Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии

Lorenzo Lunelli; Paola Bernabò; Alice Bolner; Valentina Vaghi; Marta Marchioretto; Gabriella Viero

doi:10.3791/53851

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии

8.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53851

⸱

16 марта 2016 г.

Lorenzo Lunelli¹ , Paola Bernabò² , Alice Bolner² , Valentina Vaghi¹ , Marta Marchioretto² , Gabriella Viero²

¹Laboratory of Biomolecular Sequence and Structure Analysis for Health, Fondazione Bruno Kessler, ²Institute of Biophysics, CNR Unit at Trento

В этой статье

Краткое содержание

В то время как структура рибосом была широко охарактеризована, организация полисом все еще недостаточно изучена. Чтобы восполнить этот недостаток знаний, мы представляем здесь подробный протокол подготовки к точной визуализации полисом млекопитающих с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) в воздухе и жидкости.

Аннотация

Поступательное машины, т.е. полисом или polyribosome, является одним из самых больших и самых сложных механизмов в цитоплазме клеток. Полисомы, образованные рибосом, мРНК, несколько белков и некодирующих РНК, представляют собой интегрированные платформы, на которых трансляционные элементы управления имеют место. Тем не менее, в то время как рибосома широко изучается, организация полисом до сих пор отсутствует полное понимание. Так много усилий требуется для того, чтобы выяснить полисом организации и любой новый механизм трансляционной управления, который может быть встроен. Атомно-силовой микроскопии (AFM) представляет собой тип сканирующей зондовой микроскопии, который позволяет приобретение 3D-изображений с разрешением наноуровне. По сравнению с методами электронной микроскопии (ЭМ), одним из главных преимуществ AFM является то, что он может получить тысячи изображений, как в воздухе, так и в растворе, что позволяет образца, который должен поддерживаться в условиях, близких физиологических условиях, без какой-либо необходимости для окрашивания и фиксации процедуры. Здесь подробный протокол для точной очистки полисом от мышиного мозга и их осаждении на слюде подложках описан. Этот протокол позволяет полисом визуализации в воздухе и жидкости с AFM и их реконструкции в виде трехмерных объектов. В дополнение к крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), предложенный метод может быть легко использован для систематического анализа полисом и изучения их организации.

Введение

Синтез белка является наиболее энергоемким процессом в клетках ^1,2. Следовательно, не удивительно , что белковые содержаний в основном контролируются на поступательными , а не транскрипционной ^3,4,5 уровня. Полисом является фундаментальным макромолекулярная компонентом, который преобразует информацию мРНК в функциональных белковыми считываниями. Полисомы до сих пор признается в качестве макромолекулярных комплексов , где несколько поступательных управления сходящихся ^6-13. Несмотря на сотни исследований структуры рибосом ^{14- 16,} детальные молекулярные способность проникновения в суть динамики перевода и топология полисом об....