Combinando los enfoques de trasplante de células, marcaje del citoesqueleto y pérdida/ganancia de función, este protocolo describe cómo se puede utilizar la placa precordal prospectiva del pez cebra en migración para analizar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo.
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En este artículo
Resumen
Resumen
La migración celular es clave para muchas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo la metástasis del cáncer. Las bases celulares y moleculares de la migración celular han sido analizadas minuciosamente in vitro. Sin embargo, la migración celular in vivo difiere de alguna manera de la migración in vitro, y ha demostrado ser más difícil de analizar, siendo menos accesible a la observación directa y la manipulación. Este protocolo utiliza la migración de la placa precordal prospectiva en el embrión temprano de pez cebra como un sistema modelo para estudiar la función de los genes candidatos en la migración celular. Los progenitores de la placa precordal forman un grupo de células que, durante la gastrulación, experimentan una migración dirigida desde el organizador embrionario hasta el polo animal del embrión. El protocolo propuesto utiliza el trasplante de células para crear embriones en mosaico. Esto ofrece las ventajas combinadas de etiquetar células aisladas, que es clave para una buena obtención de imágenes, y de limitar los efectos de ganancia/pérdida de función en las células observadas, lo que garantiza efectos autónomos de la célula. Describimos aquí cómo evaluamos la función del componente Sin1 de TORC2 en la migración celular, pero el protocolo se puede utilizar para analizar la función de cualquier gen candidato en el control de la migración celular in vivo.
Introducción
En los organismos multicelulares, la migración celular es esencial tanto para el desarrollo del embrión en el que se asegura la organización de células en tejidos y órganos, y para la vida adulta, en el que toma parte de la homeostasis del tejido (cicatrización de heridas) y la inmunidad. Además de estas funciones fisiológicas, la migración celular también participa en diversas situaciones patológicas, incluyendo, en particular, la metástasis del cáncer.
La migración celular se ha analizado in vitro durante décadas, proporcionando una comprensión global de los mecanismos moleculares que garanticen movimientos de la célula en supe....
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Protocolo
Nota: La Figura 1 presenta el esquema del protocolo.
1. Preparación de las agujas para inyección y Trasplante
Nota: Las agujas se puede preparar en cualquier momento y se almacena. Mantenerlos en una placa de Petri, en una banda de pasta de modelar. Sellar la placa con parafilm para proteger del polvo.
- Para agujas de inyección, tirar de un capilar de vidrio (diámetro exterior de 1,0 mm, diámetro interior de 0,58 mm, sin filamento (véase la lista de materiales)) con un extractor de micropipeta (véase la lista de materiales). Prefiero agujas cortas y ....
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Resultados
La técnica presentada se utilizó para analizar el papel de sin1, uno de los componentes principales de la Tor complejo 2 (TORC2), en el control de la migración celular in vivo. El uso de trasplante de células permite el etiquetado de las células y análisis de los efectos de células autónoma aisladas. Película S1 muestra la migración de las células progenitoras de la placa precordal trasplantados. etiquetado de actina con ABP140 permite la visualización fácil de protuber.......
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Discusión
Este protocolo presenta una forma fácil de estudiar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo, mediante la combinación de la creación de embriones quiméricos utilizando el trasplante de células con imágenes en directo.
Creación de embriones de mosaico
El estudio de la dinámica de una célula requiere la visualización de su contorno para analizar extensiones citoplasmáticas. Esto se puede lograr mediante el etiquetado de las células ai.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a F. Bouallague y al animalario IBENS por su excelente cuidado del pez cebra. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por la Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, las becas N° SFI20111203770 y N° PJA 20131200143.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Capilares de vidrio (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,58 mm) | Aparato Harvard | 300085 | capilares |
| (diámetro exterior 1,0 mm, diámetro interior 0,78 mm) | Aparato Harvard | 300085 | |
| penicilina-estreptomicina | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 unidades de penicilina y 10 mg de estreptomicina por ml |
| pinzas finas | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| platos con fondo de vidrio | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Transjector de aire | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Micromolinillo | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulador (para inyección) | Narishige | MN-151 | |
| (para trasplante de células)Micromanipulador | Leica Leica | ||
| Jeringa Hammilton | Narishige | IM-9B | |
| David Kopf Instruments Modelo | 720 | ||
| Molde de trasplante | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Portaagujas | Narishige | HI-7 | |
| Conector de tubo | Narishige | CI-1 | |
| Tubo de PTFE | Narishige | CT-1 |
Referencias
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal o....
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Reimpresiones y permisos
