Summary
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för insamling av tryck-volymdata från musen.
Abstract
Att förstå orsakerna till och utvecklingen av hjärtsjukdomar utgör en stor utmaning för den biomedicinska samhället. Den genetiska flexibiliteten hos mus ger en stor potential för att utforska hjärtfunktionen på molekylär nivå. Musens litenhet gör presentera några utmaningar i fråga om att utföra detaljerad hjärt fenotypning. Miniatyrisering och andra framsteg inom teknik har gjort många metoder för hjärtundersökning möjligt i musen. Av dessa samtidig datainsamling tryck och volym ger en detaljerad bild av hjärtfunktionen som inte är tillgänglig genom någon annan modalitet. Här ett detaljerat förfarande för insamling av tryck volym loop uppgifter beskrivs. Inkluderat är en diskussion av de principer som ligger till grund för mätningar och de potentiella felkällor. Bedövningsmedel förvaltning och kirurgiska metoder diskuteras i detalj eftersom de är båda kritiska till att få hög kvalitet hemodynamiska mätningars. Principerna för hemodynamiska protokoll utveckling och relevanta aspekter av dataanalys tas också upp.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom är fortfarande en viktig orsak till dödlighet och sjuklighet i hela världen en. Sjukdomar i hjärta presenterar särskilt svåra utmaningar i att utveckla nya behandlingsmetoder. Framsteg inom genetik ger möjlighet att identifiera en mängd potentiella genetiska bidrags till utvecklingen av hjärtsjukdomar. Den integrerande karaktär kardiovaskulära systemet kräver att dessa genetiska mål valideras i intakta djurmodeller. De genetiska flexibilitet och låga boendekostnader på musen har fört det i förgrunden för bedömningen av den fysiologiska rollen av en viss gen. Den lilla storleken på musen presenterar några unika utmaningar för bedömning av hjärtfunktionen. Det finns flera modaliteter som kan ge information om hjärtfunktionen, men endast den samtidig mätning av ventrikulärt tryck och volym medger tryck-volym (PV) slinganalys av ventrikulär funktion. PV-slingor allaow hjärtfunktion som skall analyseras oberoende av dess anslutning till vaskulaturen; en viktig faktor vid bestämning av den funktionella rollen av en viss genetiskt element.
Bedömningen av tryckvolymslingor har använts både experimentellt och kliniskt under många år och omfattande litteratur existerar när det gäller analys av dessa datamängder 2,3. Anpassningen av PV slingteknik till musen har varit en viktig utveckling för förståelsen av murina hjärt fysiologi 4-6. Kateter baserade PV slingtekniker par en tryckomvandlare och användningen av konduktans för att uppskatta ventrikulär volym. Den ventrikulära volymen bestäms genom att undersöka förändringar av ett elektriskt fält som genereras av katetern. Denna metod modeller ventrikeln som en cylinder, är höjden på vilken definieras av avståndet mellan elektroderna på katetern och radien beräknas ur ledning av ett elektriskt fält genom blodet iventrikeln 7-9. Konduktanssignalen mätt med katetem har två komponenter. Det första är den ledning genom blod; detta varierar med volymen av ventrikeln och utgör den primära signal som används för att bestämma ventrikulär volym. Den andra komponenten är ett resultat av ledning genom och längs väggen av ventrikeln. Detta kallas parallellkonduktansen och måste tas bort för att bestämma den absoluta kammarvolymen. Det finns två kommersiellt tillgängliga system för insamling av tryckvolymuppgifter i forskningslaboratoriet och den metod som används för att beräkna och avlägsna parallellkonduktansen är den främsta skillnaden mellan dem 6,10,11. Konduktans katetrar kräver injektion av hyperton saltlösning för beräkning av parallellkonduktansen. Denna injektion transient förändrar ledningsförmågan av blodet i ventrikeln, under det att ledningsförmågan hos väggen förblir konstant. Från dessa data är det möjligt att bestämma denkomponent av konduktans signal som härrör från blodet och det som kommer från den ventrikulära väggen. Detta tillvägagångssätt förutsätter att parallellkonduktansen inte varierar under hjärtcykeln. Admittansen metod förlitar sig på fasändringar i det elektriska fältet för att bedöma bidraget av den ventrikulära väggen till den totala volymsignalen. Denna metod förlitar sig på en mängd olika förutbestämda konstanter för konduktiviteten hos blodet och hjärtmuskulaturen för att bestämma den slutliga volymen, men gör kontinuerliga åtgärder av parallellkonduktansen under hjärtcykeln. Båda dessa system ger bra uppskattningar av vänsterkammarvolym och skillnaderna mellan dem är inte sannolikt att vara fysiologiskt signifikant. Den cylindriska modell av kammaren och andra antaganden gör dessa kateterbaserade metoder inte lika exakt som andra former, men dessa uppgifter tillhandahålls på ett beat-för-slag-basis som är nödvändig för bedömningen av last oberoende mått på hjärtfunktionen.
Tillvägagångssättet som beskrivs här används i mitt laboratorium och har lämnat uppgifter för ett stort antal studier som undersöker de grundläggande patofysiologiska mekanismer av dystrofisk kardiomyopati 12-18. Tillvägagångssättet beskrivs nedan är en av två som kan användas för att få fram data PV loop. Även om många av de principer som gäller för båda metoderna, kommer detta protokoll att fokusera på en öppen kista apikala strategi; en sluten bröst protokoll har i andra delar 19,20. Medan förfarandet kommer att beskrivas i detalj, de viktiga övergripande principerna är att exponera hjärtat med minimal skada på antingen hjärtat eller lungorna. Under hela protokollet är det viktigt att komma ihåg att detta är en icke-överlevnad förfarandet och att ha en bra exponering av hjärtat är av avgörande betydelse för en korrekt placering av katetern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Innan du utför någon av åtgärderna som beskrivs i detta protokoll, erhålla godkännande av den lokala institutionella djurvård och användning kommittén.
1. Installera den experimentella Rig
Notera: Denna procedur utförs på bedövade djur och kvaliteten av uppgifterna är proportionell mot kvaliteten av bedövningsmedlet stöd som erbjuds till djuret. Denna första avsnittet detalj utrustning och förfaranden som är nödvändiga för att ge anestesi till musen när de utför detta protokoll.
- Välj ett bedövningsmedel protokoll. Inhalant bedövningsmedel har många positiva egenskaper för att utföra PV-loop analys, även om vissa injicerbara protokoll har använts också. Se diskussionen för mer information om hur du väljer ett bedövningsmedel regim.
- Säkert komprimerade syrgastuber till operationsbordet eller väggen nära operationsområdet.
- Om du använder inhalant bedövningsmedel, använder en förångare för att försäkrakorrekt dosering. Kalibrera förångare årligen för att säkerställa att de tillhandahåller lämplig dos av bedövningsmedel gas. Ansluta förångare till en flödesmätare som medger kontroll av den hastighet med vilken gasen kommer in i anestesikretsen. Inställd på 0,5-1,0 l / min.
- Använda ett grenrör för att tillåta riktad flöde av anestesigas till 1) den induktionskammare, 2) en mask, och 3) ventilatorn. Sophantering anestesigas är mycket viktigt och bör utföras av ett aktivt system som antingen ventiler i ett dragskåp (eller annan liknande byggnad infrastruktur) eller genom en kapsel för att ta bort anestesigaser.
Obs: Kontrollera med lokala företagshälsovården tjänstemän för att säkerställa att alla lokala föreskrifter. - Upprätthålla kroppstemperaturen med hjälp av värmedynor och / eller uppvärmningen lampor. Kontinuerligt övervaka kroppstemperaturen med en rektal termometer. Detta kommer att möjliggöra proaktiva ökningar eller minskningar av uppvärmning för att säkerställa en fysiologisk kroppstemperatur (ͭ6; 37 ° C) under insamlingen av hemodynamiska data.
- Åstadkomma fluid stöd för att motverka blodförlust och okänslig volymförlust.
- Bered en 10% lösning av albumin i 0,9% NaCl genom att ta 1 ml 25% albumin och tillsats av 1,5 ml av 0,9% NaCl i en spruta.
- Förbered en låg kvarvarande volym intravaskulär kateter.
- Använd tång för att krossa plast navet i en 0,5 tum 30 gauge nål. Med hjälp av nålhållare, gripa nålen och ta bort navet. Skrapa kvarvarande lim från nålen med hjälp av en hemostat. För in den trubbiga änden av nålen i en längd av microbore slangen. Använd mindre än 20 inches av längd för slangen.
- Använd en sprutpump för att tillåta exakta volymer som skall levereras.
- Säkerställa tillräcklig ventilation för insamling av PV data av hög kvalitet. Det finns en mängd av mus fläktar finns att köpa. Tryckstyrda fläktar ger sluten miljö som krävs för inhalationsmedel ennesthetic gaser och ge bättre styrning av ventilationen under förfarandet.
- Säkerställa att inspiratoriska tryck är begränsade till <15 cm H2O för att förhindra barotrauma. Ställ ventilatorn att avge den inspiratoriska puls under 35% av andningscykeln. Användningen av positiva slutexpiratoriskt tryck (PEEP) i en halt av 4-5 cm H2O kommer att kraftigt förbättra ventilationen av musen, genom att förhindra atelektas av lungan och stödja gasutbyte.
- Begränsa dödutrymmet distalt till Y-förbindningen i ventilationskretsen. Detta är avgörande eftersom musens tidalvolym är mycket liten och något dött utrymme subtraherar från leveransen av frisk inandningsluften.
- Skapa en mus storlek endotrakeal (ET) rör genom att skära av spetsen av en 20 gauge kvar intravaskulär kateter. Detta ger en avsmalnande spets för enklare införing. Placera den skurna änden i Y-förbindningen av anestesikretsen.
- Använd böjlig slang i andningskrets. Någon strukturell minne i slangen kommer att skapa yttre krafter som har potential för att dra den endotrakeala tuben ut ur musen luftväg.
- Låt musen bestämma andningsfrekvensen genom att använda lägsta ränta som undertrycker den endogena andningsdrift. Starta vid en relativt långsam andningsfrekvens på ca 60 andetag per minut.
Obs: Med lämplig ventilation musen bör göra mycket liten ansträngning att andas. Men om ventilationen är otillräcklig, kommer uppbyggnaden av CO2 i blodet initiera andningsansträngning av musen. Om detta observeras, vilket ökar andningsfrekvensen är en rättfram sätt att öka alveolär ventilation. Det är ofta nödvändigt att öka andningsfrekvens som svar på förhöjningar i hjärtats belastning associerad med beta-adrenerga receptorstimulering. - När andningskretsen är beredd, tryck testa systemet genom att ansluta spetsen av den endotrakeala (ET) röretmed ett finger. Garantera en luftvägstryck på ≈10 cmH 2 O. Detta test ska utföras före varje förfarande.
2. kirurgisk metod
- Använd små pincett och sax och annan utrustning från tabell 1. Alla instrument är ganska små för att möjliggöra enkel användning i den förstorade kirurgiska området. Använd en kirurgisk stereo att ge tillräcklig förstoring för flera aspekter av det kirurgiska ingreppet.
- Använd en diatermi för att maximera hemostas under förfarandet.
Obs: Det finns ett par av breda klasser av diatermi. Thermocautery värmer ett tunt metallelement som kommer att skära igenom muskelvävnad och stoppa blödning. Dessa system är initialt relativt billiga; men det är viktigt att notera att de tråd tips är både skör och relativt kostsamma. Diatermi system är dyrare att köpa i början, men de tips är mycket robust och kommer inte att behöva ersättad. - Induktion och Kirurgisk förberedelse
- Erhålla kroppsvikten hos musen.
- Placera musen i en induktionskammare som är fylld med 5% isofluran.
Obs: Musen kan inte överleva mer än ett par minuter i denna miljö. Endast 45-60 sekunder krävs för musen för att förlora sina rätande reflex (insatser för att vända över när de placeras på rygg eller på sidan). - När rätande reflex försvinner, minskar Isoflurankoncentration till 2% och öppna narkosgas till masken.
- Snabbt överföra musen till operationsbordet och placera den i rygg VILA med nosen i masken.
- Om du använder diatermi, använd saltlösning indränkt gasbinda för att elektriskt koppla musen till jordplattan av diatermisystem.
- Säkra lemmar med kirurgtejp. Detta band ger adhesiva egenskaper även i vått tillstånd.
- Sätt en rektal ThermoProbe för övervakning kärnkropptemperatur. Säkra med tejp.
- Applicera en hårborttagnings till halsen och bröstet av musen. Vänta 2-3 minuter för hårborttagnings att arbeta, och sedan ta bort päls från dessa områden med hjälp av en bomullspinne och / eller laboratorie våtservetter.
Notera: Drapering av det kirurgiska området erfordras inte, eftersom detta är en icke-överlevnad förfarande, men kan vara önskvärt att begränsa kirurgens exponering för diatermi jorddynan, om sådan används. - När musen förberedd för operation, bedöma den kirurgiska plan musen genom att utföra en tå nypa. När säker på ett lämpligt anestesidjups musen är redo för första snittet.
- Få kontroll över luftvägarna genom oral intubation eller trakeotomi. Trakeotomi är en praktisk metod som är relativt enkel att utföra.
Notera: Under denna metodbeskrivning alla riktningar och riktlinjer kommer att vara i förhållande till kirurgen.- Gör ett snitt på level av sternala skåran sträcker sig från ≈ 5 mm höger om mittlinjen till ≈ 5 mm till vänster om mittlinjen.
- Göra ett andra snitt som sträcker sig längs den högra kanten av den första snitt, som sträcker sig rostrally till en nivå ≈ 2 mm kaudalt om slutet av underkäken.
- Gör en tredje snitt som sträcker sig från rostralt slutet av den andra snitt över till ≈ 5 mm till vänster om mittlinjen. Dra tillbaka den resulterande hud fliken till vänster för att exponera de underliggande vävnaderna.
- Separera öronspott och submandibular spottkörtlar vid mittlinjen genom trubbig dissektion. Detta kommer att utsätta de underliggande muskulatur liggande luftstrupen.
- Rakt på sak separera höger och vänster sternohyoideus muskler för att exponera luftstrupen.
- Passera en ≈10 cm bit av 3-0 siden sutur under luftstrupen, var noga med att inte inkludera matstrupen.
- Identifiera plats för trakeotomi: precis kaudalt om struphuvudet det finns ett gap före den första trakeala ringen, är detta en idél plats för att utföra trakeotomi.
- Justera grenröret för att ge anestesigas till ventilatorn och slå på ventilatorn.
- Kontrollera om det finns läckor genom att ansluta spetsen av endotrakeal (ET) rör med ett finger. Garantera en luftvägstryck på ≈10 cmH2O.
- Med hjälp av en 20 gauge nål som en skalpell, incisionsfilm luftstrupen. Göra incisionen relativt bred, eftersom ET röret kommer att fylla en stor del av de trakeala lumen.
- Flytta snabbt, ta bort masken och försiktigt in ET röret i luftstrupen. Tvinga inte som vävnaderna är mycket bräcklig och bryta igenom väggen av luftstrupen kan resultera i en pneumothorax.
Obs: Omedelbart efter insättning bör utflykter bröstet blir uppenbara. - Säkra andningskretsen med tejp för att förhindra att ET röret från att dras ut.
- Knyta en enda överhandsknop på 3-0 sutur för att bilda en tätning runt ET röret.
Obs: Vid denna punkt bröstet excursions bör vara tydligt. Om inte är det vanligtvis placeringen av ET röret inuti luftstrupen som är problemet. Dra ET röret tillbaka och försöka flytta den, med fokus på orienteringen av luftstrupen som en guide.
- Framställning av jugularvenen Site
- Dra in vänster spottkörtlar rostralt-lateralt exponerar den yttre halsvenen.
- Tudelar den tunna muskel (sternomastoideus) som täcker venen med trubbig dissektion. Detta kommer att utsätta den yttre ytan av jugularvenen.
- Noggrant rensa bort eventuella större bitar av vävnad, även om försiktighet måste användas som väggarna i venen är mycket tunn. När denna uppgift är klar, täcka halsvenen med spottkörtlarna för att bevara den för kanyle senare.
- torakotomi; in i pleural utrymme utan att skada hjärta eller lungor
- Ta bort mycket av huden täcker bröstet som sträcker sig den högra kanten av denursprungliga hudsnitt ned till nivån av xifoid processen, sedan över mittlinjen till ≈ 1,5 cm till vänster om mittlinjen.
Obs: Var försiktig när du skär genom de yttre bröst fartyg, som kan vara en betydande källa för blödning. Etsande dessa fartyg innan du skär dem kommer i stor utsträckning att förhindra detta blödning. - Med hjälp av dissektion, dra tillbaka hudfliken sidled för att exponera den underliggande muskulatur.
- Isolera insättningen av pectoralis major på den högra sidan nära den kaudala aspekten av bröstbenet med hjälp av fartygs dilating pincett. Bränna och skära muskeln.
- Skär genom pectoralis major längs dess infästning i bröstbenet. Bränna de skurna kanter för att säkerställa hemostas.
- Nästa undergräva latissimus dorsi på samma sida, vilket är ett stort ark av muskler som täcker den laterala aspekten av musen. Bränna och skära denna muskel och sedan dra den kapade änden cranially. Detta kan kräva viss trubbigdissektion.
Obs: Revbenen är nu tydligt och hjärtat kan också vara synlig i vissa musstammar. I de flesta möss, kommer att komma in i bröstkorgen i den kaudala halvan av det fjärde interkostalrummet ge god tillgång till hjärtat. Den fjärde interkostalrummet är den näst mest caudal utrymme. - Att komma in i bröstet, använda ett par vassa pincett för att försiktigt dissekera ned genom interkostalmusklerna muskelskikt.
- När pleural utrymmet har öppnats, försiktigt in trubbiga spets fartygs dilatorer. Använda fartygs dilatorer för att ge skonsam uppåtriktad kraft på bröstkorgen, använder den trubbiga änden våren sax att noggrant incisionsfilm resten av interkostal muskler.
- Först skär i sidled, är noga med att inte skära lungan lob under. Nästa förlänga snittet medialt, men stanna 3-4 mm lateralt om mittlinjen för att undvika inre bröstartären.
Obs: De interna bröst fartyg löper parallellt med bröstbenetoch kan leda till betydande blodförlust om cut misstag. - Försiktigt bränna den skurna kanten av interkostal muskler, med en liten bomull tippas applikatorn att rulla vävnaden uppåt för att tillåta cautery kontakt med skära vävnad utan att komma i kontakt med lungorna eller hjärtat.
- Placera en saltlösning indränkt liten bomull tippas applikatorn genom snittet pekar mot mittlinjen. Ger en mild uppåt dragkraft för att dra bröstkorgen från de underliggande strukturerna. Börja etsande bröstväggen vid den mediala kanten av snittet och slutar ≈ 1 cm lateralt om mittlinjen på den vänstra sidan.
- Advance applikatorn till vänster så att det är kontinuerligt under diatermi spets.
- När vävnaden är ordentligt flamberats använda sax för att noggrant skära genom bröstbenet. Apex av hjärtat bör vara väl synlig på denna punkt.
- Med hjälp av dissektion, störa hjärtsäck och identifiera den kaudala hålvenen.
- Kolla efter tecken på blödning och bränna det nu. När alla blödningen har tagits upp, försiktigt bort alla draperingar, den diatermi jordplattan, och saltlösning indränkt gasbinda.
- Ta bort mycket av huden täcker bröstet som sträcker sig den högra kanten av denursprungliga hudsnitt ned till nivån av xifoid processen, sedan över mittlinjen till ≈ 1,5 cm till vänster om mittlinjen.
- Placera jugularvenen Catheter
- Anslut katetern i steg 1.6.2 till sprutan innehållande 10% albumin genom att försiktigt glida slangen över en 30 gauge nål.
- Börja infusion albumin genom katetern.
- Orientera katetern så att nålen ligger på halsvenen på egen hand, med nålen avfasning upp. Om det behövs, använd en nålhållare för att rotera nålen i slangen för att flytta avfasning till rätt orientering.
- När katetern är fullständigt spolas stoppa infusionen.
- Ta tag i katetern nålen med en tång. Med den andra handen, använda ett vävnads pincett för att dra in spottkörteln för att tillåta visualisering av jugularvenen. Applicera försiktigt dra till vävnaderna som omger den distala halsvein skapa spänningar på kärlväggen. Med hjälp av en grund infallsvinkel, försiktigt in nålen i venen. För fram nålspetsen 3-4 mm in i kärlet.
- Innan du släpper kateter nål säkra kateterslangen med en bit tejp, kommer detta att begränsa varje förflyttning av nålen en gång släppts.
- Frigöra nålen och försiktigt dra tillbaka sprutkolven för att bekräfta att katetern är i lumen av kärlet, genom att visualisera blod i linjen.
- När rätt placerad säkra katetern med kirurgiska lim för att fästa nålen till de underliggande spottkörtlar.
- Beräkna den totala volymen som ska infunderas. Om det inte var signifikant blodförlust en volym av 5 | j, l / g kroppsvikt kommer att vara tillräcklig. Om det fanns betydande blodförlust infusion 6-6,5 l / g kan krävas. Ställa in flödeshastigheten så att hela infusions kommer att vara fullständig inom 10-15 min.
- PV Kateter placering ivänstra kammaren
- Under den kirurgiska proceduren som beskrivits ovan, placera PV kateter i en spruta innehållande en saltlösning för att låta den komma i jämvikt.
- Strax före placeringen, flytta sprutan och katetern intill musen. Med kateterspetsen vid ungefär samma höjd som hjärtat, nollställa tryck behandlingen.
- Med hjälp av en saltlösning indränkt liten bomull tippas applikatorn, manövrera hjärtat att tillåta visualisering av spetsen.
- Med användning av en 25 gauge kanyl, göra ett sticksnitt så nära centrum av spetsen som möjligt.
- Efter avlägsnande av nålen, snabbt föra in katetern genom snittet. Det tar inte mycket kraft för att föra in katetern, så visa återhållsamhet när framflyttning av katetern i kammaren. Ibland är det nödvändigt att utföra en ytterligare stab incision. Om detta är nödvändigt, försök att utföra den efterföljande snitt nära den inledande läge för att minimera skador på hjärtat.
Intee: När katetern förs in i ventrikeln den slutliga placeringen är mycket viktigt. Den ventrikulära trycket spårning kommer att framgå av en låg diastoliskt tryck (<10 mm Hg) och en hög systoliskt tryck (> 80 mm Hg vid denna punkt). Helst ska katetern vara centrerad i ventrikeln med de yttre elektroderna precis inom ventrikeln. Finjusteringar kateter position kan utföras genom att observera data PV-loop, letar efter en lådformad spårning med ≈ 90 ° vinklar mellan sidorna.
3. Förfarande Detaljer
Obs! När katetern är på plats en kort stabiliseringsperiod (10-15 min) är nödvändig för att djuret att återhämta sig från en del av den akuta kirurgiska stress och för att ge tid för infusion av vätskor. Efter denna stabiliseringsperiod får protokoll som faktiskt kan börja.
- När PV kateter placeras och kirurgisk manipulation har upphört,skruva ner isofluran till ≈ 1% som behovet av en djup kirurgisk plan av anestesi minskas.
- Under denna period noga övervaka musen för att se till att en lämplig nivå av anestesi upprätthålls. Noggrant bedöma varje förflyttning; rörelse av andningsmuskulaturen antyder en nivå av hypoventilation och kan adresseras genom att öka andningshastigheten för ventilatorn. Förflyttning av lemmar eller ryckningar i whiskers finns tecken på att musen blir för ljus och kräver mer bedövningsmedel.
Obs: Det finns en mängd olika permutationer av behandlingar som kan användas i kombination med detta protokoll. Många av dessa behandlingar kräver infusion av läkemedel. Det är mycket viktigt att hantera de döda-tomrumsvolym effektivt. Lösnings omkopplare kan åstadkommas genom att skjuta kateterröret från nålen av en sprutpump till den andra. Att göra detta strax före slutet av den tidigare infusionen gör kateterröret att vara laddadmed nästa drogen. Det är nödvändigt att känna till volymen inuti kateterröret att bestämma tidpunkten för lösningen omkopplaren. Införandet av en liten luftbubbla i ledningen tillåter den exakta tidpunkten för infusionen omkopplaren som skall bestämmas; denna bubbla infunderas i den venösa cirkulationen tolereras väl.
- Under denna period noga övervaka musen för att se till att en lämplig nivå av anestesi upprätthålls. Noggrant bedöma varje förflyttning; rörelse av andningsmuskulaturen antyder en nivå av hypoventilation och kan adresseras genom att öka andningshastigheten för ventilatorn. Förflyttning av lemmar eller ryckningar i whiskers finns tecken på att musen blir för ljus och kräver mer bedövningsmedel.
- Ändra lastförhållanden hjärtat genom att sänka förspänning och ökande efterbelastning.
- Minska förspänning genom att blockera venöst återflöde till hjärtat. I denna beredning, visualisera och ockludera den kaudala hålvenen när den passerar från membranet till hjärtat. Utför denna ocklusion smidigt och relativt snabbt, som varar mer än 2-3 sek. Öka vänster kammare afterload tillfälligt genom att utföra en mild buken kompression varar 1-2 sek.
- Under dessa förändringar i belastning av hjärtat, pausa respirations att eliminera varje artefakt som införs genom ventilatorn.
- Kalibrera volymsignalen med hjälp av the konduktans katetrar. Dessa procedurer är inte nödvändigt med katetrar som använder tillträde teknik.
- Efter det experimentella protokollet injicera 5 - 10 | il av hyperton saltlösning (20% NaCl) för att beräkna den parallella konduktansen.
- Samla in blod genom att avlägsna katetern och dra blod från den vänstra ventrikeln in i en hepariniserad spruta. Placera blod i kuvetter med känd volym och använda katetern för att mäta ledningsförmågan.
- Använd kyvett ledningsförmåga åtgärder för att omvandla konduktanssignalen till volym och parallellkonduktansen är nödvändigt att definiera den absoluta volymen mäts av katetern.
- När protokollet är klar, avliva musen genom att ta bort hjärtat efter tran av hålvenen och aorta bilagor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Av konvention är volymen plottas på X-axeln och tryck på Y-axeln som i figur 1. Tryck volym slingor till följd av att rita tryck mot volym bör likna en rektangel, de vertikala kanterna representerar Isovolumetrisk förändringar i tryck (dvs, när både mitral och aortaklaffar är stängda). Den nedre horisontella representerar kammar fylla genom mitralisklaffen och den övre horisontella delen representerar kammar tömning genom aortaklaffen. I en frisk vild typ mus vänsterkammartryck av 90 - 110 mmHg förväntas med maximal dP / dt av 8000 - 12.000 mmHg / sekund (se tabell 1 för områden av normala hemodynamiska parametrar). De normala värden som anges i tabellen är baserade på värden som erhållits från vildtyp C57BL / 10 och C57BL / 6 möss; Det är dock viktigt att notera att det finns betydande skillnader mellan stammar 21. Förfarandet outlined här fokuserar på användningen av en apikal stab incision att positionera katetern inuti den vänstra ventrikeln. En annan populär metod är att föra in katetern bakåtsträvande genom aortaklaffen efter katetrar i den högra halspulsådern. Bakåtsträvande strategi som fördelen att den kan utföras med en sluten bröstkorg, vilket resulterar i upprätthållandet av normala inom bröstkorg tryck; Men djuren ofta ventilerade under denna procedur som begränsar denna fördel. De slutna gränser bröstet inflygningskontroll över katetern orientering inuti kammaren, medan den öppna bröst metod ger större förmåga att manövrera katetern i kammaren. Ett potentiellt problem med retrograd införing av katetern är potentialen för utflödes hinder på spåret. Diametern hos mus aorta varierar från 0,8 till 1,2 mm 22,23, varierar diametern hos kommersiellt tillgängliga tryck-volym katetrar från 0,33 (1,0 French) till 0,47 mm (1,4 French). De relativa storlekarna av dessa katetrar i samband med en stor och liten aorta visas i Figur 2. Den fraktion av utflöde blockeras av katetern passerar aorta kan bli en viktig fråga i mindre hjärtan och bör beaktas när de utför PV loop studier i små hjärtan. Det finns flera artefakter för mätning som kan komplicera analysen av PV data, en av de vanligaste är kateter inneslutning. Detta är uppenbart eftersom en stegring i tryck vid slutet av systole sannolikt till följd av direkt kompression av tryckgivaren med en papillär muskel eller annan dynamisk struktur inom kammaren (Figur 3). Detta är problematiskt, eftersom de flesta metoder för bestämning av systolisk funktion använder det maximala trycket. Det systoliska trycket och max derivat av tryck (dP / dt) från datamängder med kateter infångning måste undersökas noga och analysen kan behöva ändras för att erhålla meningsfulla uppgifter.
Tryck-volymslingor kan användas i en mängd olika protokoll för att bedöma hjärtfunktionen. Dessa inkluderar bedömningar av hjärtreserv via β-adrenerg stimulering 12,14,16,17. En stor variation av läkemedel kan infuseras för att bedöma eventuella akuta effekter på hjärtats fysiologi. Kontroll av luftvägarna kan också för administration av förändrade gasblandningar tillåter effekterna av hypoxi och / eller acidos på hjärtfunktionen tas upp direkt 24-27. Vidare analys av denna PV data kan också ge en detaljerad utvärdering av de passiva egenskaperna hos den vänstra kammaren, som kan ändras avsevärt i olika sjukdomstillstånd 12.
| Parameter | normala intervallet |
| systoliskt tryck | 90-110 mmHg |
| diastoliskt tryck | 4 - 10 mmHg |
| Maximala dP / dt | 8000 - 12000 mm Hg / sek |
| Minimum dP / dt | -8,500 - -12,000 MmHg / sek |
| tau | 5-6 sek |
| Hjärtfrekvens | 550-600 bpm |
| Cardiac Output | 10 - 13 ml / min |
| ejektionsfraktion | 40-60% |
Tabell 1. Normala värden för valda hemodynamiska parametrar.
Figur 1: Representativa Tryckvolym loopar från en vild typ C57BL / 10 Mus representativa uppgifter som samlades in med hjälp av de förfaranden som beskrivs i thi.s manuskript. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk bild av betydelsen av aortadiametern och Potential utflöde Track Hindrande Schematisk bild av de relativa storlekarna på musen aorta och kommersiellt tillgängliga tryckvolym katetrar för möss.. Dessa data understryker vikten av att betrakta utflöde hinder på spåret vid bedömningen mindre möss med användning av en retrograd kateterinförande tillvägagångssätt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns tre viktiga steg i detta förfarande: 1) placering av den endotrakeala tuben och lämplig ventilation, 2) placering av jugular IV-kateter, och 3) korrekt placering av PV kateter i den vänstra ventrikeln. Att bestämma den lämpliga andningsfrekvensen är en viktig del för att tillhandahålla andningsstöd. Medvetna möss upprätthålla allmänhet alveolär ventilation med snabba ytliga andetag. I allmänhet kommer ventilerade möss har mycket större tidalvolymer. Sålunda en långsammare andningsfrekvens krävs. Detta är viktigt eftersom för lite ventilation kommer att resultera i respiratorisk acidos och för mycket ventilation kommer att leda till respiratorisk alkalos, båda villkoren som kommer att ändra hjärtfunktion. Ett enkelt sätt att optimera andningsfrekvensen är att ta signaler från musens andningsansträngning och använda den lägsta andningsfrekvensen som eliminerar andningsansträngning från sövda musen.
En kritisk egenskap hos PV slingaanalys är att upprätthålla en tillräcklig nivå av anestesi utan signifikant sänkning av hjärtfunktionen. Det finns många anestesiregimer som med framgång kan tillämpas för att utföra PV slinganalys. Dessa kan delas in i två huvudkategorier: inhalant och injicerbara narkosmedel. Inom denna senare grupp finns en mängd olika blandningar som kan användas är emellertid många av dessa blandningar har potentiella cardio-depressiva effekter 19. Av de injicerbara cocktails, uretan baserade anestetika har de minst hjärt-depressiva effekter 4,19. Var noga med att begränsa exponeringen av personal till uretan eftersom det är ett misstänkt cancerframkallande 28. Isofluran och sevofluran är för närvarande tillgängliga inhalerade anestesimedel. Båda dessa medel har hjärt-depressiva effekter vid doser som är tillräckliga för kirurgisk manipulation. Viktigt kan inhalerade anestesimedel titreras till effekt. Detta möjliggör en högre smärtstillande dos under kirurgiska beredning och sedan en lägre sedative dos för mätning av hjärtfunktionen, vilket minimerar de cardio-depressiva effekter av dessa föreningar.
Om de hemodynamiska parametrarna är under normala nivåer, det finns flera vanliga orsaker. Först är låg blodvolym, sekundärt till blodförlust eller avdunstning. Denna komplikation är i allmänhet behandlas med vätsketillförsel som beskrivs i avsnitt 2.7. Som nämnts i avsnitt 1.5, är underhåll av kroppstemperaturen också mycket viktigt för bedömningen av hemodynamiska funktion. Således noggrann övervakning är nödvändig, kan ett digitalt återkopplingssystem vara användbart för att upprätthålla kroppstemperaturen under inspelning. Säkerställa att bedövningsmedlet har blivit korrekt reduceras under mätningen fasen är också en viktig aspekt av att förbättra hjärtprestanda.
Mäta lastoberoende parametrar av kontraktilitet är en av de främsta fördelarna med PV slinganalys. Realtids samtidig samling av tryck och volymume data ger den unika förmågan att mäta hemodynamiska förändringar som svar på varierande belastningsförhållanden på hjärtat. Denna analys gör det möjligt att kontraktila funktion i hjärtat att vara isolerad från de åtgärder av fartyg. Minskningar i förbelastning genom ocklusion av venöst återflöde har använts för att bedöma lastoberoende mått på kontraktilitet i många djurmodeller och människa 4,7,12-16,18,29-32. I smågnagare, resulterar detta förfarande i en krökt slut systoliskt tryck-volymförhållande 4,31,33. Denna sannolika resultat från en minskning av koronargenomblödning som dramatiskt accelererar minskningen av det systoliska funktion 34. I mus, 2 - slingor 3 sek milda buken komprimering resulterar i en högerförskjutning PV. Detta beror på både en ökad efterbelastning och förspänning 12. Långvarig ökningar i afterload resulterar i en ökning av sammandragningsfunktion, en fenomen som kallas Anrep effekten 35. emellertid denkorta varaktigheten av den abdominala komprimering som används i dessa studier indikerar att Anrep effekt inte påverkar hjärtfunktionen med denna procedur. I andra studier, var akut aorta sammandragning hos hundar visat sig öka kontraktila funktion, men detta var hypotesen att resultera från effekterna av minskad systemisk perfusion 36. Igen längd och svårighetsgrad av avbrott i aortaflödet till följd av buken kompression, som beskrivs här, är inte tillräcklig för att signifikant öka kontraktila funktion sekundärt till hypo-perfusion av system vävnader. Analys av PV slingor som erhållits genom buken kompression ansluter väl med PV slingor som erhållits strax efter caudal vena cava ocklusion. Tillsammans dessa observationer visar att den övergående buken kompression som beskrivs här inte nämnvärt ändrar kontraktilitet av hjärtat. Dessutom ger detta förfarande en viktig metod för att bedöma de passiva egenskaperna hos hjärtat över ett bredare sprangge slut-diastoliska volymer.
Analysen av lastoberoende åtgärder kräver valet av specifika PV loopar som ska ingå i analysen. Det är oerhört viktigt att detta sker konsekvent över en experimentell datamängd. Kontrollerad ventilation skapar en hemodynamiska artefakt genom andningsberoende förändringar av förspänning till den vänstra kammaren 37. För att undvika detta artefakt bör PV slingor samlas under korta perioder av apné (3-4 sek). Pauser i andning är särskilt användbara eftersom de ger bättre kontroll av experimentella förändringar i belastning på hjärtat. Det är viktigt att hålla dessa perioder av apné kort för att undvika hypoventilation. De procedurer som beskrivs i detta manuskript samla lastoberoende data från två skilda förfaranden, caudal vena cava ocklusion och buken kompression, som samlats vid ungefär samma tidpunkt. Slingorna isolerade från dessa två förfaranden bör kombineras och analyseras tillsamer eftersom de båda mäta funktionen av samma hjärta under, ungefär, samma villkor. Det finns flera principer att tänka på när man väljer slingor för analys. Undvik arytmiska beats. Takten efter en tappad slag är alltid onormalt stor och prematura slag är onormalt liten; båda kommer att störa analysen av data. Undvik slag där trycket minskar, men volymen är konstant. Dessa är vanliga i mus efter ocklusion av den kaudala hålvenen och kommer sannolikt sekundärt till dålig perfusion av myokardiet. Slutligen omfattar endast data från beats direkt efter ändringen vid lastning; beats under återhämtningsperioden sannolikt påverkas av förändringar i sympatiska nervsystemet aktivitet sekundärt till förändringar i det systemiska blodtrycket till följd av manipulering av lastförhållanden hjärtat.
PV slinganalys ger en extremt detaljerad bedömning av hjärtfunktionen. När den appliceras i samband med den genetiska flexbilitet och låga boendekostnader på musen det kan ge ett praktiskt sätt att bedöma hjärt fysiologi på molekylär nivå. Det finns flera viktiga begränsningar som måste beaktas när man beslutar att utföra dessa analyser. För det första är detta en invasiv procedur, i vilken möss sövda, vilket kan påverka viktiga aspekter av hjärtfunktionen. Vidare tolkning av PV loop uppgifter krävs en detaljerad förståelse av hjärt fysiologi både att identifiera mönster i data och potentiella störfaktorer. Dessutom, eftersom dessa analyser är terminalen kan de inte användas för att bedöma samma mus upprepade gånger. De ventrikulära volymerna som härrör från PV katetrar tenderar att vara mindre exakta än de anatomiska kammarvolymen tillhandahålls av MRI. Detta är inte förvånande eftersom PV katetrar modell ventrikeln som en cylinder, som är helt klart en uppskattning av den totala volymen av kammaren. Den verkliga styrka är förmågan att samla denna volym informationen på en hög frevens, vilket möjliggör slag-till-slag-analys av förändringar i ventrikulär volym.
Insamling och analys av PV data från mus kan vara en utmaning, men metoden ger information om hjärtfunktion som inte är tillgänglig genom någon annan metod. Detta förfarande ger den mest kompletta bilden av hjärtfunktionen tillgänglig och dess användning i musmodellen kommer att utgöra en viktig plattform för fastställandet av de molekylära grunderna för komplexa hjärtsjukdomstillstånd såsom hjärtsvikt och ärvda kardiomyopatier. Detta manuskript ger detaljerad information om de mest kritiska aspekterna av att utföra den här proceduren. Men liksom alla komplicerade förfaranden, kräver denna praxis att bygga de mikrokirurgiska färdigheter som är nödvändiga för att framgångsrikt utföra dessa experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författaren vill tacka för finansiering från NHLBI (K08 HL102066 och R01 HL114832).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont 5/45 (2) | Fine Science Tools | 11251-33 | |
| Vessel Dilating Forceps | Fine Science Tools | 18153-11 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor | Roboz Instruments | RS-5668 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Curved | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Straight | Fine Science Tools | 11040-08 | |
| Dissector Scissors- Heavy Blade | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| 3-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| TOPO Ventilator | Kent Scientific | TOPO | |
| Martin ME 102 Electrosurgical Unit | Harvard Apparatus | PY2 72-2484 | |
| Syringe Pump | Lucca Technologies | GenieTouch | |
| Stereomicroscope with boom stand | Nikon | SMZ-800N | |
| Thermocouple Thermometer | Cole Parmer | EW-91100-40 | |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Data Acquision and Analysis | DSI | Ponemah ACQ-16 |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), e29-e322 (2015).
- Katz, A. M. Influence of altered inotropy and lusitropy on ventricular pressure-volume loops. J Am Coll Cardiol. 11 (2), 438-445 (1988).
- Kass, D. A., Maughan, W. L. From "Emax" to pressure-volume relations: a broader view. Circulation. 77 (6), 1203-1212 (1988).
- Georgakopoulos, D., et al. In vivo murine left ventricular pressure-volume relations by miniaturized conductance micromanometry. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (4 Pt 2), H1416-H1422 (1998).
- Kass, D. A., Hare, J. M., Georgakopoulos, D. Murine cardiac function: a cautionary tail. Circ Res. 82 (4), 519-522 (1998).
- Feldman, M. D., et al. Validation of a mouse conductance system to determine LV volume: comparison to echocardiography and crystals. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279 (4), H1698-H1707 (2000).
- Baan, J., et al. Continuous measurement of left ventricular volume in animals and humans by conductance catheter. Circulation. 70 (5), 812-823 (1984).
- Salo, R. W., Wallner, T. G., Pederson, B. D. Measurement of ventricular volume by intracardiac impedance: theoretical and empirical approaches. IEEE Trans Biomed Eng. 33 (2), 189-195 (1986).
- Wei, C. L., et al. Volume catheter parallel conductance varies between end-systole and end-diastole. IEEE Trans Biomed Eng. 54 (8), 1480-1489 (2007).
- Kutty, S., et al. Validation of admittance computed left ventricular volumes against real-time three-dimensional echocardiography in the porcine heart. Exp Physiol. 98 (6), 1092-1101 (2013).
- Kottam, A., Dubois, J., McElligott, A., Henderson, K. K. Novel approach to admittance to volume conversion for ventricular volume measurement. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2514-2517 (2011).
- Meyers, T. A., Townsend, D. Early right ventricular fibrosis and reduction in biventricular cardiac reserve in the dystrophin-deficient mdx heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (4), H303-H315 (2015).
- Townsend, D., Yasuda, S., Li, S., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Emergent dilated cardiomyopathy caused by targeted repair of dystrophic skeletal muscle. Mol Ther. 16 (5), 832-835 (2008).
- Townsend, D., et al. Systemic administration of micro-dystrophin restores cardiac geometry and prevents dobutamine-induced cardiac pump failure. Mol Ther. 15 (6), 1086-1092 (2007).
- Strakova, J., et al. Dystrobrevin increases dystrophin's binding to the dystrophin-glycoprotein complex and provides protection during cardiac stress. J Mol Cell Cardiol. 76, 106-115 (2014).
- Yasuda, S., et al. Dystrophic heart failure blocked by membrane sealant poloxamer. Nature. 436 (7053), 1025-1029 (2005).
- Townsend, D., Daly, M., Chamberlain, J. S., Metzger, J. M. Age-dependent dystrophin loss and genetic reconstitution establish a molecular link between dystrophin and heart performance during aging. Mol Ther. 19 (10), 1821-1825 (2011).
- Townsend, D., Yasuda, S., McNally, E., Metzger, J. M. Distinct pathophysiological mechanisms of cardiomyopathy in hearts lacking dystrophin or the sarcoglycan complex. FASEB J. 25 (9), 3106-3114 (2011).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Zhang, B., Davis, J. P., Ziolo, M. T. Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect. J Vis Exp. (100), e52618-e52618 (2015).
- Barnabei, M. S., Palpant, N. J., Metzger, J. M. Influence of genetic background on ex vivo and in vivo cardiac function in several commonly used inbred mouse strains. Physiol Genomics. 42A (2), 103-113 (2010).
- Guo, X., Kono, Y., Mattrey, R., Kassab, G. S. Morphometry and strain distribution of the C57BL/6 mouse aorta. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283 (5), H1829-H1837 (2002).
- Weiss, R. M., Ohashi, M., Miller, J. D., Young, S. G., Heistad, D. D. Calcific aortic valve stenosis in old hypercholesterolemic mice. Circulation. 114 (19), 2065-2069 (2006).
- Palpant, N. J., Day, S. M., Herron, T. J., Converso, K. L., Metzger, J. M. Single histidine-substituted cardiac troponin I confers protection from age-related systolic and diastolic dysfunction. Cardiovasc Res. 80 (2), 209-218 (2008).
- Palpant, N. J., D'Alecy, L. G., Metzger, J. M. Single histidine button in cardiac troponin I sustains heart performance in response to severe hypercapnic respiratory acidosis in vivo. FASEB J. 23 (5), 1529-1540 (2009).
- Palpant, N. J., et al. Cardiac disease in mucopolysaccharidosis type I attributed to catecholaminergic and hemodynamic deficiencies. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H356-H365 (2011).
- Townsend, D. Diastolic dysfunction precedes hypoxia-induced mortality in dystrophic mice. Physiol Rep. 3 (8), e12513 (2015).
- Schmähl, D., Port, R., Wahrendorf, J. A dose-response study on urethane carcinogenesis in rats and mice. Int J Cancer. 19 (1), 77-80 (1977).
- Freeman, G. L., Little, W. C., O'Rourke, R. A. The effect of vasoactive agents on the left ventricular end-systolic pressure-volume relation in closed-chest dogs. Circulation. 74 (5), 1107-1113 (1986).
- Reyes, M., et al. Enhancement of contractility with sustained afterload in the intact murine heart: blunting of length-dependent activation. Circulation. 107 (23), 2962-2968 (2003).
- Segers, P., et al. Conductance catheter-based assessment of arterial input impedance, arterial function, and ventricular-vascular interaction in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (3), H1157-H1164 (2005).
- Townsend, D., et al. Chronic administration of membrane sealant prevents severe cardiac injury and ventricular dilatation in dystrophic dogs. J Clin Invest. 120 (4), 1140-1150 (2010).
- Sato, T., Shishido, T., et al. ESPVR of in situ rat left ventricle shows contractility-dependent curvilinearity. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 274 (5 Pt 2), H1429-H1434 (1998).
- Sunagawa, K., et al. Effects of coronary arterial pressure on left ventricular end-systolic pressure-volume relation of isolated canine heart. Circ Res. 50 (5), 727-734 (1982).
- Cingolani, H. E., Pérez, N. G., Cingolani, O. H., Ennis, I. L. The Anrep effect: 100 years later. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H175-H182 (2013).
- Baan, J., van der Velde, E. T. Sensitivity of left ventricular end-systolic pressure-volume relation to type of loading intervention in dogs. Circ Res. 62 (6), 1247-1258 (1988).
- Rankin, J. S., Olsen, C. O., et al. The effects of airway pressure on cardiac function in intact dogs. Circulation. 66 (1), 108-120 (1982).
