Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para a recolha de dados de pressão-volume do mouse.
Abstract
Compreender as causas e progressão da doença cardíaca apresenta um desafio significativo para a comunidade biomédica. A flexibilidade genética do mouse oferece um grande potencial para explorar a função cardíaca no nível molecular. O tamanho reduzido do rato apresenta alguns desafios no que diz respeito à realização de fenotipagem cardíaco detalhado. Miniaturização e outros avanços na tecnologia fizeram muitos métodos de avaliação cardíaca possível no mouse. Destes, a coleta simultânea de dados de pressão e volume fornece uma imagem detalhada da função cardíaca que não está disponível através de qualquer outra modalidade. Aqui, um procedimento detalhado para a recolha de dados de loop pressão-volume é descrito. Incluído é uma discussão sobre os princípios subjacentes às medições e as potenciais fontes de erro. manejo anestésico e abordagens cirúrgicas são discutidos em grande detalhe como ambos são cruciais para a obtenção de medida hemodinâmica de alta qualidades. Os princípios do desenvolvimento protocolo de hemodinâmica e aspectos relevantes da análise dos dados também são abordados.
Introduction
A doença cardiovascular continua a ser uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em todo o mundo 1. Doenças do coração apresentar desafios particularmente difíceis no desenvolvimento de novas terapias. Os avanços no campo da genética para proporcionar a possibilidade de identificar uma grande variedade de potenciais contribuintes genética para o desenvolvimento de doença cardíaca. A natureza integradora do sistema cardiovascular exige que esses alvos genéticos ser validados em modelos animais intactos. Os custos de flexibilidade e baixa habitação genéticas do rato tê-lo trazido para o primeiro plano para a avaliação do papel fisiológico de um determinado gene. O pequeno tamanho do mouse apresenta alguns desafios únicos para a avaliação da função cardíaca. Existem várias modalidades que podem fornecer informações sobre a função cardíaca, mas apenas a medição simultânea da pressão ventricular e o volume permite pressão-volume (PV) análise do lacete da função ventricular. PV laços tudoOW função cardíaca a ser analisada independente da sua conexão com a vasculatura; um factor importante na determinação do papel funcional de um elemento genético particular.
A avaliação de loops de pressão-volume tem sido utilizada tanto experimentalmente e clinicamente por muitos anos e extensa literatura existe sobre a análise desses conjuntos de dados 2,3. A adaptação da tecnologia de ciclo PV para o rato tem sido um importante avanço para a compreensão da fisiologia cardíaca murino 4-6. Cateter de tecnologias baseadas na ansa PV acoplar um transdutor de pressão e a utilização de condutância para estimar o volume do ventrículo. O volume ventricular é determinado por análise de alterações em um campo eléctrico gerado pelo cateter. Este método modelos do ventrículo como um cilindro, cuja altura é definida pela distância entre os eléctrodos no cateter e o raio é calculado a partir da condução de um campo eléctrico através do sangue emventrículo 7-9. O sinal de condutância medida pelo cateter tem duas componentes. A primeira é a condução através do sangue; esta varia com o volume do ventrículo e constitui o sinal primário usado para determinar o volume do ventrículo. O segundo componente resultante da condução através e ao longo da parede do ventrículo. Isto é chamado de condutância paralela e deve ser removido, a fim de determinar o volume do ventrículo absoluto. Há dois sistemas disponíveis comercialmente para a recolha de dados de pressão-volume no laboratório de pesquisa e o método utilizado para calcular e remover a condutância paralela é a principal diferença entre eles 6,10,11. cateteres condutância exigem a injecção de uma solução salina hipertónica para o cálculo da condutância paralelo. Esta injecção transitoriamente muda a condutividade do sangue no ventrículo, enquanto que a condutividade da parede mantém-se constante. A partir destes dados, é possível determinar acomponente do sinal de condutância que se origina a partir do sangue e o que vem a partir da parede do ventrículo. Esta abordagem assume que a condutância paralelo não varia durante o ciclo cardíaco. O método baseia-se na admissão mudanças de fase no campo eléctrico para avaliar a contribuição da parede ventricular para o sinal total de volume. Este método baseia-se uma variedade de constantes predeterminadas para a condutividade do sangue e do miocárdio para determinar o volume final, mas torna medidas contínuas de condutância paralela durante o ciclo cardíaco. Ambos estes sistemas fornecem boas estimativas do volume ventricular esquerdo e as diferenças entre eles não são susceptíveis de ser f isiologicamente significativa. O modelo cilíndrico do ventrículo e outras premissas tornar estas abordagens baseadas em cateter não tão precisos quanto outras modalidades, mas esses dados são fornecidos numa base de batimento a batimento que é essencial para a avaliação das medidas independentes de carga da função cardíaca.
O procedimento aqui descrito é utilizado no meu laboratório e apresentou dados de um grande número de estudos que examinam os mecanismos patofisiológicos básicos de distrófica cardiomiopatia 12-18. O procedimento descrito abaixo é um dos dois que pode ser usado para obter dados de espira PV. Embora muitos dos princípios são aplicáveis para qualquer abordagem, este protocolo vai se concentrar em uma abordagem apical de tórax aberto; um protocolo de tórax fechado foi detalhado em outros lugares 19,20. Enquanto o processo será descrito em pormenor, os princípios gerais são importantes para expor o coração com danos mínimos para quer o coração ou os pulmões. Durante todo o protocolo é importante lembrar que este é um procedimento não-sobrevivência e que tendo uma boa exposição do coração é criticamente importante para a colocação correcta do cateter.
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Protocol
Antes de realizar qualquer um dos procedimentos descritos neste protocolo, obter a aprovação pelo comité de cuidados com os animais e uso institucional local.
1. Configurando o Rig Experimental
Nota: O procedimento é realizado em animais anestesiados e a qualidade dos dados é proporcional à qualidade do suporte oferecido anestésico para o animal. Este primeiro detalhe secção vontade o equipamento e os procedimentos necessários para fornecer a anestesia para o mouse durante a execução deste protocolo.
- Selecione um protocolo anestésico. anestésicos inaláveis têm muitas propriedades benéficas para a realização de análise de ciclo de PV, embora alguns protocolos injectáveis têm sido utilizados como bem. Veja a discussão para mais informações sobre a escolha de um regime anestésico.
- Fixar tanques de oxigénio comprimido à mesa cirúrgica ou parede perto do local da cirurgia.
- Se usando anestésicos para inalação, usar um vaporizador para segurara dosagem adequada. Calibrar vaporizadores anualmente para garantir que eles estão fornecendo a dose apropriada de gás anestésico. Conectar vaporizadores para um medidor de caudal que permite o controlo da taxa a que o gás entra no circuito de anestésico. Fixado em 0,5-1,0 L / min.
- Utilizar um tubo de distribuição para permitir o fluxo dirigido de gás anestésico para 1) a câmara de indução, 2) uma máscara, e 3) o ventilador. Scavenging gás anestésico é extremamente importante e deve ser realizada por um sistema ativo que ou aberturas em uma coifa (ou outras infra-estruturas de construção similar) ou através de uma vasilha projetado para remover gases anestésicos.
Nota: Verifique com as autoridades de saúde ocupacional locais para garantir a conformidade com todas as regulamentações locais. - Manter a temperatura corporal central, utilizando almofadas de aquecimento e / ou lâmpadas de aquecimento. monitorar continuamente a temperatura do corpo com um termômetro retal. Isto irá permitir a pró-activas aumenta ou diminui em aquecimento para assegurar uma temperatura corporal fisiológica (ͭ6; 37 ° C) durante a coleta dos dados hemodinâmicos.
- Fornecer suporte de fluido para neutralizar a perda de sangue e perda de volume insensível.
- Prepara-se uma solução a 10% de albumina de 0,9% de NaCl, tendo de 1 ml de 25% de albumina e adicionando 1,5 ml de NaCl a 0,9% em uma seringa.
- Prepare um volume residual de cateter intravascular baixa.
- Use um alicate para esmagar o hub de plástico de uma agulha de calibre 30 0,5 polegadas. Usando porta-agulhas, segure a agulha e retire o hub. Raspe o adesivo remanescente da agulha, por uma pinça hemostática. Inserir a extremidade cega da agulha em um comprimento de tubagem micrométrico. Use inferior a 20 polegadas de comprimento para o tubo.
- Usar uma bomba de seringa para permitir que volumes precisos para ser entregue.
- Garantir a ventilação adequada para a recolha de dados fotovoltaicos de alta qualidade. Há uma variedade de ventiladores de mouse disponíveis para compra. ventiladores controlados por pressão proporcionam o ambiente fechado requerido para um inalantegases nesthetic e proporcionar um melhor controle da ventilação durante o procedimento.
- Certifique-se que a pressão inspiratória estão limitados a <15 cm H 2 O para evitar o barotrauma. Definir o ventilador para fornecer o impulso inspiratório durante 35% do ciclo respiratório. O uso de pressão expiratória final positiva (PEEP) a um nível de 4-5 cm H 2 O irá melhorar significativamente a ventilação do rato, através da prevenção atelectasia do pulmão e apoiar o intercâmbio de gás.
- Limitar o espaço distal morto para o Y-junção no circuito ventilatório. Isto é crítico porque o volume corrente do rato é muito pequeno e qualquer espaço morto subtrai a partir da entrega do ar inspirado fresco.
- Criar um tamanho de tubo endotraqueal do mouse (ET), cortando a ponta fora de um calibre 20 habitação cateter intravascular. Isto fornece um ponto cônico para facilitar a inserção. Coloque a extremidade cortada no Y-conjunta do circuito de anestésico.
- Use tubo flexível no trato respiratórioo circuito. Qualquer memória estrutural na tubulação irá criar forças externas que têm o potencial para puxar o tubo endotraqueal para fora das vias aéreas do mouse.
- Deixe o mouse determinar a taxa respiratória utilizando a menor taxa que suprime o impulso respiratório endógeno. Comece a uma taxa respiratória relativamente lenta de cerca de 60 respirações por minuto.
Nota: Com a ventilação adequada o rato deve fazer muito pouco esforço para respirar. No entanto, se a ventilação for inadequada, o acúmulo de CO 2 no sangue iniciará esforço respiratório pelo mouse. Se isso for observado, o aumento da taxa respiratória é uma maneira simples e direta para aumentar a ventilação alveolar. Muitas vezes, é necessário para aumentar a taxa respiratória em resposta à elevação da carga de trabalho cardíaco associado com a estimulação de receptor beta-adrenérgico. - Uma vez que o circuito respiratório é preparado, o sistema de pressão de ensaio, ligando a ponta do tubo endotraqueal (ET)com um dedo. Assegurar uma pressão nas vias aéreas de ≈10 cmH 2 O. Este ensaio deve ser realizado antes de cada procedimento.
2. Abordagem Cirúrgica
- Use pequenas pinça e tesouras e outros equipamentos a partir da Tabela 1. Todos os instrumentos são muito pequenas para permitir uma fácil utilização no campo cirúrgico ampliada. Use uma lupa cirúrgica para proporcionar a ampliação adequada para vários aspectos do procedimento cirúrgico.
- Use um cautério para maximizar a hemostasia durante o procedimento.
Nota: Há um par de grandes classes de cautério. Termocautério aquece um elemento de metal fino que irá cortar através do tecido muscular e parar o sangramento. Estes sistemas são inicialmente relativamente barato; no entanto, é importante notar que as pontas de fio são tanto frágil e relativamente caro. sistemas eletrocautério são mais caros para comprar inicialmente, mas as dicas são muito resistentes e não precisam ser substituird. - Indução e preparação cirúrgica
- Obter o peso do corpo do rato.
- Posicione o mouse em uma câmara de indução que é preenchido com 5% de isoflurano.
Nota: O rato não pode sobreviver mais do que alguns minutos neste ambiente. Apenas 45 - 60 seg são necessários para o rato a perder suas reflexo de endireitamento (esforços para virar quando colocado em sua parte traseira ou lateral). - Uma vez que o reflexo de endireitamento é perdida, reduzir a concentração de isoflurano a 2% e abrir o gás anestésico para a máscara.
- Rapidamente transferir o mouse para a mesa de operação e colocá-lo em decúbito dorsal com o nariz dentro da máscara.
- Se utilizando o eletrocautério, use soro fisiológico gaze embebida para acoplar electricamente o mouse para o bloco de aterramento do sistema de eletrocautério.
- Fixe os membros com fita cirúrgica. Esta fita proporciona propriedades adesivas mesmo quando molhado.
- Inserir uma sonda térmica rectal para órgão de monitoramento do núcleotemperatura. Prenda com fita adesiva.
- Aplique um creme depilatório para o pescoço e peito do mouse. Espere 2-3 min para o depilatório para o trabalho, e em seguida, remover a pele dessas áreas usando um aplicador com ponta de algodão e / ou toalhetes de laboratório.
Nota: Draping do campo cirúrgico não é necessário, como este é um procedimento não-sobrevivência, mas pode ser desejado limitar a exposição do cirurgião para a ligação à terra cauterização, se usado. - Uma vez que o rato está preparado para a cirurgia, avaliar o plano cirúrgico do mouse através da realização de um dedo do pé-pitada. Uma vez que a garantia de um plano anestésico adequado o mouse está pronto para a primeira incisão.
- Obter o controle das vias aéreas por intubação oral ou traqueotomia. Traqueotomia é uma abordagem conveniente, que é relativamente simples de realizar.
Nota: Ao longo desta descrição processual todas as direções e orientações serão relativos ao cirurgião.- Faça uma incisão na level do entalhe esternal que se estende desde ≈ 5 mm direita da linha média para ≈ 5 mm à esquerda da linha média.
- Adicione uma segunda incisão que se estende ao longo do bordo direito da primeira incisão, que se estende a um nível rostral ≈ 2 milímetros caudal ao final da mandíbula.
- Adicione uma terceira incisão que se estende a partir da extremidade rostral da segunda incisão sobre a Å 5 milímetros à esquerda da linha média. Retrair o retalho de pele resultante à esquerda para expor os tecidos subjacentes.
- Separe as glândulas salivares parótidas e submandibulares na linha média por dissecção romba. Isto irá expor a musculatura subjacentes que recobrem a traqueia.
- Sem rodeios separar o certo e músculos sternohyoideus esquerda para expor a traqueia.
- Passe um pedaço ≈10 cm de 3-0 sutura de seda sob a traqueia, tomando cuidado para não incluir o esôfago.
- Identificar a localização para a traqueotomia: basta caudal da laringe há uma lacuna antes do primeiro anel traqueal, esta é uma idéial localização para efectuar a traqueotomia.
- Ajuste o colector para fornecer gás anestésico para o ventilador e ligue o ventilador.
- Verifique se há vazamentos, ligando a ponta do tubo endotraqueal (ET) com um dedo. Assegurar uma pressão nas vias aéreas de ≈10 cmH2O.
- Usando uma agulha de calibre 20 como um bisturi, inciso traquéia. Fazer a incisão relativamente grande, tal como o tubo de ET vai encher a maior parte da luz traqueal.
- Movendo-se rapidamente, remova a máscara e cuidadosamente inserir o tubo ET na traquéia. Não forçá-lo como os tecidos são muito frágeis e romper a parede da traqueia pode resultar em um pneumotórax.
Nota: Imediatamente após a inserção, excursões no peito deve tornar-se evidente. - Fixe o circuito ventilatório com fita para evitar que o tubo ET de ser puxado para fora.
- Dê um nó simples overhand no 3-0 sutura para formar uma vedação em torno do tubo ET.
Nota: Neste excursi peito pontoons devem ser claramente evidente. Se não é geralmente o posicionamento do tubo endotraqueal na traqueia que é o problema. Puxe o tubo de ET para trás e tentar reposicioná-lo, com foco na orientação da traquéia como um guia.
- Preparo da veia jugular do Site
- Retrair as glândulas salivares esquerda rostral-lateralmente, expondo a veia jugular externa.
- Bissetriz do músculo fino (sternomastoideus) que cobre a veia com dissecção romba. Isto irá expor a superfície exterior da veia jugular.
- Cuidadosamente limpar fora qualquer grandes pedaços de tecido, embora o cuidado deve ser usado como as paredes da veia são muito fina. Uma vez que esta tarefa estiver concluída, cobrir a veia jugular com as glândulas salivares a preservá-lo para canulação mais tarde.
- toracotomia; entrando no espaço pleural, sem danificar o coração ou pulmões
- Remover a maior parte da pele que cobre o peito que se estende da extremidade direita doincisão na pele voltada para baixo ao nível do apêndice xifóide, em seguida, do outro lado da linha média para ≈ 1,5 cm à esquerda da linha média.
Nota: É preciso ter cuidado ao cortar através dos vasos mamárias externas, que podem ser uma fonte significativa de hemorragia. Cauterização estes vasos antes de cortar-lhes impedirá em grande parte esse sangramento. - Usando dissecção romba, retraia o retalho de pele lateralmente para expor a musculatura subjacente.
- Isolar a inserção do músculo peitoral maior, no lado direito, perto do aspecto caudal do esterno utilizando vasos dilatar fórceps. Cauterizar e cortar o músculo.
- Cortar o músculo peitoral maior ao longo do seu apego ao esterno. Cauterizar as bordas do corte para assegurar a hemostasia.
- Próximo minar o grande dorsal do mesmo lado, que é uma grande folha de músculo que cobre a face lateral do mouse. Cauterizar e cortar este músculo e, em seguida, retirar a extremidade cortada no sentido cranial. Isso pode exigir alguns contundentedissecção.
Nota: As costelas são agora claramente evidente e o coração pode também ser visível em algumas linhagens de camundongos. Na maioria dos ratos, entrando no peito na metade caudal do quarto espaço intercostal irá fornecer um bom acesso ao coração. O quarto espaço intercostal é o segundo espaço mais caudal. - Para entrar no peito, usar um par de fórceps afiadas para dissecar cuidadosamente para baixo através das camadas de músculo intercostal.
- Uma vez que o espaço pleural foi aberto, insira cuidadosamente as vasodiltadores ponta romba. Usando os vasodiltadores para fornecer força para cima suave na parede torácica, use os sem corte tesoura primavera fim de incisão cuidadosamente o restante dos músculos intercostais.
- Primeiro corte lateralmente, tomando cuidado para não cortar o lobo pulmonar por baixo. Próximo estender a incisão medial, mas fique 3-4 mm lateral da linha média para evitar a artéria mamária interna.
Nota: Os vasos mamários internos paralelos ao esternoe pode resultar em perda significativa de sangue se acidentalmente cortado. - Cuidadosamente cauterizar a borda do corte dos músculos intercostais, usando um aplicador com ponta de algodão pequeno para rolar o tecido para cima, para permitir o contacto com o tecido cautério corte sem entrar em contacto com os pulmões ou o coração.
- Coloque uma solução salina embebida pequena algodão aplicador derrubado através da incisão apontando na direção da linha média. Proporcionar uma tração para cima suave para puxar a parede torácica longe das estruturas subjacentes. Comece a cauterização da parede torácica na borda medial da incisão e terminando ≈ 1 cm lateral da linha média do lado esquerdo.
- Avançar o aplicador para a esquerda de modo que é continuamente sob a ponta cautério.
- Uma vez que o tecido é completamente cauterizada, use uma tesoura para cortar cuidadosamente através do esterno. O ápice do coração deve ser claramente visível neste momento.
- Utilizando uma dissecção romba, perturbar o pericárdio e identificar a veia cava caudal.
- Verifique se há evidências de qualquer hemorragia e cauterizar-lo agora. Uma vez que todo o sangramento foi abordada, remova cuidadosamente qualquer drapeados, a almofada de cautério aterramento, ea solução salina gaze embebida.
- Remover a maior parte da pele que cobre o peito que se estende da extremidade direita doincisão na pele voltada para baixo ao nível do apêndice xifóide, em seguida, do outro lado da linha média para ≈ 1,5 cm à esquerda da linha média.
- Colocar o cateter Jugular Vein
- Ligue o cateter feita no passo 1.6.2 para a seringa contendo 10% de albumina por escorregamento cuidadosamente o tubo através de uma agulha de calibre 30.
- Comece a infusão de albumina através do cateter.
- Orientar o cateter de tal modo que a agulha encontra-se em cima da veia jugular por si próprio, com a agulha de bisel para cima. Se necessário, usar um suporte de agulha para rodar a agulha na tubagem para movimentar o bisel com a orientação correcta.
- Quando o cateter é completamente corado parar a infusão.
- Segure a agulha do cateter com uma pinça. Com a outra mão, utilizar uma pinça para retrair a glândula salivar para permitir a visualização da veia jugular. Aplicar tracção suave para os tecidos circundantes da jugular distaiveia criar tensão na parede do vaso. Usando um ângulo raso de abordagem, cuidadosamente inserir a agulha na veia. Avançar a ponta da agulha de 3-4 mm dentro do vaso.
- Antes de libertar a agulha de cateter de fixar o tubo do cateter com um pedaço de fita adesiva, esta irá limitar qualquer movimento da agulha, uma vez libertada.
- Libertar a agulha e puxar cuidadosamente para trás o êmbolo da seringa para confirmar que o cateter está no lúmen do vaso, através da visualização de sangue na linha.
- Uma vez posicionado prender adequadamente o cateter com cola cirúrgica para fixar a agulha para as glândulas salivares subjacentes.
- Calcular o volume total a ser infundido. Se não houve perda significativa de sangue de um volume de 5 mL / g de peso corporal serão suficientes. Se houve perda significativa de sangue infundindo 6-6,5 ul / g pode ser necessária. Definir a taxa de fluxo de tal forma que toda a infusão estará completa em 10 - 15 min.
- PV cateter colocação noVentrículo esquerdo
- Durante o procedimento cirúrgico descrito acima, colocar o cateter de PV em uma seringa que contém uma solução salina para permitir que se equilibre.
- Pouco antes da colocação, mova a seringa e cateter ao lado do mouse. Com a ponta do cateter em aproximadamente a mesma altura que o coração, zero, a leitura da pressão.
- Usando uma solução salina embebida pequena algodão aplicador derrubado, manobrar o coração para permitir a visualização do ápice.
- Utilizando uma agulha de calibre 25, fazer uma incisão o mais próximo possível do centro do vértice quanto possível.
- Após a remoção da agulha, rapidamente inserir o cateter através da incisão. Não é preciso muita força para inserir o cateter, por isso, mostrar moderação ao avançar o cateter no ventrículo. Ocasionalmente, é necessário efectuar uma incisão adicional. Se isto é necessário, tenta efectuar a incisão posterior perto do local inicial para minimizar os danos no coração.
Nãoe: Depois que o cateter é avançado para o ventrículo a colocação final é extremamente importante. O traçado da pressão do ventrículo irá ser evidente por uma baixa pressão diastólica (<10 mmHg) e a uma pressão sistólica elevada (> 80 mmHg, nesse momento). Idealmente, o cateter será centrada no ventrículo com os eléctrodos exteriores apenas dentro do ventrículo. ajustes na posição do cateter pode ser realizada pela observação dos dados PV-ansa, procurando um traçado em forma de caixa com Å ângulos de 90 ° entre os lados.
3. Detalhes processuais
Nota: Uma vez que o cateter está no lugar um período de estabilização breve (10 - 15 min) é necessário para permitir que o animal possa recuperar de algum do stress agudo cirúrgico e para dar tempo para a infusão de fluidos. Após este período de estabilização o protocolo real pode começar.
- Uma vez que o cateter PV é colocado e manipulação cirúrgica cessou,abaixe o isoflurano para ≈ 1%, como a necessidade de um plano cirúrgico de profundidade da anestesia é menor.
- Durante este período, acompanhar atentamente o mouse para assegurar que um nível adequado de anestesia é mantida. avaliar cuidadosamente qualquer movimento; o movimento dos músculos respiratórios sugere um nível de hipoventilação e pode ser dirigida através do aumento da taxa respiratória do ventilador. Movimento de membros ou espasmos de bigodes são sinais de que o rato está ficando muito leve e exige mais anestésico.
Nota: Há uma grande variedade de permutações de tratamentos que podem ser utilizados em combinação com este protocolo. Muitos destes tratamentos vai exigir a infusão de drogas. É essencial para controlar o volume de espaço morto de forma eficaz. comutadores solução pode ser conseguida fazendo deslizar o tubo do cateter a partir da agulha de uma bomba de seringa para a outra. Fazendo isto pouco antes do final da infusão anteriormente, permite que o tubo do cateter para ser carregadocom a próxima droga. É necessário conhecer o volume dentro do tubo do cateter para determinar o tempo do interruptor solução. A introdução de uma pequena bolha de ar na linha permite que o momento preciso da chave de infusão a ser determinado; esta bolha infundida na circulação venosa é bem tolerada.
- Durante este período, acompanhar atentamente o mouse para assegurar que um nível adequado de anestesia é mantida. avaliar cuidadosamente qualquer movimento; o movimento dos músculos respiratórios sugere um nível de hipoventilação e pode ser dirigida através do aumento da taxa respiratória do ventilador. Movimento de membros ou espasmos de bigodes são sinais de que o rato está ficando muito leve e exige mais anestésico.
- Alterar as condições de carga do coração, através da redução da pré-carga e aumentando a pós-carga.
- Reduzir a pré-carga por bloqueio do retorno venoso para o coração. Nesta preparação, visualizar e ocluir a veia cava caudal que passa a partir do diafragma para o coração. Executar esta oclusão sem problemas e de forma relativamente rápida, durando não mais do que 2-3 seg. Aumentar a pós-carga ventricular esquerda transitoriamente através da realização de uma suave compressão abdominal duradoura 1-2 seg.
- Durante essas mudanças na carga do coração, respirações pausa para eliminar qualquer artefacto introduzido pelo ventilador.
- Calibrar o sinal de volume com the cateteres de condutância. Estes procedimentos não são necessários com cateteres que utilizam a tecnologia de admissão.
- Após o protocolo experimental injectar 5 - 10 ul de solução salina hipertónica (NaCI 20%) para calcular a condutância paralelo.
- Recolha de sangue através da remoção do cateter e a retirada de sangue do ventrículo esquerdo para uma seringa heparinizada. Coloque este sangue em cuvetes de volume conhecido e usar cateter para medir a condutância.
- Use as medidas de condutância cuvete para converter o sinal de condutância para o volume e a condutância paralelo é necessário definir o volume absoluto medido pelo cateter.
- Uma vez que o protocolo é completa, eutanásia do rato através da remoção do coração após a transecção da veia cava e aorta anexos.
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Representative Results
Por convenção, o volume é representada graficamente no eixo X e a pressão sobre o eixo dos Y como na Figura 1. As malhas de pressão-volume decorrentes traçando pressão contra o volume deve assemelhar a um rectângulo, os bordos verticais que representam as alterações isovolumétrica de pressão (isto é, quando ambos valvas mitral e aórtica estão fechados). A horizontal inferior representa enchimento ventricular através da válvula mitral e a parte horizontal superior representa esvaziamento ventricular através da válvula aórtica. Em pressões ventriculares saudável tipo selvagem esquerdo do mouse de 90 - 110 mmHg são esperados com máxima dP / dt de 8.000 - 12.000 mmHg / seg (ver Tabela 1 para gamas de parâmetros hemodinâmicos normais). Os intervalos normais previstas na tabela baseiam-se em valores obtidos de tipo selvagem C57BL / 10 e C57BL / 6; no entanto, é importante notar que existem diferenças significativas entre as linhagens 21. O procedimento outlined aqui centra-se no uso de uma incisão apical para posicionar o cateter no interior do ventrículo esquerdo. Outra abordagem popular é inserir o cateter retrógrado através da válvula aórtica após a inserção do cateter na artéria carótida direita. A abordagem retrógrada como a vantagem na medida em que pode ser realizada com uma caixa fechada, o que resultou na manutenção da pressão intra-torácicas normais; No entanto, os animais são frequentemente ventilado durante este procedimento que limita esta vantagem. Os limites de aproximação tórax fechado o controlo sobre a orientação do cateter no interior do ventrículo, enquanto que a abordagem de tórax aberto proporciona uma maior capacidade de manobra do cateter no interior do ventrículo. Um problema potencial com inserção retrógrada do cateter é o potencial de obstrução via de saída. O diâmetro da aorta do rato varia de 0,8 a 1,2 mm 22,23, o diâmetro dos cateteres de pressão-volume disponíveis comercialmente varia de 0,33 (1,0 French) a 0,47 mm (1,4 FreNCH). As dimensões relativas destes cateteres no contexto de uma grande e pequena aorta estão representados na Figura 2. A fracção da via de saída bloqueado pelo cateter de atravessar a aorta pode tornar-se um problema significativo em corações menores e deve ser tomado em conta quando se realiza estudos de loop PV em pequenos corações. Existem vários artefactos de medida que podem complicar a análise de dados de PV, uma das mais comuns é o aprisionamento do cateter. Isto é evidente como um aumento na pressão no final da sístole provavelmente resultante da compressão directa do transdutor de pressão por um músculo papilar ou outra estrutura dinâmica dentro do ventrículo (Figura 3). Isso é problemático, porque a maioria dos métodos para a função sistólica determinar usar a pressão máxima. A pressão sistólica e derivado máximo de pressão (dP / dt) a partir de conjuntos de dados com o aprisionamento do cateter devem ser examinados de perto e a análise pode precisar de ser alterada para se obter dados significativos.
loops de pressão-volume pode ser usado numa ampla variedade de protocolos para avaliação da função cardíaca. Estes incluem avaliações da reserva cardíaca via 12,14,16,17 estimulação β-adrenérgico. Uma grande variedade de medicamentos pode ser infundido para avaliar quaisquer efeitos agudos sobre a fisiologia cardíaca. O controlo da via aérea também permite a administração de misturas de gases, permitindo que os efeitos alterados de hipoxia e / ou acidose sobre a função cardíaca para ser dirigida directamente 24-27. Além disso, a análise desses dados PV também pode fornecer uma avaliação detalhada das propriedades passivas do ventrículo esquerdo, que podem ser alterados de forma significativa em vários estados de doença 12.
| Parâmetro | Intervalo normal |
| Pressão sistólica | 90-110 mmHg |
| A pressão diastólica | 4 - 10 mmHg |
| DP / dt máxima | 8000 - 12000 mm Hg / seg |
| Mínimo dP / dt | - -12.000 -8,500 Mm Hg / seg |
| Tau | 5-6 seg |
| Frequência cardíaca | 550-600 bpm |
| Débito cardíaco | 10 - 13 ml / min |
| Fração de ejeção | 40 - 60% |
Tabela 1. Os valores normais para Selected hemodinâmica parâmetros.
Figura 1: Loops Pressão-volume mais representativo de um data Representante tipo selvagem C57BL / 10 Rato que foram obtidos utilizando os procedimentos descritos no thi.s manuscrito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Representação esquemática da importância do diâmetro da aorta e Potencial obstrução do fluxo da trilha Desenho esquemático dos tamanhos relativos da aorta do rato e os cateteres pressão-volume comercialmente disponíveis para camundongos.. Estes dados ressaltam a importância de se considerar obstruções da via de escoamento ao avaliar ratos menores usando uma abordagem de inserção do cateter retrógrada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem três passos críticos neste processo: 1) a colocação do tubo endotraqueal e ventilação adequado, 2) a colocação do cateter IV jugular, e 3) a colocação correcta do cateter PV no ventrículo esquerdo. Determinação da taxa respiratória apropriada é uma parte importante do fornecimento de suporte ventilatório. ratinhos conscientes geralmente manter a ventilação alveolar com respirações superficiais rápidas. Em geral, os ratinhos ventilados terá volumes correntes muito maiores. Assim, é necessária uma taxa mais lenta respiratória. Isto é importante porque demasiado pouca ventilação irá resultar em acidose respiratória e muito ventilação levará a alcalose respiratória, ambas as condições que irão alterar a função cardíaca. Uma maneira simples de otimizar a taxa respiratória é levar sugestões de esforço respiratório do mouse e usar a menor taxa respiratória, que elimina o esforço respiratório do rato anestesiado.
Uma característica crítica do ciclo PVanálise é a de manter um nível suficiente de anestesia sem depressão significativa da função cardíaca. Existem muitos regimes de anestésico que pode ser aplicado com sucesso para realizar a análise de ciclo de PV. Estes podem ser divididos em duas grandes categorias: os anestésicos para inalação e injectáveis. Dentro deste último grupo são uma variedade de misturas que podem ser usados, no entanto, muitas dessas misturas têm potenciais efeitos cardio-depressiva 19. Dos cocktails injectáveis, anestésicos uretano com base têm os menores efeitos cardio-depressivos 4,19. Tome cuidado para limitar a exposição de pessoal para uretano, pois é um cancerígeno 28. Isoflurano e sevoflurano são os agentes anestésicos inalatórios atualmente disponíveis. Ambos estes agentes possuem efeitos cardio-depressivas em doses suficientes para a manipulação cirúrgica. Importante, agentes anestésicos inalatórios pode ser titulada para o efeito. Isso permite que uma dose analgésica mais alta durante a preparação cirúrgica e, em seguida, uma sedat inferiordose de ive para a medição da função cardíaca, minimizando assim os efeitos cardio-depressivo destes compostos.
Se os parâmetros hemodinâmicos estão abaixo dos níveis normais, existem várias causas comuns. Primeiro é baixo volume de sangue, secundária à perda de sangue ou evaporação. Esta complicação é geralmente abordada com a administração de fluidos descrito na secção 2.7. Como observado na secção 1.5, a manutenção da temperatura do corpo do núcleo é também muito importante para a avaliação da função hemodinâmica. Assim, a monitorização cuidadosa é essencial, um sistema digital de retorno pode ser útil para manter a temperatura corporal central durante a gravação. Assegurar que o anestésico foi adequadamente reduzida durante a fase de medição, também é um aspecto importante de melhorar o desempenho cardíaco.
Medindo parâmetros independentes de carga da contratilidade é uma das principais vantagens da análise do lacete PV. A recolha simultânea em tempo real de pressão e volume de dados fornece a capacidade única de medir as alterações hemodinâmicas em resposta a diferentes condições de carga sobre o coração. Esta análise permite a função contráctil do coração a ser isolados a partir das acções dos vasos. Reduções na pré-carga através de oclusão do retorno venoso têm sido utilizados para avaliar as medidas independentes de carga de contratilidade em muitos modelos animais e no homem 4,7,12-16,18,29-32. Em pequenos roedores, este procedimento resulta em uma sistólico final relação pressão-volume curvilíneo 4,31,33. Isso provavelmente é reflexo da redução na perfusão coronária que acelera drasticamente o declínio da função sistólica 34. No ratinho, 2-3 seg resultados de compressão abdominal suave num desvio para a direita da PV laços. Isto resulta tanto do aumento da pós-carga e pré-carga 12. Aumentos no resultado pós-carga prolongada em um aumento na função contrátil, um fenômeno chamado de efeito Anrep 35. No entanto, ocurta duração da compressão abdominal utilizada nestes estudos indicam que o efeito Anrep não afecta a função cardíaca com este procedimento. Em outros estudos, a constrição da aorta aguda em cães foi demonstrada para aumentar a função contráctil, mas esta foi levantada a hipótese de resultar de os efeitos de diminuição da perfusão sistémica 36. Novamente a duração e a gravidade da perturbação do fluxo aórtico abdominal resultante de compressão, tal como descrito aqui, não é suficiente para aumentar significativamente a função contráctil secundária a hipo-perfusão de tecidos sistémicos. Análise de loops PV obtidos por compressão abdominal alinham bem com loops PV obtidos logo após a oclusão da veia cava caudal. Em conjunto, estas observações demonstram que a compressão abdominal transitório descrito aqui não altera significativamente a contractilidade do coração. Além disso, este procedimento fornece um método importante para avaliar as propriedades passivas do coração durante um ran mais amploge dos volumes diastólico final.
A análise de medidas independentes de carga permite a selecção de PV específica dos ciclos para ser incluídas na análise. É extremamente importante que isso seja feito de forma consistente em um conjunto de dados experimental. Ventilação com pressão positiva cria um artefato hemodinâmica através de alterações dependentes respiratórias de pré-carga para o ventrículo esquerdo 37. Para evitar esse artefato, laços PV deverão ser colhidas durante curtos períodos de apneia (3-4 seg). As pausas na respiração são particularmente úteis uma vez que proporcionam um melhor controlo de alterações experimentais em carga sobre o coração. É importante manter esses períodos de apnéia curtos para evitar hipoventilação. Os procedimentos descritos neste manuscrito recolher dados independentes de carga a partir de dois procedimentos distintos, caudal oclusão da veia cava e compressão abdominal, recolhidos mais ou menos ao mesmo tempo. As laçadas isoladas a partir destes dois procedimentos devem ser combinadas e analisadas together como ambos medir a função do coração mesmo sob, aproximadamente, as mesmas condições. Existem vários princípios para considerar quando selecionando laços para análise. Evite batidas arrítmicos. A batida na sequência de um batimento perdido é sempre anormalmente grande e extra-sístoles são anormalmente pequenos; ambos irão interromper a análise dos dados. Evitar batidas em que a pressão está a diminuir, mas o volume é constante. Estes são comuns no ratinho após a oclusão da veia cava caudal e são provavelmente secundária à fraca perfusão do miocárdio. Finalmente, incluem apenas dados de batidas diretamente após a mudança no carregamento; as batidas durante o período de recuperação são provavelmente afetadas por alterações na atividade nervosa simpática secundária a alterações na pressão arterial sistêmica resultantes da manipulação das condições de carga do coração.
análise do lacete PV fornece uma avaliação extremamente detalhada da função cardíaca. Quando é aplicado em conjunção com o flex genéticadade e baixa os custos de habitação do mouse pode fornecer um meio prático de avaliação da fisiologia cardíaca no nível molecular. Existem várias limitações importantes que devem ser considerados ao decidir realizar estes ensaios. Em primeiro lugar, este é um procedimento invasivo em que os ratos são anestesiados, o que pode afetar aspectos importantes da função cardíaca. Além disso, a interpretação dos dados de espira PV requer uma compreensão detalhada da fisiologia cardíaca tanto para identificar padrões dentro dos dados variáveis de confusão e potenciais. Além disso, porque estes ensaios são terminais não podem ser utilizados para avaliar o mesmo ratinho repetidamente. Os volumes ventriculares derivados de cateteres PV tendem a ser menos precisos do que os volumes ventriculares anatômicas fornecidos por ressonância magnética. Isto não é surpreendente como cateteres PV modelar o ventrículo como um cilindro, o que é claramente uma estimativa do volume total do ventrículo. A verdadeira força é a capacidade de coletar essas informações de volume para uma alta frequência, permitindo assim a análise de batimento a batimento das alterações no volume ventricular.
A recolha e análise de dados fotovoltaico do mouse pode ser um desafio, mas o método fornece informações sobre a função cardíaca que não está disponível através de qualquer outra metodologia. Este procedimento fornece o quadro mais completo da função cardíaca disponíveis e a sua utilização no modelo murino irá fornecer uma plataforma importante para a determinação das bases moleculares do complexo de estados de doença cardíaca, tais como insuficiência cardíaca e cardiomiopatias hereditárias. Este manuscrito fornece informações detalhadas sobre os aspectos mais críticos de realizar este procedimento. No entanto, como todos os procedimentos complicados, isso requer prática para desenvolver as habilidades de microcirurgia que são necessárias para executar com êxito essas experiências.
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Acknowledgments
O autor gostaria de reconhecer financiamento do NHLBI (K08 HL102066 e R01 HL114832).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont 5/45 (2) | Fine Science Tools | 11251-33 | |
| Vessel Dilating Forceps | Fine Science Tools | 18153-11 | |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissor | Roboz Instruments | RS-5668 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Curved | Fine Science Tools | 11041-08 | |
| Octogon Forceps - Serrated/Straight | Fine Science Tools | 11040-08 | |
| Dissector Scissors- Heavy Blade | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
| 3-0 Silk Suture | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| TOPO Ventilator | Kent Scientific | TOPO | |
| Martin ME 102 Electrosurgical Unit | Harvard Apparatus | PY2 72-2484 | |
| Syringe Pump | Lucca Technologies | GenieTouch | |
| Stereomicroscope with boom stand | Nikon | SMZ-800N | |
| Thermocouple Thermometer | Cole Parmer | EW-91100-40 | |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Data Acquision and Analysis | DSI | Ponemah ACQ-16 |
References
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