Transkutan bedömning av njurfunktion i medvetna Gnagare

Introduction

Glomerulusfiltration (GFR) är den bästa parametern för att bedöma övergripande njurfunktion. Guldmyntfoten för att bestämma GFR är beroende av urin eller plasma clearance av exogena njur markörer, såsom inulin ^1. Emellertid är dessa förfaranden är tidskrävande och komplicerad, vilket kräver insamling av serie blod och / eller urinprov och posteriora laboratorieanalyser för sin analys. Dessutom är dessa metoder är invasiva och påfrestande för djuren, vilket begränsar det antal gånger och frekvens, i vilken mätningarna kan upprepas. Ett antal alternativa metoder har utvecklats för att förenkla de klassiska förfaranden för att fastställa GFR, men de förlitar sig fortfarande på urin och plasma provtagning ^2-4 och / eller kräver djupa anestesi ^5,6, som är kända för att påverka njur hemodynamik och funktion ^{7, 8.} Slutprodukter av metabolism, såsom kreatinin, används också allmänt för att uppskatta njurfunktion. Emellertid är det känt att accurACY av dessa endogena markörer är inte optimal och dessutom att analysera dem, är urin eller blodprover också oumbärlig.

Här beskriver vi en transkutan metod för att bedöma njurfunktion hos medvetna djur. Denna metod är enklare och snabbare än traditionella metoder samt endast minimalt invasiva. Med denna teknik, med hjälp av en miniatyriserad optisk anordning och det exogena renal markör fluoresceinisotiocyanat (FITC) -sinistrin, är det möjligt att bestämma njurfunktion nästan i realtid utan behov av plasma eller urin provtagning och utan kirurgisk kateterisering för substansadministration. På grund av dessa egenskaper är metoden lämplig att utföra sekventiella mätningar i samma djur.

FITC-sinistrin är en njur markör fritt filtreras av glomerulus, utan tubulär reabsorption eller utsöndring. Den optiska delen av den miniatyriserade anordning består av två lysdioder (LED), vilka exciterarden administrerade markör och en fotodiod för att detektera fluorescens som emitteras genom huden. De angivna uppgifterna skall lagras i det interna minnet integrerade i anordningen och de kan användas för att generera den FITC-sinistrin elimineringskinetiken kurva. Strömförsörjningen av en liten uppladdningsbart litiumbatteri. För mer detaljerad information om enheten och dess enskilda komponenter avser Schreiber et al. ^9. Anordningen monteras enkelt på djurkroppen med användning av en dubbelsidig självhäftande lapp bär ett transparent fönster för de optiska komponenterna. Resultaten finns tillgängliga efter registreringsperioden är över.

Med metoden och protokoll som avses här presenterar vi en lovande teknik som kan ersätta det nuvarande guldmyntfoten för att bestämma GFR, inte bara i forskning, men även inom det kliniska området.

Protocol

Nödvändiga experiment för att utveckla protokollet utfördes enligt nationella bestämmelser och har godkänts av den lokala etiska vetenskap kommitté (Regierungspräsidium Karlsruhe).

1. Framställning av FITC-sinistrin Injection Solution

1. Lös upp FITC-sinistrin i fysiologisk saltlösning för framställning av en stamlösning. Den rekommenderade dosen i möss är 7,5 mg / 100 g kroppsvikt (BW), medan hos råttor 5 mg / 100 g BW FITC-sinistrin är att föredra. För möss, förbereda en lösning av FITC-sinistrin stamlösning på 15 mg / ml, medan råttor förbereder vid en koncentration av 40 mg / ml.
   Notera: FITC-sinistrin stamlösning kan framställas i förväg och lagras vid -20 ° C i skydd mot ljus.

2. Animal Förberedelse

1. Acklimatisera djur under minst en vecka innan de införs i alla experiment.
2. Söva djuret med användning av 5% isofluran vid 5 l / min _O2
3. Kontrollera att djuret är ordentligt sövd genom att observera sin andning, som blir långsammare och djupare, och kontrollera inga reaktioner med en brist på en tå svar.
4. När djuret sover, minska anestesi till 2,5% isofluran vid 2 L / min _O2 leveranstakt och ta BW.
5. Ta bort päls från flanken på baksidan av djuret med hjälp av en elektrisk rakapparat. Rakar ett område något större än det område som kommer att upptas av den dubbelsidiga självhäftande plåster, som har dimensionerna 3 cm x 6 cm.
6. Därefter gäller hårborttagningskräm under en kort period (2-3 minuter) för att avlägsna kvarvarande päls.
7. Tvätta noggrant området tills krämen har tagits bort helt, eftersom krämen i sig kan vara fluorescerande.
   Obs: Undvik att repa huden på djuret eftersom det kan orsaka irritation / ödem. Om avhårade området visar pigmentering på huden, raka ett större område tills en icke-pigmenterad platsen föroptiska delen av anordningen finns. Det rekommenderas att raka 24 timmar i förväg för att minimera anestesi exponering.

3. Anordning Beredning

1. Placera den optiska anordningen för att mäta njurfunktionen på en sida av den dubbelsidiga självhäftande lapp, placera den optiska delen ovanför det transparenta fönstret (Figur 1) som lämnar den motsatta delen med skyddsfolien.
   Notera: När man arbetar med små gnagare, minska storleken av plåstret som visas i Figur 2.
2. Fäst en bit av dubbelsidiga självhäftande lapp av matchande storlek batteriet som visas i figur 3.

4. Fixering av Enheten Animal

1. Beräkna lämplig volym injektion baserad på djurens kroppsvikt.
2. Söva djuret med isofluran som tidigare indikerats på avsnitten 2.1-2.3.
3. Klipp en bit tubulär elastisk gasbinda of ca 1 cm längre än bredden av den dubbelsidiga självhäftande lapp som skall användas.
4. Dra den elastiska gasbinda över huvudet på djuret och plats på ryggen, lämnar rakade området avslöjats.
   Obs! Du kan fästa enheten med enbart tejp, men vara medveten om otillbörliga påtryckningar på enheten.
5. Anslut batteriet till enheten genom att ansluta batterikontakten till motsvarande port på enheten. Efter att ta bort skyddsfolien från bit av plåstret och montera batteriet på den övre ytan av anordningen (Figur 4A). Se till att batteriet är korrekt ansluten genom att kontrollera att enheten börjar blinka.
   Obs: Hos råttor, kan batteriet också fästas direkt på självhäftande lapp, bredvid enheten (Figur 4B).
6. Ta bort skyddskåpan från plåstret med manöverdosan och placera den på det rakade området på baksidan av djuret håller dets kanter tills den är korrekt fast.
7. Täcka enheten med den rörformiga elastiska gasbinda vidhäftar det på den vidhäftande ytan av plåstret (Figur 5).
8. Korrekt sträcka den rörformiga bandage på buken hos djuret, vilket säkerställer att benen kan röra sig fritt.
9. För en bättre fixering och skydd av anordningen, applicera en remsa av tejp efter formen på anordningen och som täcker trådarna i batteriet.
10. Mät bakgrund för 1-3 minuter, utan att sätta press på enheten

5. FITC-sinistrin administration och värdering ordningen

1. Om så är nödvändigt, värma upp den bakre delen av djuret med hjälp av varmt vatten innan injektion eller en temperaturstyrd värmeplatta längs hela förfarandet.
2. Injicera genom svansvenen lämplig volym av FITC-sinistrin stamlösning. Volymen injektions beror på djur BW och därför skall beräknas för varje enskilt considering den önskade dosen och koncentration av stamlösningen, tidigare nämnda i avsnitt 1.1.
3. Säkerställa att alla FITC-sinistrin Lösningen ges intravenöst och inte subkutant.
   Obs: Alternativt kan FITC-sinistrin administreras med hjälp av en pre-implanterade intravenös kateter avslutas vid nacken hos gnagare eller via retro orbital injektion i möss.
4. Försiktigt, tillbaka djuret till sin hemma bur undvika starka rörelser och något tryck på enheten, eftersom det skulle innebära rörelse artefakter.
5. Placera buren på en lugn plats för att undvika att djuret är störd.
6. Utföra mätningen under åtminstone en timme om arbetar med möss och två h vid användning av råttor. Under denna period kommer den optiska enheten mäta genom huden fluorescens som emitteras av FITC-sinistrin.
   Notera: Under inspelningen perioden djuret måste värd ensam. Dessutom vattenförsörjning, liksom utskjutandestrukturer såsom tråd lock, måste avlägsnas för att undvika skador på den elektroniska anordningen och rörelseartefakter på grund av kollisioner med föremål.

6. Device Removal

1. När inspelningstiden är över, ta bort enheten utan bedövning; men om det behövs, söva djuret kort under 5% isofluran vid 5 L / min O ₂ leveranshastigheten under 2 min.
2. Dra försiktigt bort tejpen först, sedan den rörformiga bandage.
3. lossa försiktigt dubbelsidig självhäftande lapp från huden och tillbaka djuret till sin normala hem bur.

7. Läs av data

1. Koppla bort batteriet från enheten och ta bort klister plåstret.
   Obs: Data lagras på enheten tills en ny mätning startas. När ett batteri är anslutet lagrad data skrivs över med nya inspelningar. Därför inte återansluta batteriet innan du laddar ner data frånanordning. Det finns en 10 sek frist avsedd för oavsiktliga omkopplingar av batteriet.
2. Anslut enheten till en dator med hjälp av en mikro-USB-kabel och hämta data med hjälp av den medföljande programvaran. Utdatafilen är en CSV-fil som kan öppnas och modifieras med ett kalkylprogram.
3. Öppna datafilen med den aktuella programvaran för den optiska enheten och generera eliminerings kinetik kurvan med hjälp av programprotokollen.
4. Analysera kurvan genom att följa instruktionerna som medföljer den optiska enheten. Kort, för utvärdering av data, ställa in bakgrundssignalen mäts före FITC-sinistrin administration och markerar början av den exponentiella utsöndringsfasen av markören, vilket vanligtvis sker 15 min och 45 min efter bolusinjektion i möss och råttor respektive .
   Obs: Programmet visar automatiskt FITC-sinistrin halveringstid (t _1/2) tillsammans med värdet ett ^R2, bestäms av en 1-Compartment modell. t _1/2 kan användas för att beräkna GFR med hjälp av en omvandlingsfaktor ^9,10.

Representative Results

Installationen av den transkutana mätningen är mycket enkel och snabb: enheten placeras på dubbelsidig självhäftande lapp (Figur 1) och justeras i storlek om det behövs (Figur 2), batteriet är beredd (Figur 3) och ansluten (figur 4).

Denna metod för att bedöma njurfunktionen har redan validerats i olika arter jämfört med den traditionella metoden av plasmaclearance ^9,11,12. Efter protokollet exponeras här, Schreiber et al. visade giltigheten av tekniken i olika musmodeller, visar mycket jämförbara resultat bland de transkutan mätning och plasmaclearance för alla grupper studerades (tabell 1) ^9. I detta arbete den erhållna t _1/2 omvandlades till GFR med hjälp av en musspecifikt semi-empirisk omvandlingfaktor.

Konsistensen av transkutan bedömning av njurfunktionen har också visat sig att använda olika stammar av möss. Sekventiella mätningar inom 3 dagar i samma djur visade en koefficient på variationer av 3,0-6,2% ^13. I denna studie fanns ingen omvandling till GFR men resultaten uttrycktes och tolkas direkt i termer av t _1/2.

Möjligheten att få resultaten nästan i realtid är en av de stora fördelarna med denna metod. Efter inspelningstiden, resultaten är omedelbart tillgängliga för analys och den medföljande programvaran visar utsöndringen kurvan för FITC-sinistrin omedelbart (Figur 6). Inom samma programvara t _1/2 av FITC-sinistrin kan erhållas, som direkt kan användas som parameter för att bedöma njurfunktion omvandlas i termer av GFR. Figur 7 1/2 ökar på grund av minskad utsöndring av ämnet och utseendet på kurvan ändras. Vanligtvis gör den uppmätta kurvan inte komma tillbaka till bakgrundsnivån och presenterar en ökad area under kurvan. I samma djur, kan mätningar från före till efter skada uppleva en ökning av den maximala fluorescensintensitet på grund av ansamling av markören som orsakas av dess reducerade utsöndring. I närvaro av njursvikt, kan transkutant uppmätta kurvan för FITC-sinistrin visar ett stabilt tillstånd på grund av kraftigt nedsatt funktion (Figur 7B).

Användningen av den miniatyriserade enheten på flera stammar av gnagare med olika hälsostatus har visat att denna teknik är lämplig och tillräckligt känsligt för att upptäcka förändringar due till njursjukdom och åldrande. Tabell 2 visar en sammanfattning av de murina modeller som studerats hittills med denna metod.

Figur 1. Placering av anordningen på den dubbelsidiga självhäftande plåster. Anordningen är monterad på adhesiva lappen positionering dess optiska del i det transparenta fönstret.

Figur 2. Anpassning av adhesiva lappen för små stora gnagare. För användning i små djur är det rekommenderat att minska storleken på plåstret. A: Använd enheten som en guide för att skära plåstret ordentligt. B: När önskad storlek har erhållits, anordningen kan placeras på den klibbiga sidan av plåstret. Pleasa klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Beredning av batteriet. För att fästa batteriet till enheten, skära en liten bit av dubbelsidig självhäftande lapp (A och B) och placera den på ytan av batteriet (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Anslutning och placeringen av batteriet under mätningen. (A) I små gnagare såsom möss, på grund av det reducerade utrymmet, måste batteriet placeras ovanpå enheten. (B) I större djur batteri cen placeras intill enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Placering av den rörformiga elastiska gasbinda i en råtta. Den rörformiga bandage bör omfatta dubbelsidig självhäftande lapp utan att störa den fria rörligheten för armar och ben för bekvämligheten av djuret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Representativa bild av en elimineringskurva av FITC-sinistrin. Den signal som genereras av FITC-sinistrin detekteras transcudigt och lagras i det interna minnet på enheten. När den inspelade datan hämtas till en dator, genererar programmet en kurva som är jämförbar med den som presenteras i bilden. Y-axeln visar den inspelade fluorescensintensiteten [AU], som avges av den injicerade FITC-sinistrin markör, medan X-axeln representerar varaktigheten av mätningen i tid [min]. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7. representativ bild av en eliminering kurvan för FITC-sinistrin hos djur med nedsatt njurfunktion. (A) FITC-sinistrin kurva eliminering hos djur med nedsatt njurfunktion visar typiskt en ökad area under kurvan och oförmåga att nå baslinjen inom normal mätperiod . (B) I allvarligt nedsatt djuren transkutant uppmätta kurvan kan visa ett stabilt tillstånd som indikerar njursvikt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Validering av transkutan mätning genom att jämföra med den traditionella plasmaclearance. Den transkutan mätning av njurfunktionen har validerats i olika musmodeller (friska och ensidigt nefrektomiserad (UNX) C57BL / 6-129 SV möss och musmodell av nephronophthisis ( pCY)) jämfört med plasmaclearance. Värden är medelvärden ± SD. GFR, glomerulusfiltration ^9.

/53767/53767table2.jpg "/>
Tabell 2. Murina modeller studerades med hjälp av transkutan mätning UNX ensidigt nefrektomiserad. ACE, angiotensin-omvandlande enzym; T ^{gumodwt / vikt,} transgen uromodulin knockout, SD, Sprague Dawley-råtta; PKD, polycystisk njursjukdom.

Discussion

Föreliggande dokument beskriver förfarandet för att bestämma njurfunktionen hos medvetna gnagare med hjälp av en miniatyriserad enhet och det exogena njur markör FITC-sinistrin. Som nämnts tidigare, har denna metod flera fördelar i jämförelse med traditionella förfaranden av urin och plasmaclearance. En av dem är oberoende av blod och urin provtagning, vilket leder till stora besparingar i form av förbrukningsvaror, tid och, naturligtvis, djur stress.

Som framgår av tabell 2, den exogena njur markör FITC-sinistrin och mätning av dess elimineringskinetik genom huden tillåta effekterna av njur patologier på njurfunktionen som ska studeras ^9,10,14-18. Serie insamling av blodprover som krävs för att bedöma plasmaclearance eller biomarkörer av njursjukdom är stressande för djuret, besvärliga och tidskrävande för forskarna. Därför har sekventiella mätningar inom samma djur varit limsas av djurens välbefinnande och metodologiska skäl. Det visade sig vara inom-djur reproducerbarhet transkutan mätning ¹³ gör det till en idealisk metod för att upptäcka förändringar i njurfunktionen på grund av sjukdomsprogression eller åldrande. Av samma skäl kan det också vara mycket användbara för att studera effektiviteten av terapeutiska tillvägagångssätt.

Två viktiga steg för en framgångsrik tillämpning av denna teknik är fixeringen av den optiska enheten på djuret och korrekt administration av markören. Enheten måste vara lämpligt fast för att undvika rörelse artefakter. För detta ändamål, är av avgörande betydelse att förhindra fastsättning och borttagning av den dubbelsidiga självhäftande plåster eftersom det kan leda till förlust av dess vidhäftande egenskaper och i slutändan en olämplig fixering på djuret. Som nämnts i protokollet, immobilisering och skydd av den optiska enheten genom att täcka den med tejp är ett effektivt sätt att säkerställa en Adequate fixering. När man utför FITC-sinistrin bolusinjektion är det viktigt att administrera alla ämnet intravenöst och inte subkutant. Frisläppandet av markören i den subkutana vävnaden kan lätt identifieras av en gul ring cirklar svansen av djur som framställts genom FITC-sinistrin egen färg. En subkutan injektion manifesterar vanligtvis som en flackare kurva och långvarig markör utsöndring tid. Den möjliga begränsning med denna metod är mer relaterade till markören används än med tekniken per se. När ett ödem förekommer i huden på ett djur, skulle transkutan bedömning av njurfunktionen inte rekommenderas, eftersom det finns en annan avdelning som kan påverka utsöndringen dynamiken i FITC-sinistrin. På liknande sätt kan pigmenterad hud begränsa användningen av tekniken på grund av att den överlappande excitations- och emissionsspektra av FITC-sinistrin och melanin. Men i djur med hudpigmentering fläckvis, löses problemet genom att placera den optiskaen del av anordningen i en opigmenterad område.

Det är möjligt att modifiera olika aspekter av den transkutana bedömning av njurfunktion, för att anpassa förfarandet till olika djurarter och / eller inflygning. Till exempel kan den rekommenderade FITC-sinistrin dosering eller längden av mätningen justeras beroende på målet med experimentet såväl som för olika arter eller djurmodeller. Denna anpassningsförmåga metoden har redan bekräftats av dess framgångsrik tillämpning i olika arter av gnagare och flera typer av stammar med varierande hälsotillstånd. Dessutom har transkutan bedömning av njurfunktionen har nyligen godkänts i hundar och katter ¹² med utmärkta resultat. På grund av att de obestridliga skillnaderna mellan dessa djur och gnagare, bestäms denna studie den lämpliga dosen av FITC-sinistrin för både, hundar och katter, och det utförs en mycket längre mättid, 4 timmar i stället för de 1 eller 2 timmar användningd hos gnagare.

Sammantaget användningen av denna teknik kan hjälpa oss att få mer exakta insikter i nefrologi, inklusive en bättre förståelse av njursjukdom progression och effekten av terapi. Egenskaperna hos den transkutana bedömning av njurfunktionen placerar den som en lämplig teknik som skall användas i human- och veterinär kliniska områden i framtiden, och bör betraktas som en lovande teknik för att ersätta den traditionella metoder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NIC-Kidney device	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
Tubular elastic gauze bandage	MaiMed Medical GmbH	73012	There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.
Veet depilation cream	Reckitt Benckiser	PZN7768307	Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals
Micro USB cable	Samsung	APCBU10BBE
Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS