逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

摘要

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。

摘要

逆转录病毒在局部和全局尺度上均表现出特征性的整合偏好。本文详细介绍了一种实验方案：（1）利用连接介导的PCR（LM-PCR）扩增结合高通量测序（NGS）技术，构建多样化的逆转录病毒整合位点文库；（2）使用BEDTools比对每个病毒-宿主连接位点的基因组位置；（3）对数据进行统计学分析。从感染细胞中提取基因组DNA后，通过限制性内切酶消化或超声处理将其片段化。经过适当的DNA末端修复后，将双链接头连接至DNA末端，并使用与病毒长末端重复序列（LTR）及连接接头DNA互补的引物进行半巢式PCR扩增。PCR引物携带NGS过程中DNA簇生成所需的序列，因此无需额外进行接头连接。在进行NGS之前，需进行质量控制（QC），以评估DNA片段大小分布及接头DNA的连接情况。对测序输出文件筛选含有LTR的读段，并去除定义LTR和接头的序列。将修剪后的宿主细胞序列使用BLAT比对至参考基因组，并筛选与参考基因组中唯一位置具有至少97%序列一致性的结果。对唯一的整合位点进一步分析其邻近核苷酸（nt）序列以及相对于各类基因组特征的分布情况。采用本方案，可在三天内从基因组DNA构建出复杂度高的整合位点文库。因此，从易感细胞的外源性病毒感染到整合位点分析的完整流程可在约一至两周内完成。该技术的近期应用包括对HIV感染患者整合位点的纵向分析。

引言

病毒DNA（vDNA）整合到宿主细胞基因组中是逆转录病毒生命周期中的关键步骤。该过程由病毒编码的整合酶（IN）完成，此酶通过两种不同的催化反应，最终形成稳定插入的前病毒¹。IN亚基结合由逆转录生成的线性vDNA末端，形成一种高级结构的整合体（intasome），其中vDNA末端通过IN多聚体相互连接并稳定^2-4。IN在保守的5'-CA-3'序列下游对vDNA的3'端进行切割，这一过程称为3'-加工，使每个vDNA末端暴露出带有活性羟基的凹陷3'端^5-8。随后，整合体作为包含多种宿主与病毒蛋白的大分子复合物——前整合复合物（preintegration complex, PIC）的一部分被转运至细胞核内^9-11。当整合体接触到细胞内的靶DNA（tDNA）后，IN利用vDNA 3'端的羟基，以交错方式切割tDNA的上下两条链，并通过链转移反应将vDNA的3'端与tDNA的5'磷酸基团共价连接^12,13。

逆转录病毒在局部和全局尺度上均表现出整合位点偏好性。在局部，共识整合位点包含弱保守的回文结构tDNA序列，这些序列从vDNA插入位点上下游约5至10个碱基对（bp）范围内延伸^14,15。在全局层面，逆转录病毒靶向特定的染色质注释区域¹⁶。目前已知有七种不同的逆转录病毒属——α至ε、lenti（慢病毒属）和spuma（泡沫病毒属）....

方案

1. 生成病毒毒株

注意：本方案湿实验部分的流程图如图所示 图1病毒储存液的制备及其对组织培养细胞的感染细节通常适用于不同类型的逆转录病毒。在某些实验中，靶细胞可能不表达内源性病毒受体；在此类情况下，可构建携带异源病毒包膜糖蛋白的假型逆转录病毒颗粒， 例如 水疱性口炎病毒（VSV-G）的G糖蛋白将被用于感染 ^44,45.

注意：操作 HIV-1 时应采取预防措施。尽管各机构的具体指南可能有所不同，但所有基于病毒的操作均应在专用的、仅限操作人员使用的生物安全柜（通常称为组织培养罩）中进行。操作过程中必须始终穿戴适当的个人防护装备，包括面部防护、鞋套、双层手套和全身防护服。所有病毒相关实验产生的液体废物应使用漂白剂（终浓度 10%）灭活，所有废物（包括固体废物）在丢弃前均需高压灭菌处理。

1. 转染前一天，将 3.3 × 10⁶ 个 HEK293T 细胞接种于五块 100 mm 培养皿中，每皿加入 10 ml 添加了 10%（v/v）胎牛血清和 1%（v/v）青霉素/链霉素（10,000 U/ml 储液）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
   注意：此后所述的添加物培养基简称 DMEM-FPS。
2. 次日，使用市售转染试剂或磷酸钙法，将细胞转染携带全长逆转录病毒分子克隆的 10 µ....

结果

表4列出了一个代表性实验的结果，用以说明NGS在从感染细胞培养物中回收整合位点时的灵敏度。实验中使用未感染的细胞DNA对感染样本的基因组DNA进行系列稀释，该感染样本中平均每细胞含有一个整合事件⁴⁰。稀释过程以5倍为梯度，最高稀释至1:15,625。随后，对该滴定系列中的基因组DNA通过超声处理或使用限制性内切酶MseI和BglII进行消化，再进行片段化，接着进行LM-PCR。根据上述方案，计算出唯一整合位点的数量，以及映射到选定基因组注释区域附近的位点数量。数据分析显示，从理论上仅有1/15,625细胞被感染的细胞所构建的文库中，仍可回收数十个唯一的整合位点（约为纯基因组DNA回收数量的1-2%）。

在分析整合位点数据集时，必须将数据与一组匹配的随机基因组位点进行比较，该组位点称为匹配随机对照（matched random control, MRC）。由于代表性实验结果分别通过限制性酶切或超声处.......

讨论

本文描述了一种从初始病毒感染步骤到基因组整合位点分布图谱绘制的逆转录病毒整合位点分析方案。该方案适用于任何逆转录病毒及可感染的细胞类型。此外，该检测流程具有较高的灵敏度，能够从相当于以感染复数（MOI）为 6.4 × 10^-5 启动感染所获得的基因组 DNA 系列稀释样本中，回收到足够数量的唯一整合位点。这种高灵敏度使得该方案在应用于病毒载量较低的感染者样本时尤为有用，因为在这些样本中仅有少数细胞含有整合的前病毒。与本领域先前的方法学文献一致^36,38,41-43，本方案中生物信息学部分的多个步骤将受益于开发定制化脚本以处理大规模序列数据文件。尽管本方案中采用的序列比对工具为 BLAT⁵⁸，但用户可能会发现 Bowtie⁶⁷（http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml）是一个合适的替代选择。

最近报道了一种用于确定莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）整合位点的替代性生物信息学分析流程¹⁹。该流程的优势在于已被开发为公开可用的独立软.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	11965-084	适用于HEK293T细胞的标准细胞培养基
胎牛血清	赛默飞世尔科技	SH 30088.03	不同批次的血清可能需要预先筛选，以获得最佳的病毒产量
青霉素/链霉素	康宁	30-002-Cl	添加至DMEM的抗生素
磷酸盐缓冲液	Mediatech	21-040-CV	用于洗涤细胞
胰蛋白酶EDTA	康宁	25-053-CI	用于从组织培养板上解离贴壁细胞
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	DNA转染试剂
0.45 µm 滤光片	赛默飞世尔科技	09-740-35B	用于过滤含有病毒颗粒的细胞培养基
Turbo DNase	Ambion	AM2239	用于降解病毒储备液中的残留质粒DNA
HIV-1 p24抗原捕获检测	ABL公司	5447	用于定量病毒生产的产量
DNeasy 血液 & 组织试剂盒	Qiagen	69506	用于从细胞中纯化基因组DNA
超声波破碎仪	Covaris	S2	使用该型号超声波破碎仪进行两轮处理，工作周期为5%，强度为3，每脉冲周期数为200，时间为80秒
无核酸酶水	GeneMate	G-3250-125	建议使用市售水以降低样品交叉污染的可能性
QIAQuick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28106	用于文库构建过程中纯化 DNA
End-It DNA末端修复试剂盒	Epicentre	ER81050	用于修复经超声处理的DNA样本的DNA末端
Klenow片段（3'-5'外切酶）–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	与 dATP 一起用于对修复后的 DNA 片段进行 A 尾修饰
dATP	赛默飞世尔科技	R0141	脱氧腺苷三磷酸
MseI	NEB	R0525L	基因组DNA切割用限制性内切酶
BglII	NEB	R0144L	限制性内切酶抑制上游HIV-1 U5序列的扩增
T4 DNA连接酶	NEB	M0202L/6218	用于共价连接相容性DNA末端的酶
DNA寡核苷酸	Integrated DNA Technologies	定制	让公司对寡核苷酸进行纯化。DNA 的纯化采用 HPLC 纯化即可 <30 个核苷酸；长链 DNA 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化
Advantage 2 聚合酶混合液	Clontech	639202	含PCR用DNA聚合酶的商用混合液
dNTPs（100 mM 溶液）	赛默飞世尔科技	R0181	在冰上用无菌水将四种化学物质稀释，使其每种dNTP的中间工作浓度均为2.5 mM
NanoDrop	赛默飞世尔科技	NanoDrop 2000	用于测定DNA浓度的分光光度计
Qubit 荧光仪	Life Technologies	Qubit® 3.0	用于确认整合位点文库DNA浓度的荧光计
2200 TapeStation 系统	安捷伦	G2964AA	基于胶带的检测法以确认整合位点文库DNA片段大小分布
MiSeq	Illumina	SY-410-1003	用于NGS