Optische Kontrolle eines Neuronal Protein eine genetisch kodierter unnatürliche Aminosäure in Neurons Verwendung

Zusammenfassung

Hier wird ein Verfahren zur selektiven Aktivierung eines neuronalen Proteins mit einem kurzen Lichtimpuls vorgestellt, indem eine photoreaktive unnatürliche Aminosäure genetisch in ein neuronales Zielprotein kodiert wird, das in Neuronen in Kultur oder in vivo exprimiert wird.

Zusammenfassung

Photostimulation ist eine nicht-invasive Methode zur Kontrolle biologischer Ereignisse mit hervorragender räumlicher und zeitlicher Auflösung. Neue Methoden sind erwünscht, um endogene Proteine, die in ihrer natürlichen Umgebung exprimiert werden, zu photoregulieren. Hier stellen wir einen Ansatz vor, um die Funktion eines neuronalen Proteins direkt in Neuronen mit Hilfe einer genetisch kodierten unnatürlichen Aminosäure (Uaa) optisch zu steuern. Durch die Verwendung eines orthogonalen tRNA/Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Paares zur Unterdrückung des bernsteinfarbenen Codons wird ein photoreaktives Uaa 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl-cystein (Cmn) ortsspezifisch in die Pore eines neuronalen Proteins Kir2.1, einen nach innen gerichteten Kaliumkanal, eingebaut. Das sperrige Cmn blockiert physikalisch die Kanalpore, wodurch Kir2.1 nicht leitend wird. Die Lichtbeleuchtung wandelt Cmn sofort in eine kleinere natürliche Aminosäure Cys um und aktiviert die Kir2.1-Kanalfunktion. Wir exprimieren diese photo-induzierbaren inwardly rectifying Kalium (PIRK) Kanäle in hippokampalen primären Neuronen der Ratte und zeigen, dass die Lichtaktivierung von PIRK das neuronale Feuern aufgrund des Ausflusses von K⁺ Strom durch die aktivierten Kir2.1 Kanäle stoppt. Mit Hilfe der In-utero-Elektroporation exprimieren wir PIRK auch im embryonalen Neokortex der Maus in vivo, was die Lichtaktivierung von PIRK in neokortikalen Neuronen zeigt. Die genetische Kodierung von Uaa unterliegt keinen Einschränkungen hinsichtlich des Zielproteintyps oder der zellulären Lokalisation, und eine Familie von photoreaktiven Uaas steht für die Modulation verschiedener natürlicher Aminosäurereste zur Verfügung. Diese Technik hat somit das Potenzial, allgemein auf viele neuronale Proteine angewendet zu werden, um eine optische Regulation verschiedener Prozesse im Gehirn zu erreichen. Das aktuelle Protokoll stellt ein zugängliches Verfahren für den komplizierten Uaa-Einbau in Neuronen in vitro und in vivo vor, um eine Photokontrolle der neuronalen Proteinaktivität auf molekularer Ebene zu erreichen.

Einleitung

Im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulation bietet Photo größere zeitliche und räumliche Auflösung bei minimaler Störung des physiologischen Systems von Proben. Seit der Demonstration Laser mit Neuronen im Jahr 1971 ^1, viele kreative Möglichkeiten zu stimulieren erfunden worden exogen mit Licht neuronale Aktivität zu kontrollieren. Optische Freisetzung von photoaktivierbaren Agonisten ist seit langem verwendet worden , um Liganden ^2,3,4 physiologische Antwort des neuronalen Netzes zu untersuchen. Diese Technik hat Spezifität begrenzt durch Diffusion von caged-Agonisten. Genetische Spezifität wird durch ektopisch exprimieren , lichtemp....

Protokoll

Alle Verfahren in der aktuellen Studie wurden unter Verwendung von Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) durchgeführt Protokolle für die Behandlung der Tiere für biologische Studien, La Jolla, CA am Salk Institute genehmigt

1. Uaa Incorporation in Kir2.1 und Expression des resultierenden PIRK in den Primary Neuronal Culture

1. DNA-Konstruktion
   1. Wählen Sie eine Zielstelle von Kir2.1 für Uaa Einbau. Exploit vor Wissen und Informationen über Struktur und Funktion von Kir2.1, so dass der gewählte Standort mit dem photoresponsive Uaa Incorporated ermöglicht eine optische Modulation von Kir2.1 - Funktion ^21.

Ergebnisse

Um genetisch eine Uaa in ein Protein in den Nervenzellen übernehmen, ist der erste wichtige Schritt ist, entsprechende Gen zu entwerfen die Gene zu liefern und zu exprimieren effizient in Neuronen. Es gibt drei genetische Komponenten für Uaa Einarbeitung: (1) das Ziel-Gen mit dem TAG amber Stop-Codon an der gewählten Stelle eingeführt für Uaa Einbau (2) eine orthogonale tRNA, die das mutierte TAG Stopcodon, und (3) eine orthogonale Aminoacyl zu erkennen -tRNA Synthetase die Uaa auf die o.......

Diskussion

Um eine effektive Photomodulations erreichen, ist der erster wichtiger Schritt, um zu entscheiden, wo das Licht ansprechende Uaa in dem Zielprotein zu integrieren. Strukturelle und funktionelle Informationen des Zielproteins ist sehr hilfreich, um die Auswahl von Kandidaten Seiten zu führen. Zugleich würde der Zweck der Lichtregulierung bestimmen, welche Seite am besten geeignet ist. Nach der Auswahl von Kandidaten - Websites, empfehlen wir die Standorte in Säugetierzelllinien wie die menschliche embryonale Nieren (HEK .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Deckgläser, Kreise, 12 mm, Dicke 0,13-0,17 mm	Carolina Biologicals	633029
Corning BioCoat Poly-D-Lysin	Corning Discovery Labware	354210
D-(+)-Glukoselösung	Sigma-Aldrich	G8769
Irisspatel gebogen	Fine Science Tool	10092-12
Präpariermesser - feine abgewinkelte Spitze	Fine Science Tool	10056-12
GlutaMAX-I Ergänzung	Life Technologies	35050-061
MITO+ Serum Extender	BD Biosciences	355006
Falcon 40 & micro; m Zellsieb	Corning Life Sciences	352340
BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurin)	Sigma-Aldrich	B6420
LED-LICHTQUELLE – Schwarze LED 385	Prizmatix GmbH
Agarose, niedriger Schmelzpunkt, analytische Qualität	Promega	V2111