinistrin markør, mens X-aksen repræsenterer varigheden af målingen i [min]. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Repræsentative billede af en eliminering kurve af FITC-sinistrin hos dyr med nedsat nyrefunktion. (A) FITC-sinistrin elimination kurve i dyr med nedsat nyrefunktion viser typisk et øget areal under kurven og manglende evne til at nå grundlinjen i normal måleperioden . (B) I svært nedsat dyr transcutant målte kurve kan vise en stabil tilstand, der indikerer nyresvigt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Validering af transkutan måling ved at sammenligne med den traditionelle plasmaclearance. Transkutan måling af nyrefunktionen er blevet valideret i forskellige musemodeller (sund og ensidigt nefrectomiserede (Unx) C57BL / 6-129 SV mus og musemodel af nephronophthisis ( pcy)) ved sammenligning med plasmaclearance. Værdier er middelværdier ± SD. GFR, glomerulære filtrationshastighed 9.
/53767/53767table2.jpg "/>
Tabel 2. Murine modeller undersøgt ved hjælp af transkutan måling Unx, ensidigt nefrectomiserede.; ACE, angiotensin-konverterende enzym; T gumodwt / vægt, transgene uromodulin knockout, SD, Sprague Dawley rotte; PKD, polycystisk nyresygdom.
Discussion
Nærværende dokument beskriver proceduren til at bestemme nyrefunktion i bevidste gnavere ved hjælp af en miniaturiseret anordning og den eksogene nyremarkør FITC-sinistrin. Som før nævnt er denne metode har flere fordele i sammenligning med de traditionelle procedurer urin og plasma clearance. En af dem er uafhængighed af blod og urin prøveudtagning, som fører til store besparelser med hensyn til hjælpematerialer, tid og selvfølgelig dyr stress.
Som vist i tabel 2, det exogene nyremarkør FITC-sinistrin og målingen af dets eliminationskinetikken gennem huden tillader virkningerne af renale patologier på nyrefunktionen skal undersøges 9,10,14-18. Den serielle indsamling af blodprøver, der kræves for at vurdere plasma clearance eller biomarkører for nyresygdom er stressende for dyret, besværlige og tidskrævende for forskerne. Derfor har sekventielle målinger i den samme dyr været limgrænset af dyrenes velfærd og metodologiske grunde. Det viste sig i dyr reproducerbarhed transkutan måling 13 gør det en ideel metode til påvisning af ændringer i nyrefunktionen på grund af sygdomsprogression eller aldring. Af samme grund kan det også være yderst nyttigt at undersøge effektiviteten af terapeutiske fremgangsmåder.
To kritiske trin til en vellykket anvendelse af denne teknologi er fiksering af den optiske enhed på dyret og den korrekte administration af markøren. Enheden skal være passende fast for at undgå bevægelse artefakter. Med henblik herpå er afgørende forhindring af vedhæftning og løsning af dobbeltsidet klæbende plaster, da det kan føre til tab af dets klæbende egenskaber og i sidste ende en uhensigtsmæssig fiksering på dyret. Som nævnt i protokollen, immobilisering og beskyttelse af den optiske enhed ved at dække den med tape er en effektiv metode til at sikre en adequate fiksering. Ved udførelse af FITC-sinistrin bolusinjektion er det afgørende at administrere alle stoffet intravenøst og ikke subkutant. Frigivelsen af markøren i det subkutane væv let kan identificeres ved en gul ring kredser hale af dyret produceret af FITC-sinistrin egen farve. En subkutan injektion manifesterer typisk som en fladere kurve og langvarig markør udskillelse tid. Den mulige begrænsning ved denne metode er mere relateret til markøren anvendt end med den teknologi per se. Når et ødem er til stede i huden på et dyr, ville den transkutane vurdering af nyrefunktionen ikke anbefales, da der er et yderligere rum, som kunne ændre udskillelsen dynamik FITC-sinistrin. Tilsvarende kan pigmenteret hud begrænse anvendelsen af teknikken som følge af overlapningen excitations- og emissionsspektre af FITC-sinistrin og melanin. Men i dyr med hudpigmentering i pletter, er problemet løst ved at placere den optiskedel af indretningen i et upigmenteret område.
Det er muligt at modificere forskellige aspekter af transkutan vurdering af nyrefunktionen for at tilpasse proceduren til forskellige dyrearter og / eller fremgangsmåder. For eksempel kan den anbefalede FITC-sinistrin dosering eller længden af målingen justeres afhængig af målet af forsøget samt for forskellige arter eller dyremodeller. Denne tilpasningsevne metoden er allerede blevet bekræftet af sin vellykkede anvendelse i forskellige arter af gnavere og flere typer af stammer med forskellige sundhedsmæssige betingelser. Desuden har den transkutane vurdering af nyrefunktionen nylig blevet valideret i hunde og katte 12 med fremragende resultater. På grund af de utvivlsomme forskelle mellem disse dyr og gnavere, denne undersøgelse den passende dosis FITC-sinistrin til både, hunde og katte, og det udføres en meget længere måletid, 4 timer i stedet for 1 eller 2 timer brugd hos gnavere.
Tilsammen til anvendelsen af denne teknik kan hjælpe os til at få mere nøjagtige indsigt i nefrologi, herunder en bedre forståelse af nyresygdomsfremadskriden og virkningen af terapier. Egenskaberne ved transkutan vurdering af nyrefunktionen placerer den som en egnet teknik, der skal anvendes i human og veterinær kliniske felter i fremtiden, og bør betragtes som en lovende teknologi til at erstatte de traditionelle metoder.
Disclosures
NG har patent på produktionen af FITC-sinistrin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIC-Kidney device | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
| FITC-sinistrin | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
| Double-sided adhesive patch | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isoflurane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Leukosilk adhesive tape | BSN medical | 102200 | |
| Tubular elastic gauze bandage | MaiMed Medical GmbH | 73012 | There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice. |
| Veet depilation cream | Reckitt Benckiser | PZN7768307 | Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals |
| Micro USB cable | Samsung | APCBU10BBE | |
| Deltajonin Physiologic solution | AlleMan Pharma GmbH | 3366954 | Alternatively, it can be used saline or PBS |
References
- Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. J Am Soc Nephrol. 20, 2305-2313 (2009).
- Katayama, R., et al. Calculation of glomerular filtration rate in conscious rats by the use of a bolus injection of iodixanol and a single blood sample. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 59-64 (2010).
- Reinhardt, C. P., et al. Functional immunoassay technology (FIT), a new approach for measuring physiological functions: application of FIT to measure glomerular filtration rate (GFR). Am J Physiol Renal Physiol. 295, F1583-F1588 (2008).
- Rieg, T. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. J Vis Exp. , e50330 (2013).
- Yu, W., Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Rapid determination of renal filtration function using an optical ratiometric imaging approach. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F1873-F1880 (2007).
- Wang, E., Sandoval, R. M., Campos, S. B., Molitoris, B. A. Rapid diagnosis and quantification of acute kidney injury using fluorescent ratio-metric determination of glomerular filtration rate in the rat. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1048-F1055 (2010).
- Colson, P., et al. Does choice of the anesthetic influence renal function during infrarenal aortic surgery? Anesth Analg. 74, 481-485 (1992).
- Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. Am J Vet Res. 68, 807-811 (2007).
- Schreiber, A., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. Am J Physiol Renal Physiol. 303, F783-F788 (2012).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol Dial Transplant. 24, 2997-3001 (2009).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int. 79, 1254-1258 (2011).
- Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9, e111734 (2014).
- Schock-Kusch, D., et al. Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice. PLoS One. 8, e71519 (2013).
- Cowley, A. W. Jr, et al. Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension. 62, 85-90 (2013).
- Giani, J. F., et al. Renal angiotensin-converting enzyme is essential for the hypertension induced by nitric oxide synthesis inhibition. J Am Soc Nephrol. 25, 2752-2763 (2014).
- Sadick, M., et al. Two non-invasive GFR-estimation methods in rat models of polycystic kidney disease: 3.0 Tesla dynamic contrast-enhanced MRI and optical imaging. Nephrol Dial Transplant. 26, 3101-3108 (2011).
- Trudu, M., et al. Common noncoding UMOD gene variants induce salt-sensitive hypertension and kidney damage by increasing uromodulin expression. Nat Med. 19, 1655-1660 (2013).
- Zollner, F. G., et al. Simultaneous measurement of kidney function by dynamic contrast enhanced MRI and FITC-sinistrin clearance in rats at 3 tesla: initial results. PLoS One. 8, e79992 (2013).
