Hücre nakli, hücre iskeleti etiketleme ve fonksiyon kaybı/kazanımı yaklaşımlarını birleştiren bu protokol, göç eden zebra balığı prospektif prekordal plağın, in vivo hücre göçünde bir aday genin işlevini analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre göçü, kanser metastazı da dahil olmak üzere birçok fizyolojik ve patolojik durumun anahtarıdır. Hücre göçünün hücresel ve moleküler bazları in vitro olarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Bununla birlikte, in vivo hücre göçü bir şekilde in vitro göçten farklıdır ve analiz edilmesinin daha zor olduğu, doğrudan gözlem ve manipülasyon için daha az erişilebilir olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, aday genlerin hücre göçündeki işlevini incelemek için bir model sistem olarak erken zebra balığı embriyosunda prospektif prekordal plakanın göçünü kullanır. Prekordal plaka progenitörleri, gastrulasyon sırasında embriyonik organizatörden embriyonun hayvan kutbuna yönlendirilmiş bir göç geçiren bir hücre grubu oluşturur. Önerilen protokol, mozaik embriyolar oluşturmak için hücre naklini kullanır. Bu, iyi görüntülemenin anahtarı olan izole hücrelerin etiketlenmesinin ve gözlemlenen hücrelere fonksiyon kazancı / kaybı etkilerinin sınırlandırılmasının ve dolayısıyla hücre özerk etkilerinin sağlanmasının birleşik avantajlarını sunar. Burada, hücre göçünde TORC2 bileşeni Sin1'in işlevini nasıl değerlendirdiğimizi açıklıyoruz, ancak protokol, in vivo hücre göçünü kontrol etmede herhangi bir aday genin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.
Giriş
Çok hücreli organizmalarda, hücre göçü bu doku ve organların içine hücreleri organizasyonunu sağlayan embriyonun gelişimi için ve doku homeostazında (yara iyileşmesi) ve bağışıklık yer alır erişkin yaşamda, hem esastır. Bu fizyolojik fonksiyonlara ek olarak, hücre göçü, kanser metastazı, dahil olmak üzere, özellikle de çeşitli patolojik durumlarda, katılır.
Hücre göçü düz yüzeylere hücre hareketlerini sağlayan moleküler mekanizmaların genel bir anlayış sağlayarak, yıllardır in vitro analiz edilmiştir. Vivo Bununla birlikte, hücreler daha karmaşık bir çevre tarafından karşı karşıya kalırlar. Açık bir şekilde taşıma kılavu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Şekil 1 protokolünün anahat sunar.
Enjeksiyon ve Transplantasyon için iğneler hazırlanması 1.
Not: İğneler her zaman hazırlanmış ve saklanabilir. modelleme kil bandında, bir Petri kabındaki tutun. tozdan korumak için parafilm çanak mühür.
- Enjeksiyon iğneleri, bir mikropipet çektirmesi ile (Malzeme listesine bakınız) (filamanın (Malzeme listesine bakınız) olmadan, çap 0.58 mm iç çapı 1.0 mm dışında) cam kılcal çekin. bunlar koryon delmek için daha etkin olarak kısa ve ince iğneler (yaklaşık 5 mm'lik konik bölümü tercih).
Not: Enjeksiy....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sunulan teknik vivo hücre göçü kontrol, sin1, Tor karmaşık 2 (TORC2) çekirdek bileşenlerinden biri rolünü analiz etmek için kullanıldı. hücre nakli kullanımı izole hücreler ve hücre özerk etkilerinin analizi etiketleme izin verir. Film S1 nakledilen prechordal plaka progenitör hücrelerin göçünü gösteriyor. ABP140 ile Aktin etiketleme aktin zengin sitoplazmik uzantıların kolay görüntüleme sağlar. Biz onların sıklığını ve yönünü ölçülür. Yabani tip hücrelerin göç yönüne <.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, in vivo olarak, canlı görüntüleme hücre transplantasyonu ile kimerik embriyo oluşturulmasını birleştirerek hücre göçü bir aday genin rolünü araştırmak için kolay bir yol sunar.
mozaik embriyoların Yaratılış
Bir hücrenin dinamiklerini incelenmesi sitoplazmik uzantıları analiz etmek onun konturu görselleştirme gerektirir. böylece iyi bir görsel kontrast sunan, çevre - ya da farklı etiketli - Bu bir başka etiketsiz izole hücrelerin etiketlenmes.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Mükemmel zebra balığı bakımı için F. Bouallague'ye ve IBENS hayvan tesisine teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, SFI20111203770 ve 20131200143 No'lu PJA hibeleri tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cam kılcal damarlar (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.58 mm) | Harvard | Aparatı 300085 | standart kalınlıkta |
| Cam kılcal damarlar (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.78 mm) | Harvard Aparatı | 300085 | ince duvarlı |
| Penisilin-Streptomisin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 birimler penisilin ve 10 ml ince cımbız başına mg streptomisin |
| Dumont Güzel Bilim Araçları | 11254-20 | 5F | |
| cam alt tabaklar | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Hava transjektörü | Eppendorf | 5246 | |
| Mikro dövme | Narishige | MF-900 | |
| Mikro öğütücü | Narishige | EG-44 | |
| Mikromanipülatör (enjeksiyon için) | Narishige | MN-151 | |
| Mikromanipülatör (hücre nakli için) | Leica | Leica Mikromanipülatör | |
| Hammilton Şırınga | Narishige | IM-9B | |
| Mikropipet çektirme | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantasyon kalıbı | Adapative Bilim Araçları | PT-1 | |
| İğne tutucu | Narishige | HI-7 | |
| Tüp konektörü | Narishige | CI-1 | |
| PTFE boru | Narishige | CT-1 |
Kaynaklar
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal o....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
