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Medicine

Biología de Sistemas de regulación metabólica por el estrógeno receptor de señalización en cáncer de mama

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Food Sciences and Human Nutrition, University of Illinois, Urbana-Champaign

Abstract

Con el advenimiento de los -ómicas aproxima a la comprensión de las enfermedades crónicas como el cáncer y el síndrome metabólico ha mejorado. Sin embargo, la minería eficaz de la información en los conjuntos de datos a gran escala que se obtienen de microarrays de expresión génica, los experimentos de secuenciación profundas o perfiles metabólicos es esencial para descubrir y luego efectivamente las reguladores críticos de fenotipos de células enfermas. Receptor de estrógeno α (ER) es uno de los factores de transcripción que regulan los programas maestro de genes que son importantes para los cánceres de mama estrógeno de respuesta. A fin de comprender el papel de ER de señalización en el metabolismo de cáncer de mama se utilizó transcriptomic datos, cistromic y metabolómicos a partir de células MCF-7 tratadas con estradiol. En este informe describimos la generación de muestras de ARN-Seq, chip-Sec y los experimentos de metabolómica y el análisis computacional de integración de los datos obtenidos. Este enfoque es útil para delinear novela molcular mecanismos y circuitos de regulación de genes que son regulados por un factor de transcripción particular que afecta el metabolismo de las células normales o enfermas.

Introduction

Los estrógenos son reguladores importantes de muchos procesos fisiológicos, tanto en hembras y machos, incluyendo los tejidos reproductivos, tejidos metabólicos, cerebro y hueso 1. Además de los efectos beneficiosos en estos tejidos, los estrógenos también conducen los cánceres que surgen de mamaria y tejidos reproductores. Los estrógenos funcionan principalmente a través de las exigencias ambientales para inducir efectos específicos del tipo celular. secuenciación profunda de los transcritos regulados por ER ER usando ADN análisis de los sitios de unión de ARN-Sec y en todo el genoma utilizando el chip-Sec demostró ser útil para entender cómo funciona ER en diferentes tejidos y los cánceres que surgen de ellas. Nosotros y otros han publicado los perfiles de expresión de genes asociados con los receptores diferentes (ER) vs 2,3 ERβ, diferentes ligandos 3-5 y diferentes coregulators 2,4,6,7.

RNA-Seq es el principal método para examinar el transcriptoma, que ofrece una mayor precisión y eficiencia en comparación con ba microarraysanálisis de la expresión génica de sed 8. ARN obtenido a partir de líneas celulares 2-4,7, tejidos o muestras tumorales están en secuencia, asignada a los conjuntos genómicas disponibles y se identifican los genes regulados diferencialmente. La inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) se emplea para diseccionar la unión a sitios de unión reguladoras conocidas cromatina factor de transcripción y coregulator. Chip-Sec (CHIP seguida de secuenciación de alto rendimiento) proporciona una detección imparcial de sitios de unión globales. La metabolómica es otro enfoque de la biología de sistemas cada vez más utilizada, que mide cuantitativamente, la respuesta multiparamétrico dinámica de los sistemas vivos, incluyendo a varios estímulos químicos y perturbaciones genéticas.

Mediante la realización de perfiles metabólicos global, una lectura funcional puede obtenerse a partir de células, tejidos y sangre. Además, la información de los experimentos del transcriptoma no siempre reflejan los cambios reales en el nivel de enzimas que contribuyen a las vías bioquímicas. ConjuntoEl análisis de los datos del transcriptoma y metabolome nos permite identificar y correlacionar los cambios en la expresión de genes con los cambios reales de metabolitos. El aprovechamiento de la información de todos estos grandes conjuntos de datos de escala proporcionan los detalles mecanicistas para comprender el papel de los factores de transcripción que regulan los sistemas biológicos complejos, especialmente los que se refieren al desarrollo humano y las enfermedades como el cáncer y la diabetes.

La naturaleza compleja del genoma de los mamíferos hace que sea difícil de integrar e interpretar los datos obtenidos de los experimentos del transcriptoma, cistrome y metabolome totalmente. La identificación de eventos de unión funcionales que puedan dar lugar a cambios en la expresión de los genes diana es importante porque se identifican los sitios de unión una vez funcionales; subsiguiente análisis, incluyendo la unión de transcripción (TF) motivo de análisis, se podría realizar con mayor precisión. Esto lleva a la identificación de las cascadas de TF biológicamente significativos y mecanismos. También Comparis directosen experimentos de RNA-Seq y Chip-Seq no siempre son posibles ya que los datos de cada experimento tienen diferentes escalas y ruidos, y en algunos casos las señales significativas están oscurecidas por el ruido de la población. No tenemos conocimiento de ningún estudio que integra información de estos tres enfoques independientes pero relacionados para entender la regulación metabólica de particular ER en el cáncer de mama. Por lo tanto, nuestro objetivo general de este trabajo es relacionar sucesos de unión productivos a la expresión de genes y cambios de metabolitos. Con el fin de lograr este objetivo, hemos integrado los datos de RNA-Seq, Chip-Seq y metabolómica experimentos y se identificaron los estrógenos inducida ER eventos que conducirían a cambios de expresión génica en las vías metabólicas de unión. Por primera vez, proporcionamos un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar chip-Sec, el RNA-Seq y metabolómica perfiles y la realización de análisis integrador de los datos para descubrir nuevos circuitos de genes que regulan el metabolismo de mamalíneas celulares de cáncer.

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Protocol

1. Preparación de las muestras de RNA-Seq

  1. Cultivo Celular y Tratamiento
    1. Cultivar las células MCF7 en una mejora de MEM (IMEM) más medio de rojo de fenol con 10% de calor inactiva FBS, 1% de penicilina / estreptomicina a 37 ° C en 5% humidificado atmósfera de CO2.
      Nota: La misma línea de células y condiciones de cultivo celular se utiliza durante todo el estudio.
    2. Semillas 100.000 células MCF7 por pocillo en placas de 6 pocillos. Tienen por triplicado para cada tratamiento. El día 3, se elimina el medio y añadir 2 ml de medio fresco con o sin 10 -8 M E2 a cada pocillo. Las placas se incuban durante 24 horas en 37 ° C en 5% humidificado atmósfera de CO 2.
    3. Para cosechar las células, añadir 1 ml de reactivo de aislamiento de ARN (tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo ácido) en cada pocillo y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente (RT). A continuación, recoger el reactivo de lisado celular con la pipeta y el depósito en tubos de 1,5 ml
  2. Aislamiento de ARN
    1. Añadir 200 l chloroform al reactivo de 1 ml de lisado celular (1.1.3) y agitar durante 10 seg. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Después de la centrifugación, la transferencia de la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo sin perturbar las otras fases.
    2. Añadir 500 l 100% de isopropanol a un nuevo tubo con la fase transferido acuoso, y se mezcla por inversión. Se incuba a -20 ° C durante la noche. Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Observar un pellet en la parte inferior del tubo. Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 750 l de etanol libre de ARNasa 70% en breve vórtice.
    3. Centrifugar las muestras a 6.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y centrifugar la muestra a 16.000 xg durante 1 min a 4 ° C para recoger todo el etanol restante. Eliminar el etanol restante con la pipeta con una punta de carga de gel y fijar los tubos de hasta boca abajo para secar al aire durante 10 minutos. Disolver el precipitado en 20-50 l de agua tratada con DEPC depending en el tamaño de los gránulos.
  3. Se purificó el ARN usando ARN kit de limpieza siguiendo el protocolo 4. Medir la concentración de ARN utilizando un kit de ensayo basado fluorometrıa siguiendo el protocolo 9.
    NOTA: DO a 260 nm se toma para determinar la concentración de ARN y la proporción de DO a 260 nm y 280 nm se usan para determinar la pureza de la muestra. Se recomienda la comprobación de la calidad del ARN usando un ensayo Bio-analizador.
  4. Tomar aproximadamente 0,5 a 1 mg de ARN purificado para la secuenciación.
    NOTA: Centro de Biotecnología prepara las bibliotecas de secuenciación y realiza de extremo emparejado leer secuenciación utilizando métodos detallados anteriormente 2.

2. Preparación de la muestra chip-Sec

  1. Cultivo Celular y Tratamiento
    1. Seed 500.000 células MCF7 por placa de 10 cm en medio de crecimiento.
      NOTA: Para cada pull down Se han usado 16 placas. El día 3, se elimina el medio y añadir 5 ml de medio fresco con o sin 10 -8 M E2 a cadaplato. Tratar las células durante 45 minutos (37 ° C en un ambiente humidificado 5% de CO 2).
  2. Reticulación y celular de cosecha
    1. Añadir 250 l 37% de formaldehído en 5 ml de medio para reticular la cromatina, se incuba a temperatura ambiente durante 15 min. Deja de reticulación mediante el lavado de las células con 5 ml de hielo frío 1x MEM.
    2. Recoger las células en 250 l de tampón de lisis celular (10 mM EDTA, mM Tri HCl 50, 1% SDS, N, N-óxido de dimethyldodecan-1-amina 0,5%) por placa.
  3. La fragmentación de la cromatina
    1. Sonicar las células durante 30 seg x 8 al amplificador de 30 a alcanzar tamaños requeridos de la cromatina. Enfriar cada muestra en hielo después de un tratamiento con ultrasonidos de 30 segundos.
    2. Centrifugar a 16, 000 xg durante 10 min a 4 ° C, y con cuidado pipeta el sobrenadante sin perturbar el sedimento en la parte inferior.
    3. Tomar una alícuota de 5 l del sobrenadante, y comprobar el tamaño del ADN por electroforesis a través de gel de agarosa al 1,5% como se ha descrito previamente 10. El tamaño idealde ADN debe estar entre 200-500 pb.
  4. La inmunoprecipitación de la cromatina
    1. Guardar 25 l de lisado celular como entrada. En un tubo de 50 ml, mezclar 4 ml de lisado de células con 20 ml de tampón de IP (EDTA 2 mM, NaCl 100 mM, 20 mM Tris-HCl, y 0.5% de Triton X), anticuerpo ER (F10 500 l y 500 l HC- 20), y 500 l de proteína ProtA y protg recubrimiento de perlas magnéticas. Incubar la mezcla por rotación a 4 ° C durante la noche para permitir la formación de complejo anticuerpo cromatina.
  5. Se lava y Reverse-reticulación
    1. Utilice un soporte magnético para recoger las perlas magnéticas en el lado magnetizado para eliminar el tampón de lavado.
    2. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml de tampón de lavado I (2 mM EDTA, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, y NaCl 150 mM). Para lavar las perlas magnéticas sin molestar a los complejos ADN-proteína, en 25 ml de tampón de lavado lentamente al tubo a lo largo del lado y luego invertir los tubos hasta que todas las bolas magnéticas son wi bien mezcladoth el tampón de lavado sin que parezca como una pastilla. Como alternativa, usar el rotador para invertir el tubo. No vórtice las muestras. Lavar las perlas magnéticas utilizando el mismo método en los pasos siguientes.
    3. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml Wash-tampón II (EDTA 2 mM, Tris HCl 20 mM, 01% de SDS, 1% de Triton X, y NaCl 500 mM).
    4. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml Wash-tampón III (EDTA 1,6 mM, Tris HCl 10 mM, 1% NP-40, 1% Dexycholate y 250 mM LiCl).
    5. Lavar las perlas magnéticas en 25 ml de tampón 1x TE (EDTA 1 mM, y mM Tris HCl 10) dos veces.
    6. Eluir el ADN en 500 l de tampón de elución (1% SDS, y 10 mM NaHCO 3) y luego asignar la elución 500 DNA l en 4 tubos. Para el ADN de entradas, eluir el ADN en 125 l de tampón de elución.
    7. Incubar los tubos a 65 ° C durante la noche en un bloque de calentamiento. Cubra los tubos en el bloque de calentamiento con papel de aluminio para mantener el calor incluso a través de todos los tubos. Coloque un peso sobre los tubos para evitar que se abra. </ Li>
  6. Aislamiento de ADN
    1. Enfriar los tubos a temperatura ambiente durante 5 min. Aislar el ADN de las muestras desplegables usando el kit de aislamiento de ADN chip. Siga las instrucciones del fabricante.
      1. Calentar el tampón de elución a 65 ° C. Añadir 625 l de tampón de unión a cada tubo. Si los forma un precipitado, añadir otro tampón de unión 250 l hasta que la solución es clara.
      2. Cargar la muestra en la columna y se centrifuga a 16.000 xg durante 30 seg. Lavar la muestra con 250 l de tampón de lavado. Recuerda añadir etanol a la solución de lavado cuando la primera vez que lo utilizan. Repetir el lavado.
      3. Eluir el ADN en 15 tampón de elución l. Combinar el ADN de los mismos tire hacia abajo de 4 tubos para alcanzar alrededor de 55 l de ADN.
    2. Aislar el ADN de entrada utilizando un kit de purificación de ADN.
      1. Calentar el tampón de elución a 65 ° C. Añadir tampón de unión 625 l en cada tubo y se incuba durante 10 min. Cargar la muestra en la columna en un 2 ml collectien el tubo.
      2. Lavar la muestra con 750 l de tampón de lavado, centrifugar a 16.000 xg durante 1 min. Repetir la centrifugación para eliminar cualquier tampón restante. Eluir el ADN en 30 l de EB.
    3. Medir la concentración de ADN usando un fluorocromo Ensayo comercial con modificaciones 11.
      1. Diluir el tampón 20x TE en 1x TE como el tampón de ensayo para la dilución de las muestras de reactivo y de ADN. Tomar 5 l de ADN aislado y diluir en 50 l en 1x TE.
      2. De DNA / ml de solución madre 2 mg hacer un estándar de ADN que van desde blanco a 1, 10, 100, 1000 g / ml. En una placa de 96 pocillos, destinar 25 l de cada estándar, así como la dilución de ADN por duplicado. (Se recomienda triplicado para el estándar.)
      3. Prepare el reactivo de trabajo al hacer una dilución de 200 veces de reactivo de ADN de doble cadena en tampón 1x TE en tubo de plástico. Cubrir la solución de reactivo de trabajo con papel de aluminio para evitar la luz. Añadir 200 l de reactivo de trabajo en cada muestra. EnCubate a temperatura ambiente durante 5 min. Cubrir la placa con papel de aluminio para evitar la luz.
      4. Medir la fluorescencia de las muestras usando un lector de placas de fluorescencia (excitación a 480 nm, emisión 520 nm). Generar la curva estándar de ADN de fluorescencia frente a la concentración de ADN. Determinar las concentraciones de las muestras en base a la curva estándar de ADN generado.
  7. Verificación del Experimento chip usando qPCR
    1. Tomar 2 l de ADN aisladas y se diluyeron en 20 l de agua. Configurar la reacción qPCR por triplicado mediante la mezcla de 2,5 l de dilución de ADN, 5 l Green I PCR Master Mix, 1 l de cebador, y 1,5 l de agua libre de nucleasa.
    2. Ejecutar la qPCR con el sistema de PCR en tiempo real rápida utilizando el siguiente programa: Paso 1: 95 ° C durante 60 segundos, Paso 2: 95 ° C durante 10 s, 60ºC durante 60 segundos, repita el paso 2 39 veces.
  8. Continuar 10 ng muestra de ADN al centro de biotecnología para la secuenciación.
    NOTA: El Bioteccentro h prepara el chip de ADN en las bibliotecas de acuerdo a la instrucción, y lleva a cabo la secuenciación de lectura simple, que utiliza métodos detallados anteriormente 2.

3. Preparación de la muestra de ensayo metabolómica

  1. Cultivo Celular y Tratamiento
    1. Semilla de 400.000 células MCF7 por placa de 10 cm en medio de crecimiento. Para cada tratamiento preparar tres muestras. Utilizar dos placas en cada muestra para recibir suficientes células para la detección. El día 3, se elimina el medio y añadir 5 ml de medio fresco con o sin 10 -8 M E2 a las células. Tratar las células durante 24 horas (37 ° C en un ambiente humidificado 5% de CO 2).
  2. Coleccion de muestra
    1. Añadir 5 ml de hielo frío 1x PBS a la placa, aspirar el PBS después de inclinar brevemente la placa varias veces. Repetir dos veces, y eliminar la mayor cantidad de PBS como sea posible después del último lavado.
    2. Añadir 750 l de acetona fría previamente a cada placa y raspar las células. Se combinan las células en acetona a partir de dos placas ena un tubo de 2 ml en hielo.
    3. recuento de células para la normalización
      1. Para cada tratamiento, utilizar dos placas adicionales para la cuantificación celular. Para des-unir las células de la placa, añadir 2 ml de tampón HE (1x HBSS, HEPES 10 mM, 0,075% de NaHCO3, y EDTA 1 mM) en cada placa e incubar durante 5 minutos.
      2. Recoger y mezclar bien las células pipeteando las células en el tampón HE. Utilice total de 20 l solución de células para contar el número de células usando un hemocitómetro.
  3. Almacenar las muestras a -80 ° C antes de enviarlo al centro de la metabolómica para identificar y cuantificar los metabolitos utilizando el análisis de cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS).

4. Análisis Integral

  1. RNA-Seq Análisis de datos:
    1. Realizar la comprobación de la calidad de los archivos utilizando FASTQ FastQC: Lee QC (http://galaxy.illinois.edu)
      1. Seleccionar FastQC: Leer debajo de la herramienta de NGS: control de calidad y la manipulación. Sube el archivo de datos brutos de Histor actualy.
        NOTA: Se recomienda dar un título para el archivo de salida para recordarle que lo que era el trabajo para ya que podría haber varias salidas.
    2. Ejecutar el archivo de salida y aparecerá debajo de la Historia. Repetir el mismo procedimiento para cada archivo de secuencia. adaptadores de recorte usando el clip bajo NGS: FASTX Toolkit.
    3. Align lee a hg19 utilizando Tophat2 con genoma RefSeq anotación de referencia 12 (valores por defecto).
      1. Seleccionar Tophat2 bajo herramienta de NGS: análisis de ARN. Indicar la biblioteca de tipo apareado (single-end-vs final emparejado).
      2. Sube el archivo de entrada FASTQ de la historia actual. Seleccione el genoma de referencia. Elija los valores por defecto. O utilizar la lista completa de los parámetros que desee modificar.
      3. Ejecutar y producirá dos archivos de salida: uno es UCSC pista lecho de uniones; otra es una lista de las alineaciones de lectura en formato BAM.
    4. Subir archivos BAM a la herramienta de análisis de datos de secuenciación. Calcular los valores de expresión utilizando QuantHerramienta ficación.
    5. Identificar los genes diferencialmente regulados hasta utilizando la herramienta de análisis de expresión utilizando los valores por defecto y doble cambio> 2 y el valor p <0,05. Del mismo modo, identificar los genes regulados diferencialmente abajo utilizando la herramienta de análisis de expresión utilizando los valores por defecto y doble cambio <0,5 y el valor p <0,05.
  2. Análisis de Datos chip-Sec:
    1. Alinear FASTQ lee a hg19 utilizando Bowtie2 13 (valores por defecto) en el Galaxy.
      1. Seleccionar Bowtie2 bajo la herramienta de NSC: Mapping. Verificar si la biblioteca es mate-emparejado (un solo extremo vs-extremo emparejado). Sube el archivo FASTQ de la historia actual.
      2. Seleccione el genoma de referencia. Utilice los ajustes de los parámetros por defecto. Ejecutar y producirá archivo de salida con la secuencia asignada texto es el archivo de BAM. Repita el procedimiento para cada archivo de secuencia.
    2. Identificar los picos utilizando MACS 14 un p-valor de corte de 6.0e-7 y FDR de 0,01, como se ha descrito anteriormente 2.
    3. Análisis de Datos metabolómica:
      1. Convertir nombres químicos de los metabolitos de KEGG_IDs.
      2. Identificar metabolitos regulados diferencialmente mediante la comparación de los niveles detectados en el vehículo vs. E2 muestras (a 2 veces de corte fue utilizado en este estudio) a tratar.
    4. Análisis de integración:
      1. Identificar los genes que tienen sitios de unión ER utilizando la herramienta de análisis de datos de secuenciación. Traducir Regiones de la función de genes usando 20 kb como la distancia de corte.
      2. Identificar los genes diferencialmente arriba y hacia abajo regulada de análisis de datos de RNA-Seq utilizando factor de cambio> 2 veces el cambio y <0,5, respectivamente, con el valor de p <0,05 como cortada. Comparar a la lista de ER sitio de unión que contienen genes utilizando Venn diagrama de comparación.
      3. Utilice esta lista para identificar las vías metabólicas E2 moduladas usando Metscape 15 módulo de Cytoscape.
        1. Al seleccionar el módulo Metscape de aplicaciones, elija Generar red y después la vía-basopción ed.
        2. Seleccione el organismo (humano). Seleccione el archivo de datos de la lista de E2 compuesto no reglamentada (KEGG ID), así E2 hasta reguladas lista de genes.
        3. Elija el Compuesto -Reacción -Enzyme-Gen como el tipo de red. Elija compuestos / genes como la consulta.
        4. Construir la red. Repita con el compuesto E2 y genes regulados.

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Representative Results

transcriptómica
Para el análisis de los genes expresados ​​diferencialmente por E2 tratamiento, se optó por realizar un experimento de RNA-Seq. Además de proporcionar información sobre los niveles de ARNm, los datos de RNA-Seq también se pueden utilizar para controlar los cambios en (largos ARNs no codificantes, microRNAs) no codificantes de ARN y eventos de splicing alternativo. Nosotros no proporcionamos información sobre el análisis de los genes no codificantes ARN transcritos o, alternativamente, ya que el alcance de nuestro estudio es identificar los genes de codificación de proteínas que son importantes para la regulación metabólica. Sin embargo, el RNA-Seq es una excelente manera de obtener información sobre los eventos de expresión génica diferencial.

Con el fin de obtener una alta calidad lee, es importante obtener la máxima pureza del RNA. Después de aislar el ARN purificamos el ARN usando un kit de limpieza de ARN. Desafortunadamente casi 50% del ARN se pierde durante este proceso y la cantidad de ARN de partida se debe tener en cXAMEN para obtener la cantidad requerida (100-500 ng) por el final de la etapa de purificación.

Se cuantificaron los rendimientos de ARN usando ARN fluorómetro ensayo SA, que es muy preciso y es el método preferido para la cuantificación de ARN de baja abundancia. A continuación, la integridad y la calidad general de las muestras de ARN se examinaron usando bioanlayzer, que es una alternativa viable a electroforesis en gel utilizando una cantidad mínima de ARN. El análisis muestra todas las muestras tienen bandas nítidas y limpias de 18S y 28S rRNAs que indican la integridad y pureza de las muestras (Figura 2B). RNA Integrity Number (RIN) fue utilizado como un estándar para el control de la calidad del ARN. RIN 10 indica ARN intacto, RIN 6 parcialmente degradado y RIN3 degradan fuertemente 16.

Se recomienda que el RIN sea al menos 7 para el experimento de secuenciación. Todas nuestras muestras de ARN recibieron valor RIN entre 9/6 a 9/9 <strong> (Figura 2A). Bibliotecas de secuenciación se construyen a partir de 500 ng de ARN de alta calidad a partir de cada muestra utilizando el sistema de secuenciación de ultra-alto rendimiento tales como Illumina 2500. En promedio secuenciación 18000000 de alta calidad lecturas se obtuvieron para cada muestra (Tabla 1), que estaba listo para aguas abajo análisis. Para comprobar la calidad general de la secuencia de datos en bruto de alto rendimiento, FastQC se ha ejecutado para cada muestra de lee. Un informe FastQC representativo de los datos de un vehículo RNA-Seq se muestra (Figura 3). La longitud de la secuencia de los más lecturas era de 100 pb (Figura 3A). Para cada lectura, la puntuación de calidad fue 32-34 para los primeros 5 pb y 36-38 de 6-100bp (Figura 3B). Entre 17.990.863 lecturas generados a partir de esta muestra, la mayoría de ellos tenían el nivel de calidad más alto que 34 (Figura 3C). El contenido de GC por lectura en la secuencia también siguió la distribución normal con un promedio de 48% de GC. En general la calidadpuntuación de las lecturas era muy alta.

análisis Cistromic de sitios de unión ER
Para lograr la secuenciación profunda eficiente, la obtención de fragmentos de ADN en tamaño deseable es uno de los factores importantes. Enfoques de secuenciación actuales pueden tener diferentes requerimientos en los fragmentos de ADN, por ejemplo 300-600 pb para el sistema de secuenciación ultra-alto rendimiento, 100-200 pb para AB / sólido 17. En este experimento la mayor parte de los fragmentos de ADN son entre 300 pb y 600 pb como se muestra en gel (Figura 4). Como alternativa, los lectores pueden elegir para preparar su cromatina mediante digestión MNase, sin embargo sentimos que nuestro protocolo establecido proporciona las muestras requeridas con alta calidad y proporciona resultados reproducibles. Diez ng de ADN de cada tratamiento y su muestra de entrada correspondiente se preparó en tampón EB. El chip de ADN era de un solo lectura secuenciado utilizando el sistema de secuenciación ultra-alto rendimiento. Las muestras de ADN chip produjeron alrededor20000000 lee mientras que el ADN de entrada produjo más de 35.000,000 lee (Tabla 1).

La metabolómica
Para cuantificar los metabolitos en las células de mamíferos mediante GC-MS, se requieren al menos 10 g de masa celular. Comenzamos con 400.000 células MCF7 con los experimentos. En el momento de la cosecha, había alrededor de 500.000 células en cada placa. La visión general de los metabolitos representados por picos fueron comparados entre el control y la muestra tratada estradiol (Figura 5). Cerca de 100 metabolitos fueron identificados, los cuales cuentan el 60% del total conocido en los mamíferos. Aquí presentamos una lista de las 10 principales metabolitos, que muestran cambios significativos en el tratamiento E2 (Tabla 2). En general, E2 upregulated vías incluyendo fructosa y manosa metabolismo, el metabolismo de la histidina, el metabolismo de la purina, la biosíntesis de colesterol y el metabolismo de la vitamina B3. Las vías downregulated eran butanoato metabolism, biosíntesis de ácidos grasos de novo, vía del fosfato de pentosa, ciclo de la urea y el metabolismo de la arginina (Tabla 3).

Análisis de los datos y la integración
Los datos de RNA-Seq, chip-Sec y GC-MS fueron procesados ​​y analizados a través de una serie de pasos (Figura 6). Después de la comparación entre los genes identificados en el RNA-Seq y chip-Sec, un conjunto de hasta reguladas y se extrajeron un conjunto de reguladas por los genes por el estradiol. A partir de los datos metabólicos, obtuvimos dos grupos de compuestos arriba y hacia abajo-regulados por el tratamiento estradiol. Siguiente utilizamos Metscape, una aplicación para Cytoscape, para visualizar e interpretar la expresión de genes y datos metabólicos en el contexto del metabolismo humano 15. En primer lugar se optó por incluir elementos del compuesto, la reacción enzimática, y el gen de la red. Se seleccionaron los compuestos / genes como consulta y dos redes del E2 sobre regulación (Figura 7A) y hacia abajose muestra -Reglamento (Figura 7B). El Metscape también proporciona una opción para construir redes de vías selectivas. Por ejemplo, utilizando el mismo conjunto de datos como la construcción de la red general regulada hacia abajo, una subred de la vía de biosíntesis y metabolismo de los andrógenos en estrógenos se generó por conmutación de la consulta a partir del compuesto / gen de vía específica. Los genes o compuestos con cambios significativos se resaltan en color más brillante. Además de seleccionar una vía específica de la ventana desplegable como se ha descrito, también se puede crear una sub-red mediante la aplicación de la función "crear subred" a la zona elegida. Como se muestra en la Figura 6A y B, ER activación y de unión directa a las regiones reguladoras de genes impactado muchas vías metabólicas en las células del cáncer de mama. Nuestro análisis de integración indicó que, ER se une directamente a y regula la expresión de gen FASN, que es importante para la de la biosíntesis de ácidos grasos vía de novo (Figura 7C). Además E2 tratamiento downregulated vías de biosíntesis de andrógenos en estrógenos por la represión de la expresión de CYP4Z1, CYP2E1, CYP4B1, CYP2C8, TPO, GSTA4 y GSTM2 en estas vías.

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo de la preparación de muestras de RNA, DNA y lisados ​​de células para la RNA-Seq, ChIP-Seq, y el análisis metabolómico.

Figura 2
Figura 2:. Un electroferograma representante de los ARN analizados con el Agilent 2100 Bioanalyzer ARN Número Integridad (RIN), indicador de la calidad del ARN, fue dada por el análisis como 9.9. (A) En una imagen de gel virtual de la muestra de RNA de ambas bandas 26S y 18S son agudos. (B) las señales fluorescentes de que vaya a determinarse en tARN que muestra que la intensidad del pico 28S 18S es mayor que el pico y no se observa ninguna contaminación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3:. Un control representativo de la calidad de los datos en bruto de ARN-Seq Uno de datos de la secuencia de la muestra vehículo se analizó utilizando FastQC. (A) La distribución de la longitud de secuencia de la biblioteca, la cual es 100 pb. (B) La puntuación de calidad a lo largo de la posición en la lectura. (C) La puntuación de calidad por secuencia mostró la alta calidad universal de todas las secuencias. (D) El contenido de GC por lectura coincidía con la distribución teórica. Haga clic aquí para ver a larger versión de esta figura.

Figura 4
Figura 4: Electroforesis en gel de los fragmentos de cromatina sonicadas 5 l de lisado de células de cada muestra se ejecutó en un gel de agarosa 1,5% con un 1.000 pb más escalera en el primer carril.. La mayoría de los fragmentos son entre 300 y 600 pb. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5:. El panorama de picos que representan los metabolitos de la GC-MS El panel superior muestra los picos identificados en las muestras tratadas E2 mientras que el panel inferior del mando. El área cerrada fue ambientes en los que muestra el metabolito exacta representada por cada p EAK. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Diagrama de flujo del método de agrupación integrativa.

Figura 7
Figura 7: La visualización de los datos integrados de genes-metabolito en Metscape (A) La red de vías hasta reguladas por E2.. (B) La red de vías de las reguladas por E2. (C) E2 estimuló el reclutamiento ER a la cercana región de FASN, que se encuentra a regular en la red biosíntesis de ácidos grasos de novo generado por la aplicación de la función de subred.3832fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1: Resumen de secuenciación ultra-alto rendimiento de RNA-Seq y chip-Sec.

Tabla 2
Tabla 2: Lista de los 10 principales metabolitos con cambios significativos con el tratamiento E2.

Tabla 3
Tabla 3: Caminos hacia arriba y hacia abajo-regulada por el tratamiento E2.

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Discussion

En este artículo, describimos la generación y análisis integrador de la metabolómica datos de RNA-Seq, chip-Sec y de las células MCF-7 que son tratadas con E2. Hemos desarrollado un conjunto de protocolos strategizing para utilizar los métodos más eficientes y amigables mercancías suaves usuario que producen descubrimiento biológicamente relevante. A nuestro entender, el nuestro es el primer estudio para integrar -ómicas datos de tres análisis diferentes y nuevas vías metabólicas identificadas que ER regula directamente en las células de cáncer de mama.

transcriptómica
Es fundamental comenzar con los ARN de alta calidad para un análisis de transcriptómica éxito. La buena práctica eliminará la posibilidad de la degradación del ARN, incluyendo la creación de banco libre de RNasa, el cambio de guantes a menudo, el almacenamiento en -80 ° C y mantener en hielo en uso. La adición de la incubación durante la noche a -20 ºC mejora la recuperación de ARN. Para evitar la congelación y descongelación repetida de ARN, se puede asignar los ARN para procedur aguas abajoes sobre el aislamiento y la purificación. Por la existencia de errores de secuenciación, QRT-PCR usando el ADNc de las muestras se realiza a menudo para verificar los genes expresados ​​diferencialmente identificados en RNA-Seq. Por lo tanto, lo suficientemente ARN debe ser reservado para este fin. Realizamos emparejado de extremo secuenciación que nos permite analizar las variantes de empalme, los ARN no codificantes y miRNAs. Para evitar los altos costos de secuenciación, la secuencia de extremo único se puede realizar también. En comparación con microarrays, RNA-Seq es más sensible y no se limita a las sondas proporcionados en el chip. Obtenemos información no sólo en las secuencias de codificación, sino también de genes no codificantes y transcripciones empalmadas diferencialmente. Actualmente estamos utilizando esta técnica para analizar transcriptomes de varias líneas de células después de los tratamientos de ligandos, así como los tejidos obtenidos a partir de experimentos con ratones.

Cistromics
El método de secuenciación de ultra-alto rendimiento requiere un mínimo de DNA chip 5 ng para la construcción de la biblioteca. En estándar ChIP-Sec protocolo 18, se recomienda tener al menos 10 ng. La cuantificación con fluorometría es crítica. En este protocolo se utilizó ensayo de detección de ADN de doble hebra para determinar la concentración de ADN. También se puede utilizar ensayo fluorómetro para la cuantificación de ADN preciso. Por las diferencias en los equipos y materiales, es muy importante que cada laboratorio establezca su propio protocolo de tratamiento con ultrasonidos, que genera deseables fragmentos de ADN tamaños. El exceso de cizallamiento de la DNA Chip puede causar la pérdida de enriquecimiento de ADN diana, mientras chip de ADN de gran tamaño crean un problema para la secuenciación eficiente. Antes de presentar el ADN para la secuenciación, siempre es importante verificar el enriquecimiento de algunas regiones conocidas por qPCR. La técnica todavía está limitado por la eficiencia y la especificidad del anticuerpo usado para las inmunoprecipitaciones. Para obtener información del sitio de unión que podría ser utilizado de forma fiable en los análisis comparativos, validamos nuestros reactivos siguientes normas chip-Seq ENCODE, 19 y utilización standardized protocolos que nos proporcionan conjuntos de datos coherentes. Junto con el análisis de enriquecimiento sitio de unión del factor de transcripción posterior, chip-Sec sigue siendo uno de los mejores métodos para determinar la unión directa de factores de transcripción de la cromatina. Actualmente estamos utilizando este protocolo para estudiar quinasas de reclutamiento, coregulators y otros factores de transcripción de la cromatina en otras líneas celulares, así como estrógeno tejidos de ratón sensibles.

La metabolómica
Para un perfil metabólico éxito en células de cáncer de mama humano, una preparación de la muestra cuidado es crítica. La cantidad de células en uso y la condición de cultivo celular en este protocolo es óptimo para las células MCF7. Otras líneas de células pueden requerir más o menos células para la detección de un número importante de metabolitos. Obtenemos alrededor de 100 metabolitos en cada experimento. Este método está limitado para la detección de metabolitos de vida corta o metabolitos que están presentes en bajas concentraciones. Este método ofrece la facilidad de USIng de una sola preparación de muestras para identificar varios metabolitos. Actualmente estamos utilizando esta técnica para identificar metabolitos de estrógeno regulados en el suero y diversos tejidos de ratón.

Integración de datos
Numerosos estudios de transcriptómica y cistromics se realizaron para investigar la señalización de los estrógenos y la regulación de genes en células de cáncer de mama, incluyendo las células MCF7 2,5-7,20. En este estudio, por primera vez, hemos añadido la metabolómica datos y tratamos de inferir las redes metabólicas que son regulados directamente por ER después de la adición del ligando. Este nuevo enfoque nos ha permitido precisar circuiterıas moleculares de puntos regulados por estrógenos que afectan el metabolismo celular. En general, nuestros resultados apoyan el papel de ER como un regulador maestro de la biología del cáncer de mama.

En resumen, hemos proporcionado un compendio detallado de protocolos para la generación de ARN-Seq, las muestras de chip-Seq y metabolómica de células de cáncer de mama después de los tratamientos de estrógeno y Integranálisis ative de los datos obtenidos a partir de estos -ómicas enfoques. Estos protocolos permitirán a los investigadores hacer un análisis similar para otros factores de transcripción, ligandos de receptores nucleares y condiciones de nutrientes.

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Disclosures

Universidad de Illinois recibió una subvención Investigador Iniciado de Pfizer Inc. ZME y YCZ recibió apoyo salarial de esta subvención.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Alimentación y la Agricultura, Departamento de Agricultura de Estados Unidos, premio ILUM-698-909 (ZME) y Pfizer, Inc (ZME). Su contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Departamento de Agricultura de Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Triglyceride Mix Sigma 17810-1AMP-S
Oleic acid  Sigma O1257-10MG Oleic Acid-Water Soluble powder 
TRIzol Reagent Life technologies  15596-026
Dynabeads Protein A Life technologies  10006D
Dynabeads Protein G Life technologies  10007D
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106 DNA isolation of input sample 
ZYMO ChIP-DNA Isolation kit  Zymo Research  D5205 ChIP DNA Clean & Concentrator
Quant-iTª PicoGreen¨ dsDNA Assay Kit Invitrogen  P7589 DNA Quantitation
RNase-Free DNase Set QIAGEN 79254 RNA purification
DEPC Treated Water  LIFE TECH 462224 Dnase/Rnase Free
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific  FB120110 With 1/8 probe 
 Fisher Scientific Sound Enclosure Fisher Scientific  FB-432-A For sound reduction
 Eppendorf Tubes 5.0 ml Eppendorf  0030 119.401 200 tubes (2 bags of 100 ea.)
Random Primer Mix  NEB S1330S
DNTP MIX NEB N0447S
M-MuLV Reverse Transcriptase NEB M0253S
FastStart SYBR Green Master ROCHE 4673484001
Agarose Fisher  BP160100 1.5% agarose gel 
Qubit RNA HS Assay Kit Life technologies  Q32852 RNA quantification (100 assays) 
Formaldehyde Sigma F8775
Protease Inhibitor tablets  Roche  4693116001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets Roche  4906845001 Each tablet is sufficient for 10 ml lysis buffer
Qubit Assay Kits Life technologies  Q32850 For 100 assays
Automated cell counter ORFLO MXZ000
tube Rotator  VWR 10136-084
Victor X5 Multilple plate reader  PerkinElmer 2030-0050
Microcentrifuge 5417R Eppendorf 22621807
Magnetic Stand Diagenode B04000001 
Fast Real-time PCR system Applied Science  4351405

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References

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Medicina No. 109 RNA-Seq transcriptoma chip-Sec cistrome la metabolómica el estrógeno el cáncer de mama
Biología de Sistemas de regulación metabólica por el estrógeno receptor de señalización en cáncer de mama
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Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z.… More

Zhao, Y. C., Madak Erdogan, Z. Systems Biology of Metabolic Regulation by Estrogen Receptor Signaling in Breast Cancer. J. Vis. Exp. (109), e53832, doi:10.3791/53832 (2016).

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