Abstract
آلية متعدية، أي polysome أو polyribosome، هي واحدة من أكبر وأعقد الأجهزة هيولي في الخلايا. Polysomes، التي شكلتها الريبوسومات، من mRNAs، عدة بروتينات والرنا غير الترميز، تمثل منصات حيث تأخذ الضوابط متعدية مكان متكاملة. ومع ذلك، في حين أن الريبوسوم وقد درس على نطاق واسع، وتنظيم polysomes لا تزال تفتقر إلى فهم شامل. وبالتالي مطلوب بذل الكثير من الجهد من أجل توضيح منظمة polysome وأي آلية جديدة للتحكم متعدية التي قد تكون جزءا لا يتجزأ. مجهر القوة الذرية (AFM) هو نوع من المجهر التحقيقي الذي يسمح اقتناء الصور 3D في قرار النانو. مقارنة مع المجهر الإلكتروني التقنيات (EM)، واحدة من المزايا الرئيسية لAFM هو أنه يمكن الحصول على الآلاف من الصور سواء في الهواء وفي حل، مما يتيح للعينة إلى الحفاظ عليها في ظل الظروف الفسيولوجية بالقرب من دون أي حاجة لتلطيخ وتحديد المواليةcedures. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة لتنقية دقيقة من polysomes من دماغ الفأر وترسبها على ركائز الميكا. يتيح هذا البروتوكول التصوير polysome في الهواء والسائل مع فؤاد وإعادة البناء ككائنات ثلاثية الأبعاد. مكملة لالمجهري البرد الإلكترون (البرد م)، والطريقة المقترحة يمكن استخدامها بسهولة لتحليل منهجي polysomes ودراسة منظمتهم.
Introduction
تخليق البروتين هو الأكثر عملية استهلاك الطاقة في الخلايا 1،2. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن الكميات المتوفرة من البروتين يتم التحكم بشكل رئيسي في متعدية بدلا من 3،4،5 مستوى النسخي. وpolysome هو العنصر الجزيئات الأساسي الذي يحول المعلومات مرنا في قراءات البروتينية وظيفية. وبالتالي الاعتراف Polysomes بقدر المجمعات الجزيئات حيث تلتقي عدة ضوابط متعدية 6-13. على الرغم من مئات من الدراسات حول بنية الريبوسوم 14- 16، ورؤى الجزيئية مفصلة في ديناميات الترجمة وطوبولوجيا polysomes واجه الفائدة محدودة. ونتيجة لذلك، وتنظيم الأصلي مجمع polysomal بروتين نووي ريبوزي وتأثيره المحتمل على الترجمة لا تزال القضايا غامضة نوعا ما. Polysomes قد يخفي ما زالت المنظمات أمر وظيفية غير معروفة، ويحتمل أن يعكس ما جسيم نووي وكنترول جينيةوقد مثلت ليرة سورية للمجال النسخ. في الواقع، والتحقيق في هذه الفرضية المثيرة يتطلب دراسات إضافية والنهج التقنية الجديدة. في هذا الخط، وتقنيات الهيكلية ومجهر القوة الذرية قد تعاون مثمر لكشف آليات جديدة للسيطرة على التعبير الجيني، على غرار ما تم تحقيقه لجسيم نووي 17،18.
منذ اكتشاف الريبوسوم 14-16، اتسمت هيكلها على نطاق واسع في بدائيات النوى 19،20، الخميرة 21 ومؤخرا في 22 البشري، وتوفير وصف الجزيئي للآليات على قاعدة من تخليق البروتين. واعترف Polysomes في البداية على غشاء الشبكة الإندوبلازمية، وتشكيل منظمات الهندسية 2D النموذجية 14. كما ذكرت من قبل، لم يكن polysome الجمعية الكائن من الفائدة ثابتة كما بنية الريبوسوم. في الماضي، وقد تم دراسة polysomes أساسا عن طريق آرتقنيات ansmission EM المستندة. إلا في الآونة الأخيرة، مكنت تقنيات البرد EM إعادة الإعمار 3D من polysomes تنقيته من في المختبر أنظمة الترجمة 23-26، لست] الخلوية الإنسان 27 أو في خلايا 28. هذه التقنيات عرضت معلومات أكثر دقة حول تنظيم الريبوسوم الريبوسوم في polysomes 23، 26-28، ووصف الجزيئي الأولي من الأسطح الملامسة للريبوسوم المجاورة في polysomes جنين القمح 24. وهكذا، البرد EM التصوير المقطعي يسمح الكشف عن التفاعلات الريبوسوم الريبوسوم مع التفاصيل الجزيئية، ولكن مثقلة من قبل مرحلة ما بعد المعالجة واسعة النطاق وإعادة الإعمار ويحلل التي تتطلب موارد الحسابية الثقيلة من أجل معالجة البيانات. وعلاوة على ذلك، للحصول على التفاصيل الجزيئية من التفاعلات الريبوسوم الريبوسوم، مطلوب خريطة حل للغاية من الريبوسوم، وهذا النوع من الريبوسوم المرجعي هو متاح فقط لعدد قليل من الأنواع. الأهم من ذلك، البرد EM التصوير المقطعي ليست قادرة على الكشف عن الحمض النووي الريبي مجانا. Therefخام، يطلب من التقنيات الجديدة إلى فهم كامل للتنظيم آلية الترجمة.
بجانب البرد EM، واستخدمت AFM أيضا أداة مفيدة للتصوير المباشر من polysomes في حقيقيات النوى أقل 29-33 والبشر (27). مقارنة EM، AFM لا يتطلب أي تثبيت عينة أو وضع العلامات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء قياسات في الظروف الفسيولوجية القريب ومع إمكانية فريدة للتعرف بشكل واضح على حد سواء الريبوسومات وجدائل الحمض النووي الريبي المجردة 27. تصوير polysomes واحد لا يمكن أن يؤديها بسرعة نسبيا، والحصول على الآلاف من الصور في النانو قرار مع القليل من الجهد مرحلة ما بعد المعالجة بالمقارنة مع مرحلة ما بعد المعالجة واسعة النطاق والثقيلة وإعادة الإعمار التحليلات المطلوبة بواسطة المجهر البرد EM. ونتيجة لذلك، AFM معالجة البيانات وتحليلها ليست في حاجة محطات العمل باهظة الثمن وقوة الحوسبة عالية. على هذا النحو، فإن هذا الأسلوب يجمع معلومات عن الأشكال polysomal، والخصائص المورفولوجية (مثلارتفاع وطول وعرض)، كثافة الريبوسوم، وجود الحمض النووي الريبي الحرة وعدد من الريبوسومات في polysome 27 مع إنتاجية أعلى من البرد EM. في هذه الطريقة، AFM يمثل طريقة فعالة ومكملة لتقنيات EM لتصوير polysomes 27.
هنا نقدم خط أنابيب الكامل من تنقية لتحليل البيانات حيث يتم تطبيق AFM إلى صورة وتحليل polysomes مخ الفأر. ويركز البروتوكول المقترح حول القضايا تنقية وعلى ترسب دقيقة من polysomes على ركائز الميكا التي تستخدم للتصوير فؤاد. بالإضافة إلى تحليل الجزيئات التقليدية التي يمكن القيام بها بسهولة مع برنامج مشترك يستخدمها المجتمع AFM، المساعد يماغيج 34، ودعا RiboPick، وقدم لحساب عدد من الريبوسومات في polysome 27، 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الممارسات المستخدمة للحصول على الأنسجة الماوس عن طريق الهيئة لحماية الحيوانات (OPBA) من جامعة ترينتو (إيطاليا)، والبروتوكول رقم 04-2015، المرسوم وفقا art.31 التشريعي رقم 26/2014. تمت المحافظة على جميع الفئران في مرفق نموذج حي لمركز البيولوجيا التكاملية (CIBIO)، جامعة ترينتو بإيطاليا.
تحذير: لتجنب أي تدهور الحمض النووي الريبي من العينات، وإعداد جميع المخازن باستخدام المياه المعالجة DEPC لتقليل التلوث ريبونوكلياز.
1. إعداد Polysomes من أدمغة كامل
- جمع أنسجة المخ (15 دقيقة)
- الموت ببطء من نوع السلالة البرية الماوس C57BL / 6 مع CO 2 اختناق لمدة 5 دقائق (36). بعناية تشريح الدماغ من الجمجمة من 36، ووضع الأنسجة في أنبوب 1.5 مل وعلى الفور وضعها في النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- إعداد المحللة (30 دقيقة)
- سحق أنسجة المخ بأكملها باستخدامقذيفة هاون ومدقة تحت النيتروجين السائل.
- نقل مسحوق حوالي 25 ملغ إلى أنبوب microcentrifuge البارد وعلى الفور (لتجنب ذوبان النسيج المسحوق) إضافة 0.8 مل من الاحتياطي تحلل (انظر الجدول 1) وتعطيل الخلايا التي pipetting صعودا وهبوطا 25 مرات بسرعة.
- أنبوب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوية.
- طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديد والحفاظ على أنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- أنبوب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير نوى والميتوكوندريا.
- طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديد.
- تخزين طاف في -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر أو استخدامه على الفور.
- إعداد التدرج السكروز والطرد المركزي (2 ساعة و 30 دقيقة)
- غسل أنابيب نابذة فائقة السرعة على نطاق واسع مع ريبونوكلياز خالية من المياه (diethylpyrocarbonate المياه المعالجة (DEPC المياه) أو تجارية) لد 3٪ H 2 O 2 / DEPC H 2 O الحل.
- وضع أنابيب على الجليد وإضافة 5.5 مل من البرد محلول السكروز 50٪ في الجزء السفلي من كل أنبوب (انظر الجدول رقم 1 لحلول السكروز). بعناية إضافة 15٪ السكروز قطرة قطرة الحل، والبقاء على مقربة من الطور البيني من أجل الحفاظ على البيني حاد، حتى يتم ملء الأنبوب تماما. عندما يتم ملء الأنبوب تماما، إغلاقه مع سدادة مطاطية لتجنب تشكيل فقاعة الهواء.
- في غرفة باردة وضع بلطف أسفل الأنابيب أفقيا والحفاظ عليه في هذا المنصب لمدة 2 ساعة. بعد هذا الوقت، وتصويب ببطء الأنابيب مرة أخرى إلى الوضع الرأسي ووضعها على الجليد. التدرجات هي الآن جاهزة للاستخدام. بدلا من ذلك، وإعداد التدرج السكروز 15-50٪ باستخدام التدرج التقليدي السابق.
- في غرفة باردة إزالة بعناية 1.0 مل من أعلى التدرج وتراكب قطرة قطرة السكروز مع المحللة عصاري خلوي (أي طاف الحصول عليها في الظريفص 1،2).
- خفض بعناية الأنابيب في دلاء من الدوار الدلو المتأرجح. أجهزة الطرد المركزي التدرجات لمدة 100 دقيقة في 180000 x ج في 4 درجات مئوية باستخدام نابذة.
- بعد الطرد المركزي، وترك الأنابيب في الدلاء لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية للسماح للالتدرجات استقرار.
- تجزئة التدرج السكروز (2 ساعة)
- إزالة بعناية أنبوب نابذة واحد من الدوار نابذة وتركيبها على الجهاز جامع من التدرج الكثافة نظام التقطير. جمع 1 مل كسور مراقبة الامتصاصية في 260 نانومتر مع الأشعة فوق البنفسجية / VIS مجسات (انظر الشكل 1 لوحة العليا). الحفاظ الكسور التي تم جمعها على الجليد.
- إعداد aliquots من 30-40 ميكرولتر من الكسور من الفائدة، والاحتفاظ بها على الجليد قبل تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تستخدم قسامات أو كسور السكروز الذي خضع لأكثر من دورتين تجميد لاذابة (انظر الشكل 1 أقل لوحة).
2. إعداد نموذج لمجهر القوة الذرية (3 ساعات)
- باستخدام الشريط، تقشر ورقة الميكا.
- تغسل أوراق الميكا 3-4 مرات مع DEPC المياه ووضعه في طبق بتري صغيرة. ثم يجف السطح باستخدام الهواء.
- تغطية الميكا مع 200 ميكرولتر من 1 ملم NISO 4 واحتضان لمدة 3 دقائق على RT.
- إزالة حل النيكل ثم يجف السطح باستخدام الهواء. تنفيذ جميع الخطوات المستقبلية في 4 درجات مئوية عن طريق وضع طبق بتري مع الميكا على الجليد.
- ذوبان الجليد قسامة التي تم الحصول عليها في 1.4.2 على الجليد وإضافة بلطف كل قطرة قطرة عينة على الميكا. باستخدام ميكرولتر طرف 100-200، وانتشار العينة على كامل سطح الميكا. احتضان العينة على الجليد لمدة 3 دقائق.
- تغطية انخفاض رقة الميكا قطرة مع 200 ميكرولتر الباردة العازلة-AFM (انظر الجدول 1)، واحتضان لمدة 1 ساعة على الجليد.
- التصوير في السائل
- إزالة بعناية العازلة-AFM وتغسل الأوراق الميكا 3-4 مرةالصورة مع 200 ميكرولتر الباردة العازلة-AFM لإزالة السكروز الزائد. ثم تغسل الأوراق الميكا 3 مرات مع الحل غسل الباردة (انظر الجدول 1)، وترك على سطح الميكا من قبل بعض ميكرولتر من محلول المغطاة.
- الذهاب إلى نقطة 3 (الحصول على الصور).
- التصوير في الهواء
- إزالة بعناية العازلة-AFM وغسل الميكا 3-4 مرات مع 200 ميكرولتر الباردة العازلة-AFM لإزالة السكروز الزائد. ثم، وغسل الميكا 3 مرات مع الحل غسل الباردة (انظر الجدول 1)، واستنزاف المياه الزائدة باستخدام الورق.
- ترك العينة لتجف تحت غطاء الكيميائية مع الجزء العلوي من طبق بيتري مفتوحة جزئيا. بعد 2 ساعة، أغلق طبق بتري وتخزينها في RT. قياس العينة بعد 2-3 ساعة كما أنها مستقرة لسنوات.
3. الحصول على الصور (15 دقيقة لكل صورة بعد الاستقرار الحراري)
ملاحظة: Polysomes ثبتوا على الميكا يمكن تصوير في الهواء أو في السائل، وذلك باستخدام وضع AC.
- إرفاق الميكا لصاحب العينة باستخدام الشريط على الوجهين.
- إدراج صاحب العينة في المرحلة التالية AFM توجيهات المصنع. عندما التصوير في السائل، إذا كان ذلك ممكنا، في محاولة للحفاظ على العينة في درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية إلى زيادة polysome الاستقرار في الوقت المناسب.
- حدد ناتئ مناسبة للتصوير AC وتركيبها على حامل طرف التالية توجيهات المصنع. هنا، استخدام الكابولي مع قوة ثابتة بين 2-20 نيوتن / متر للتصوير الجوي ونحو 0.1 نيوتن / متر للتصوير السائل.
- ضبط بقعة الليزر على ناتئ والصفر إشارات كاشف رباعي.
- تحديد تردد القيادة المناسب ودفع ناتئ مع اتساع 10-20 نانومتر.
- الاقتراب من عينة حتى يمارس طرف السطح.
- حدد منطقة المسح الضوئي من ميكرون 2X2، والحصول على ما لا يقل عن 512x512 بكسل الصور (عرض بكسل <4 نانومتر)، حدد الحية وضع خلفية الطرح ونطاق Z من 20-25 نانومتر.
- تفقد رانه صورة تبحث عن وجود أجسام مستديرة تتميز ارتفاع ما بين 10 و 15 نانومتر عند الحصول في الهواء و 25 و 30 نانومتر عندما تكون في السائل وعرض في نطاق 25-30 نانومتر. ضبط المعلمات المضبوطة مسبقا وردود الفعل حتى يتم تصور الأشياء الحادة. يجب أن تظهر خلفية مسطحة نسبيا في عينات جيدة، مع بعض الكائنات ارتفاع 2-4 نانومتر (انظر الشكل 2A وباء).
- إذا كانت الصورة تبدو جيدة (كما هو مبين في النقطة 3.8)، والحصول على عدة (عشرة على الأقل) بمسح 2X2 ميكرون في المناطق عينة مختلفة.
- (اختياري). إذا لزم الأمر، والحصول على صور عالية الدقة من polysomes مختارة (انظر الشكل 2C).
- تطبيق التصحيحات البرمجيات (الطرح الطائرة وخوارزميات تصحيح خط سطرا) لتصحيح الصور AFM إزالة الميل التعسفي والانجراف الآثار.
4. تحليل البيانات (30 دقيقة لكل صورة)
- تصدير الصور في ImageJ (اختياري: تطبيق عامل المقياس) preferentially باستخدام تنسيق الضياع، على سبيل المثال، تنسيق TIFF (انظر الشكل 3A).
- استخدام يماغيج RiboPick.ijm مجموعة أدوات الماكرو (ليتم نسخها في دليل فرعي ماكرو / مجموعة أدوات يماغيج) لحساب الريبوسومات في polysomes (انظر الشكل 3B) وحساب الخصائص الإحصائية للعينة (انظر الشكل 3C).
- بدء تحميل صورة باستخدام <مقروءة صورة> أداة تهيئة البرنامج.
- اختيار مراكز الريبوسوم مع القياسية <اختيار نقطة> يماغيج أداة (التحول + فوق اليسار يسمح متعددة اختيار من الريبوسومات). بمناسبة الريبوسومات المحدد مع <الريبوسومات الأقسام> أداة. ستظهر الإحداثيات الريبوسوم في إطار نص مخصص.
- إضافة المزيد من الريبوسومات إلى نفس polysome تكرار الإجراء المشار إليها في النقطة 4.2.2.
- إزالة الريبوسومات ملحوظ خطأ باستخدام <التراجع عن اختيار الماضي> أداة (يبدأ إزالة من الريبوسوم وأضاف الماضي لأول واحد212؛ في polysome الحالي فقط).
- عند اكتمال polysome، استخدم <polysome جديدة> أداة. كما تم إضافة عدد polysome كغطاء لصورة، يتم تحديث نافذة النص.
- استخدام <حفظ النتائج وعلى مقربة> لكتابة الريبوسوم تنسيق ملف (تستخدم وحدات الافتراضي للصورة) وصورة PNG تلخص الريبوسومات وpolysomes واختار. يتم إغلاق الصورة الأصلية دون حفظها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
السكروز التنميط التدرج polysomal من كله مخ الفأر
فمن الممكن لتنقية polysomes من المحللة الخليوي عن التنميط polysomal، الذي يفصل بين الجزيئات وفقا للوزن والحجم. مع التنميط polysomal، لست] حشوية تم الحصول عليها من الخلايا المستنبتة أو الأنسجة، كما هو الحال في هذا المثال، يتم تحميلها على التدرج السكروز الخطية ومعالجتها من قبل تنبيذ فائق لفصل الحمض النووي الريبي خالية من 40S و 60S مفارز، ريبوسوم 80S وpolysomes وفقا لمعاملات الترسب منها ( الرقم 1 لوحة العليا). الامتصاصية للعينة في 254 نانومتر، وجمع جزء تمكين عزل جزء السكروز المخصب في الريبوسومات أو polysomes مع عدد مختلف من الريبوسومات في النص. الكسور يمكن جمعها، aliquoted للتصوير AFM وتخزينها في -80 درجة مئوية (الشكل 1اللوحة السفلى).
polysomes الأصلي من مخ الفأر التي لاحظها فؤاد في الهواء تكشف التفاعلات الريبوسوم ضيقة
يتم تنفيذ الحصول على الصور باستخدام وضع AC (المعروف أيضا باسم وضع التنصت). هذه الطريقة هي مناسبة خاصة لتصوير عينات الناعمة (مثل polysomes) لأن التفاعل طرف عينة وقوى القص المقابلة تقلص إلى حد كبير. وبهذه الطريقة يتم الحفاظ على كل من طرف والعينة. فؤاد التصوير يسمح الحصول على البيانات بدقة عالية، مع القيم الصحيحة التي تعتمد على عوامل مختلفة، مثل شروط القياس، وهذا النوع من غيض، وخصائص العينة. في الشروط المذكورة في هذه الورقة قرار الجانبي من حوالي 4-6 نانومتر، واستبانة عمودية من 0.1-0.2 نانومتر ويمكن بلوغه. بعد خلع قسامات السكروز على الميكا، ويوفر AFM أوصاف polysomes واحدتظهر على هيئة بقع الريبوسومات معبأة بإحكام (الشكل 2A، C و C). من خلال تحليل المقطع العرضي (الشكل 2D)، وارتفاع قمم الريباسي حوالي 14 نانومتر وفقا لما تم ملاحظته بالنسبة لريبوسوم الإنسان في polysomes بعد تجفيف الهواء (27). مركز لمسافة مركز الريبوسومات التي حددها الشخصي الخط هو 23 نانومتر، وهو ما يتفق مع البعد من الريبوسومات في حل 37 و 38.
يظهر عدد من الريبوسومات في polysome من جزء واحد توزيع فرقت أحادية
الشكل 3A تقارير صورة فؤاد النموذجية التي تم الحصول عليها عن طريق الحصول على عينة استيعابها على الميكا من جزء صغير من التدرج السكروز. يظهر أقحم تقريب رقمي من polysome واحد، مع عامل التكبير مناسبة لتحديد ribosOMES في polysome. يظهر اللوحة ب نفس الصورة بعد تحديد الريبوسوم مع الماكرو RiboPick. الدوائر الحمراء (انظر الشكل) بمناسبة الريبوسومات، ويستخدم عدد التقدمية (السماوي) لمساعدة جمعية الريبوسوم تنسق مع polysome محددة. تم تحليل توزيع تردد عدد من الريبوسومات في polysome للجزء رقم 10 (انظر Figure1، اللوحة السفلى، الموافق polysomes متوسط الوزن الجزيئي (MMW))، مما يدل بوضوح ذروة واحدة (لوحة C، القضبان الرمادية). تم تركيب توزيع التجريبية مع منحنى جاوس (الخط الأسود) الذي كان مركزه في 5.8 الريبوسومات / polysome، مع انحراف معياري 1.3 الريبوسومات / polysome.
الشكل 1. التعريف الامتصاصية الممثل للترسيب التدرج السكروز من كله مخ الفأر. (ص العلويتم الحصول على آنيل) وpolysomal المحللة حشوية من الدماغ P27 الماوس وتحميلها على خطي التدرج السكروز (15-50٪ سكروز [ث / ت]). ومن الممكن أن نلاحظ قمم واضحة الموافق الامتصاصية في 254 نيوتن متر من RiboNucleoParticles (RNP)، مفارز الريباسي (40S و 60S)، الريبوسومات (80S) وpolysomes. لتجنب تجميد المتكررة وذوبان الجليد دورات العينات قبل AFM ترسب على الميكا، وأنها مريحة لتقسيم إلى قسامات كلا جزء الريبوسوم وكسور polysomal (اللوحة السفلى) مع عدد مختلف من الريبوسومات في نسخة (أي المنخفضة والمتوسطة والعالية -molecular الوزن polysomes (LMW، MMW، وHMW، على التوالي)). يمكن تخزين aliquots في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين.
الشكل 2. صور polysomes الدماغ عن طريق التنصت-وضع مجهر القوة الذرية (أ) مثال على صورة فؤاد من MMW بولي الدماغsomes بعد امتصاص على الميكا باستخدام الخطي مقياس الرمادي اللون. ويصور (ب) نفس الصورة المعروضة في الفقرة (أ) باستخدام مختلف Z-نطاقات مقياس اللون: 0-0،5 نانومتر الرمادي لخلفية، 0.5-2 نانومتر، و2-10 الصفراء نانومتر لالريبوسومات. في هذه الحالة يتم الحصول على النقيض من أفضل البصرية لكلا الكائنين Z المدى المنخفضة والعالية. (C) التكبير من polysome MMW نموذجي مع المقطع العرضي الملف (الخط المتقطع الأبيض). يظهر الملف (D) ارتفاع اثنين الريبوسومات التي يحددها المقطع العرضي الشخصي في (ج) ارتفاع الريبوسوم من 14 نانومتر. هذه القيمة هي متوافقة مع ما لوحظ سابقا في AFM للريبوسوم الإنسان في polysomes 27.
الشكل 3. مثال على حساب عدد من الريبوسومات في polysome في polysomes الدماغ MMW. (أ) صورة فؤاد أن ممثلى أعضاءsents مدخلات الماكرو يماغيج، RiboPick. (ب) بعد حصوله يدويا في كل الريبوسومات في polysome، علامات RiboPick في صورة موقف كل الريبوسوم (الدوائر الحمراء). (ج) عدد التي تم الحصول عليها من الريبوسومات في polysomes يمكن رسم كتوزيع التي يمكن تركيبها مع منحنى جاوس. عدد polysomes يعتبر في هذا المثال هو 164، تم الحصول عليها من 9 صور مستقلة. تركيب مع منحنى جاوس إرجاع القيمة المتوسطة من سكان polysomes في جزء MMW (# الريبوسومات / polysome 5.8 ± 1.3، R 2 = 0.99).
| عازلة | تركيب | تطبيق |
| تحلل العازلة | 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5 | إعداد المحللة (1.1) |
| 10 ملي كلوريد الصوديوم | ||
| 10 ملي MgCl 2 | ||
| 1٪ تريتون-X100 | ||
| 1٪ نا deoxycholate | ||
| 0.4 U / مل ريبونوكلياز المانع | ||
| 1 ملم DTT | ||
| 0.2 ملغ / مل سيكلوهيكسيميد | ||
| 5 U / مل الدناز أنا | ||
| 50٪ محلول السكروز | 50٪ (ث / ت) السكروز في | إعداد التدرج السكروز (1.2) |
| 100 مم كلوريد الصوديوم | ||
| 10 ملي MgCl 2 | ||
| 10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة | ||
| 15٪ محلول السكروز | 15٪ (ث / ت) السكروز في | إعداد التدرج السكروز (1.2) |
| 100 مم كلوريد الصوديوم | ||
| 10 ملي MgCl 2 | ||
| 10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة | ||
| النيكل الحل | 1 ملم NISO 4 | إعداد نموذج لفؤاد (2) |
| العازلة AFM | 100 مم كلوريد الصوديوم | إعداد نموذج لفؤاد (2) |
| 10 ملي MgCl 2 | ||
| 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد | ||
| 10 ملي HEPES | ||
| 3٪ (ث / ت) والسكروز، ودرجة الحموضة = 7.4 | ||
| غسل الحل | DEPC المياه | إعداد نموذج لفؤاد (2) |
| 100 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد | ||
الجدول 1. المخازن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما ثبت بنية الحمض النووي أن تكون ذات أهمية قصوى لوصف عملية النسخ وباعتبارها المنظمة من لونين تفاهمنا السيطرة النسخي التعبير الجيني، فمن الضروري تحليل تنظيم وهيكل polysomes لتحسين الفهم الصادق الترجمة وتنظيمها.
مع بروتوكول وصفها، في كثافة الأمثل للpolysomes يجمد بلطف على سطح مستو، ويتم الحصول مناسبة للتصوير فؤاد. باستخدام هذه الشروط مع عينات أعدت مريح، ما يقرب من 50 polysomes في الساعة يمكن الحصول عليها، وعلى استعداد لإجراء المزيد من التحليلات والتوصيف. وعلاوة على ذلك، فقد أثبتت العينات المجففة المخزنة في RT لتكون مناسبة للتصوير بعد أكثر من سنة واحدة.
للحصول على صور polysome بنجاح مع بروتوكول لدينا، هناك بعض الخطوات الحاسمة: لاستخدام الأنسجة التي تم بشكل صحيح فلاش تجميدها على الفور بعد dissectioن وتخزينها في -80 درجة مئوية للحد من تدهور الحمض النووي الريبي. استخدام تحلل العازلة التي تحتوي على سيكلوهيكسيميد وريبونوكلياز مثبطات لتجنب التفكك الريبوسوم من مرنا. لأداء جميع حضانات على الجليد خلال ترسب العينة على الميكا. وعند إعداد نموذج للتصوير AFM على الهواء، لغسل نطاق واسع العينة على الميكا مع مخازن وريبونوكلياز المياه مجانا في وجود سيكلوهيكسيميد. النقطة الأخيرة أهمية خاصة. إذا ظهرت صورة لاحتواء الأسطح الملساء تقريبا في الارتفاع الصحيح ولكن 100-1،000 نانومتر واسعة، وهذا هو مؤشر واضح على عينة سيئة غسلها (غالبا الريبوسومات / polysomes يمكن يزال يمارس إذ يغشى الكائنات المضمنة،). وهناك طريقة لحل هذه المشكلة هو تكرار إجراء الغسيل، ولكن هذا لا عادة تخفيف المشكلة على عينة المجففة بالفعل. في هذه الحالة يجدر البدء مرة أخرى مع قسامة جديدة.
ونظرا لقرار من AFM، وهذه الطريقة لpolysomes دراسة لا يمكن حل strucتفاصيل تورال من واجهات الريباسي في polysomes. في الواقع، AFM هو اتباع نهج متكامل وأبسط لالبرد EM، وهو ما يمثل تقنية فعالة وقوية، لاكتساب وتحليل آلاف من polysomes، وفهم أفضل للمنظمة الريبوسوم الشاملة في polysomes. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول لديه ميزة فريدة من تحديد خيوط متوافقة مع الحمض النووي الريبي (27). هذا الإجراء نفسه يمكن استخدامها في أي عينة polysomal تم الحصول عليها من أي نوع من الأنسجة البيولوجية أو خط الخلية. والأهم من ذلك أنه يمكن أيضا أن تستخدم بنجاح للحصول على معلومات نص معين استخدام في أنظمة الترجمة المختبر، كما تبين مؤخرا من لوريا وزملاء العمل 35. وهذه المنهجية يمهد الطريق أمام العديد من التجارب، لاكتساب فهم حركية polysome تشكيل أو التغييرات في المؤسسة polysome تحت مختلف الظروف الخلوية أو الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
