Abstract
Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l'organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l'acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l'imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.
Introduction
La sintesi delle proteine è la più processo consumo di energia nelle cellule 1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che 3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono 6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi 14- 16, le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l'organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l'indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell'espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma 17,18.
Dalla scoperta del ribosoma 14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti 19,20, lievito 21 e più recentemente in umano 22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici 14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione 23-26, lisati cellulari umani 27 o 28 nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull'organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi 23, 26-28 e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano 24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l'RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l'organizzazione della macchina di traduzione.
Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l'imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori 29-33 e gli esseri umani 27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l'etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi 27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l'analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome 27 con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi 27.
Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l'analisi dei dati in cui AFM viene applicata all'immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l'imaging AFM. Oltre all'analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ 34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome 27, 35.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le pratiche utilizzate per ottenere i tessuti di topo sono stati approvati dal corpo per la protezione degli animali (OPBA) dell'Università degli Studi di Trento (Italia), il protocollo n. 04-2015, il decreto di cui al art.31 legislativo n. 26/2014. Tutti i topi sono stati mantenuti al Organismo modello Struttura del Centro per la Biologia Integrata (CIBIO), Università degli Studi di Trento, Italia.
Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell'RNA dei campioni, preparare tutti i buffer con acqua DEPC trattati per ridurre al minimo la contaminazione RNasi.
1. Preparazione di polisomi da Brains Interi
- Raccolta di tessuti cerebrali (15 min)
- Euthanize wild-type ceppo di topi C57BL / 6 con CO 2 asfissia per 5 min 36. Sezionare accuratamente il cervello dal cranio 36, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml e metterlo immediatamente in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparazione del lisato (30 min)
- Polverizzare l'intero tessuto cerebrale utilizzandoun mortaio e pestello sotto azoto liquido.
- Trasferire circa 25 mg di polvere in una provetta fredda e immediatamente (per evitare lo scongelamento del tessuto polverizzato) aggiungere 0,8 ml di tampone di lisi (vedi Tabella 1) e disturbare la cella pipettando su e giù 25 volte rapidamente.
- Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 1 min a 4 ° C per sedimentare detriti cellulari.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta e mantenere il tubo in ghiaccio per 15 min.
- Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 5 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e mitocondri.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
- Conservare il supernatante a -80 ° C per un massimo di 6 mesi o utilizzare immediatamente.
- Saccarosio preparazione gradiente e centrifugazione (2 ore e 30 min)
- tubi ultracentrifuga Lavare a lungo con RNase-free acqua (acqua trattata dietilpirocarbonato (DEPC-acqua) o commerciale) di und 3% H 2 O / DEPC H soluzione 2 O 2.
- Mettere i tubi in ghiaccio e aggiungere 5,5 ml di soluzione di saccarosio al 50% freddo nella parte inferiore di ciascun tubo (vedi Tabella 1 per soluzioni di saccarosio). Aggiungere con cautela la caduta di soluzione di saccarosio al 15% a goccia, rimanendo vicino al interfase per preservare un interfase tagliente, finché il tubo sia completamente riempito. Quando il tubo viene riempito completamente, chiuderla con un tappo di gomma per evitare la formazione di bolle d'aria.
- In una stanza fredda delicatamente fissare i tubi in orizzontale e tenerlo in questa posizione per 2 ore. Trascorso questo tempo, lentamente raddrizzare i tubi nella posizione verticale e metterli in ghiaccio. I gradienti sono ora pronti per essere utilizzati. In alternativa, preparare il gradiente di saccarosio 15-50% utilizzando un gradiente convenzionale ex.
- In una stanza fredda rimuovere attentamente 1,0 ml dalla sommità del gradiente e sovrapporre la goccia di saccarosio a goccia con il lisato citosolica (cioè, il supernatante ottenuto in step 1.2).
- Abbassare con cautela i tubi nei secchi di rotore oscillante. Centrifugare i gradienti per 100 min a 180.000 xg a 4 ° C usando un'ultracentrifuga.
- Dopo la centrifugazione, lasciare i tubi in loro secchi per 20 min a 4 ° C per consentire ai gradienti stabilizzano.
- frazionamento gradiente di saccarosio (2 ore)
- Rimuovere con cautela un tubo ultracentrifuga dal rotore ultracentrifuge e montarlo sul dispositivo di raccolta di un gradiente di densità frazionamento del sistema. Raccogliere 1 ml frazioni di monitoraggio l'assorbanza a 260 nm con una VIS rivelatore UV / (vedi figura 1 pannello superiore). Mantenere le frazioni raccolte sul ghiaccio.
- Preparare aliquote di 30-40 ml delle frazioni di interesse, tenerli in ghiaccio prima di riporli a -80 ° C fino all'uso. Non utilizzare aliquote o frazioni di saccarosio che hanno subito più di due cicli di gelo-disgelo (vedi Figura 1 inferiore del pannello).
2. Preparazione del campione per la microscopia a forza atomica (3 ore)
- Con del nastro, staccare i fogli di mica.
- Lavare i fogli di mica 3-4 volte con DEPC-acqua e metterlo in una piccola capsula di Petri. Quindi asciugare la superficie con l'aria.
- Coprire la mica con 200 ml di 1 mM Niso 4 e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di nichel e poi asciugare la superficie con l'aria. Eseguire tutte le fasi future a 4 ° C mettendo la piastra di Petri con la mica su ghiaccio.
- Scongelare una aliquota ottenuta in 1.4.2 su ghiaccio e delicatamente aggiungere tutti della goccia campione goccia sulla mica. Utilizzando una punta 100-200 microlitri, spalmare il campione su tutta la superficie della mica. Incubare il campione in ghiaccio per 3 min.
- Coprire la goccia foglio di mica a goccia con 200 ml freddo Buffer-AFM (vedi Tabella 1) e incubare per 1 ora su ghiaccio.
- Imaging a liquido
- Rimuovere con attenzione il Buffer-AFM e lavare i fogli di mica 3-4 tempos con 200 ml freddo Buffer-AFM per rimuovere l'eccesso di saccarosio. Poi lavare i fogli di mica 3 volte con tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1), lasciando la superficie di mica ricoperta da alcuni microlitri di soluzione.
- Vai al punto 3 (acquisizione immagine).
- Imaging in aria
- Rimuovere con cautela il Buffer-AFM e lavare la mica 3-4 volte con 200 pl freddo Buffer-AFM per rimuovere l'eccesso di saccarosio. Poi, lavare il mica 3 volte con soluzione di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1) e scaricare l'acqua in eccesso con carta.
- Lasciare asciugare il campione sotto il cofano chimica con la parte superiore della scatola di Petri parzialmente aperta. Dopo 2 ore, chiudere la piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente. Misurare il campione dopo 2-3 ore come sono stabili per anni.
3. Acquisizione di immagini (15 min per immagine dopo la stabilizzazione termica)
Nota: polisomi immobilizzati su mica possono essere esposte in aria o in liquido, utilizzando la modalità AC.
- Fissare la mica a supporto del campione con del nastro biadesivo.
- Inserire il supporto del campione nella fase AFM seguendo le indicazioni del produttore. Quando l'imaging in liquido, se possibile, cercare di mantenere il campione ad una temperatura inferiore a 25 ° C per aumentare polysome stabilità nel tempo.
- Selezionare un cantilever adatta per l'imaging CA e montarlo sul supporto punta seguendo le indicazioni del produttore. Qui, l'uso cantilever con forza costante tra 2-20 N / m per l'imaging e l'aria intorno a 0,1 N / m per l'imaging liquido.
- Regolare il punto laser sulla mensola e azzerare i segnali rivelatori quadrante.
- Selezionare una frequenza di pilotaggio opportune e guidare il cantilever con un'ampiezza di 10-20 nm.
- Approccio il campione fino a quando la punta impegna la superficie.
- Selezionare un'area di scansione di 2x2 micron, acquisire almeno 512x512 pixel immagini (larghezza in pixel <4 nm), selezionare una modalità di sottrazione dello sfondo dal vivo e una scala Z di 20-25 nm.
- ispezionare tsi cerca di immagine per la presenza di oggetti rotondi caratterizzati dalla altezza tra 10 e 15 nm quando l'acquisizione in aria e 25 e 30 nm quando nel liquido e la larghezza nell'intervallo 25-30 nm. Regolare i parametri di setpoint e un giudizio fino ad oggetti appuntiti sono visualizzati. Lo sfondo deve apparire relativamente piatta in buoni campioni, con alcuni oggetti di altezza 2-4 nm (vedi Figura 2A e B).
- Se l'immagine sembra buono (come indicato al punto 3.8), acquisire diversi (almeno dieci) scansioni 2x2 micron a diverse aree campione.
- (opzionale). Se necessario, acquisire immagini ad alta risoluzione di polisomi selezionati (vedi Figura 2C).
- Applicare correzioni software (piano sottrazione e line-by-line algoritmi di correzione) per correggere le immagini AFM rimozione inclinazione arbitraria e alla deriva effetti.
4. Analisi dei dati (30 min per immagine)
- esportare immagini in ImageJ (opzionale: applicare un fattore di scala) Preferentbuona resa utilizzando un formato di compressione senza perdita di dati, ad esempio, il formato TIFF (vedi Figura 3A).
- Utilizzare la macro set di strumenti RiboPick.ijm ImageJ (da copiare nella macro / set di strumenti sottodirectory ImageJ) per contare ribosomi in polisomi (vedi Figura 3B) e calcolare le proprietà statistiche del campione (vedi Figura 3C).
- Inizia il caricamento di un'immagine utilizzando il <Leggi image> strumento che inizializza il programma.
- Scegli i centri ribosoma con il <selezione Point> standard di ImageJ strumento (shift + click sinistro consente la selezione multipla dei ribosomi). Segnare i ribosomi selezionati con il <Mark ribosomi> strumento. coordinate Ribosoma verranno visualizzati in una finestra di testo personalizzato.
- Aggiungere più ribosomi allo stesso polysome ripetendo la procedura indicata al punto 4.2.2.
- Rimuovere ribosomi erroneamente contrassegnati con l'<Annulla l'ultima scelta> strumento (inizia la rimozione dall'ultimo ribosoma aggiunto al primo212; nel polysome corrente).
- Quando la polysome è completata, utilizzare il <Nuovo polysome> strumento. Come si aggiunge il numero polysome come una sovrapposizione all'immagine, viene aggiornata la finestra di testo.
- Utilizzare il <Salva risultati e vicino> di scrivere il ribosoma un'immagine PNG che riassume ribosomi e polisomi la raccolte di file (le unità predefinite dell'immagine vengono utilizzati) e coordina. L'immagine originale è chiuso senza essere salvato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il saccarosio gradiente polisomale profiling dell'intero cervello di topo
È possibile purificare polisomi da un lisato cellulare mediante profilatura polisomale, che separa macromolecole conformemente al loro peso e dimensioni. Con profiling polisomale, lisati citoplasmatici ottenuti da cellule o tessuti coltivati, come in questo esempio, vengono caricati su un gradiente di saccarosio lineare e trattati da ultracentrifugazione separare RNA libero da 40S e 60S subunità, 80S ribosomi e polisomi secondo i loro coefficienti di sedimentazione ( Figura 1 pannello superiore). L'assorbanza del campione a 254 nm e la raccolta delle frazioni consentire l'isolamento della frazione di saccarosio arricchito in ribosomi o polisomi con diverso numero di ribosomi per trascrizione. Le frazioni possono essere raccolti, frazionato per l'imaging AFM e conservati a -80 ° C (Figura 1più bassa del pannello).
Polisomi nativi di cervello di topo osservato da AFM in aria rivelano le interazioni ribosomi stretti
acquisizione delle immagini viene eseguita utilizzando la modalità AC (nota anche come modalità tapping). Questa modalità è particolarmente adatto per l'imaging campioni morbidi (come i polisomi) perché l'interazione punta-campione e le corrispondenti forze di taglio sono notevolmente ridotte. In questo modo sia la punta e il campione vengono conservati. immagini AFM permette l'acquisizione di dati ad alta risoluzione, con valori esatti che dipendono da vari fattori, quali le condizioni di misura, il tipo di punta, e le proprietà del campione. Nelle condizioni descritte in questo documento risoluzione laterale di circa 4-6 nm e una risoluzione verticale di 0,1-0,2 nm sono raggiungibili. Dopo la deposizione di aliquote saccarosio in mica, AFM fornisce descrizioni dei singoli polisomi cheappaiono come grappoli di ribosomi, serrato (Figura 2A, C e C). Con analisi sezione trasversale (Figura 2D), l'altezza dei picchi ribosomali è di circa 14 nm in accordo a quanto precedentemente osservato per i ribosomi umani in polisomi dopo asciugatura ad aria 27. Il centro di interasse di ribosomi individuati dalla linea di profilo è di 23 nm, che è in accordo con la dimensione dei ribosomi in soluzione 37, 38.
Il numero dei ribosomi per polysome da una singola frazione mostra una distribuzione mono-dispersa
Figura 3A riporta una tipica immagine AFM ottenuta con l'acquisizione di un campione assorbito su mica da una frazione del gradiente di saccarosio. L'inserto mostra uno zoom digitale di un singolo polysome, con un fattore di ingrandimento adeguato per l'identificazione di RibosOmes nel polysome. Pannello B mostra la stessa immagine dopo l'identificazione ribosoma con la macro RiboPick. cerchi rossi (vedi il riquadro) segnano i ribosomi, e viene utilizzato un numero progressivo (ciano) per aiutare l'associazione del ribosoma si coordina con un polysome specifica. La distribuzione di frequenza del numero dei ribosomi per polysome è stato analizzato per frazione # 10 (vedere Figura 1, pannello inferiore, corrispondente a medio peso molecolare polisomi (MMW)), che mostra chiaramente un picco unico (pannello C, barre grigie). La distribuzione sperimentale è stato dotato di una curva gaussiana (linea nera) che è stato centrato a 5,8 ribosomi / polysome, con una deviazione standard di 1,3 ribosomi / polysome.
Figura 1. profilo assorbanza rappresentante per saccarosio gradiente di sedimentazione di tutto il cervello di topo. (P superioreanel) Un polisomale lisato citoplasmatica è stata ottenuta da cervello P27 mouse e caricato su un gradiente di saccarosio lineare (15-50% di saccarosio [w / v]). E 'possibile osservare i picchi chiari corrispondenti ad assorbanza a 254 nm di RiboNucleoParticles (RNP), subunità ribosomiale ('40 e '60), ribosomi (anni 80) e polisomi. Per evitare di congelare e scongelare ripetuti cicli di campioni prima deposizione AFM su mica, è conveniente per dividere in aliquote sia frazione ribosoma e le frazioni polisomale (pannello inferiore) con diverso numero di ribosomi per trascrizione (cioè, bassa, media, alta e polisomi -molecular-peso (LMW, MMW e HMW, rispettivamente)). Le aliquote possono essere conservati a -80 ° C per la durata di due anni.
Figura 2. Immagini di polisomi cerebrali toccando Mode-microscopia a forza atomica. (A) Esempio AFM immagine di MMW poli cervellosomes dopo assorbimento su mica utilizzando una scala di colore grigio lineare. (B) La stessa immagine mostrata in (A) è raffigurato con un diverso Z-range per la scala cromatica: 0-0,5 nm grigi per lo sfondo, 0,5-2 nm, e 2-10 nm gialli per i ribosomi. In questo caso si ottiene un migliore contrasto visivo per entrambi gli oggetti basse e alte Z-range. (C) ingrandimento di una tipica polysome MMW con profilo a sezione (linea tratteggiata bianca). Profilo (D) Altezza due ribosomi definiti dal profilo trasversale a (C) mostra l'altezza ribosoma di 14 nm. Questo valore è compatibile con quanto precedentemente osservato in AFM per i ribosomi umani in polisomi 27.
Figura 3. Esempio di contare il numero di ribosomi per polysome in MMW polisomi cerebrali. (A) immagine AFM che rappresenta l'ingresso della macro ImageJ, RiboPick. (B) Dopo aver raccolto manualmente ogni ribosomi per polysome, i marchi RiboPick nell'immagine la posizione di ogni ribosoma (cerchi rossi). (C) Il numero ottenuto di ribosomi per polisomi possono essere tracciati come una distribuzione che può essere montato con una curva gaussiana. Il numero di polisomi considerati in questo esempio è di 164, ottenuto da 9 immagini indipendenti. Il raccordo con la curva gaussiana restituisce il valore medio della popolazione polisomi nella frazione MMW (# ribosomi / polysome 5.8 ± 1.3, R 2 = 0,99).
| Buffer | Composizione | Applicazione |
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 | Preparazione del lisato (1.1) |
| 10 mM NaCl | ||
| 10 mM MgCl 2 | ||
| 1% Triton-X100 | ||
| 1% Na-desossicolato | ||
| 0,4 U / ml RNase Inhibitor | ||
| 1 mM DTT | ||
| 0,2 mg / ml cycloheximide | ||
| 5 U / ml DNasi I | ||
| 50% soluzione di saccarosio | 50% (w / v) di saccarosio in | preparazione gradiente di saccarosio (1.2) |
| 100 mM NaCl | ||
| 10 mM MgCl 2 | ||
| 10 mM Tris / HCl pH 7.5 | ||
| 15% soluzione di saccarosio | 15% (w / v) di saccarosio in | preparazione gradiente di saccarosio (1.2) |
| 100 mM NaCl | ||
| 10 mM MgCl 2 | ||
| 10 mM Tris / HCl pH 7.5 | ||
| Nickel Solution | 1 mM Niso 4 | Preparazione del campione per l'AFM (2) |
| Buffer-AFM | 100 mM NaCl | Preparazione del campione per l'AFM (2) |
| 10 mM MgCl 2 | ||
| 100 ug / ml cycloheximide | ||
| 10 mM Hepes | ||
| 3% (w / v) di saccarosio, pH = 7,4 | ||
| Soluzione di lavaggio | DEPC-acqua | Preparazione del campione per l'AFM (2) |
| 100 ug / ml cycloheximide | ||
Tabella 1. Tamponi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l'organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell'espressione genica, è essenziale analizzare l'organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione.
Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizzati su una superficie piana, adatto per l'imaging AFM si ottiene. Utilizzando queste condizioni con campioni preparati convenientemente, quasi 50 polisomi all'ora possono essere acquisite, pronto per ulteriori analisi e caratterizzazione. Inoltre, campioni essiccati conservati a RT hanno dimostrato di essere adatto per l'imaging dopo più di un anno.
Per ottenere con successo le immagini polysome con il nostro protocollo, ci sono alcuni passaggi cruciali: per utilizzare tessuti che è stato correttamente il flash-congelati immediatamente dopo dissection e conservati a -80 ° C per minimizzare la degradazione dell'RNA; di utilizzare il tampone di lisi contenente cycloheximide e RNase inibitori per evitare la dissociazione ribosoma da mRNA; effettuare tutte le incubazioni su ghiaccio durante la deposizione del campione sulla mica; e nella preparazione del campione per l'imaging AFM su aria, lavare ampiamente il campione sul mica di respingenti e acqua priva di RNasi in presenza di cicloesimide. L'ultimo punto è particolarmente importante. Se l'immagine sembra contenere superfici lisce a circa all'altezza giusta, ma 100-1.000 nm di larghezza, questa è una chiara indicazione di un campione mal lavato (spesso ribosomi / polisomi possono essere ancora osservare come, oggetti incorporati deboli). Un metodo per risolvere questo problema è quello di ripetere la procedura di lavaggio, ma questo di solito non mitigare il problema su un campione già essiccato. In questo caso è opportuno ripartire con una nuova aliquota.
Vista la delibera di AFM, questo metodo per polisomi che studiano non può risolvere la strutdettagli strutturali di interfacce ribosomiali in polisomi. In realtà, AFM è un approccio complementare e più semplice da Cryo-EM, che rappresenta una tecnica efficace e robusto, di acquisire e analizzare migliaia di polisomi, e comprendere meglio l'organizzazione complessiva ribosoma in polisomi. È importante sottolineare che questo protocollo ha il vantaggio unico di identificazione filamenti compatibili con l'RNA 27. Questa stessa procedura può essere utilizzata per qualsiasi campione polisomale ottenute da qualsiasi tessuto biologico o linea cellulare. Ancora più importante può anche essere impiegato con successo per ottenere informazioni specifiche trascrizione utilizzando in sistemi di traduzione in vitro, come recentemente dimostrato da Lauria e collaboratori 35. Questa metodologia aprirà la strada per diversi esperimenti, per guadagnare la comprensione della cinetica di polysome formazione o di cambiamenti nell'organizzazione polysome in diverse condizioni di cellulare o tessutale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cycloheximide | Sigma | 01810 | Prepararation of lysate |
| DNAseI | Thermo Scientific | 89836 | Prepararation of lysate |
| RiboLock RNAse Inhibitor | Life technologies | EO-0381 | Prepararation of lysate |
| DEPC | Sigma | 40718 | Prepararation of lysate |
| Triton X100 | Sigma | T8532 | Prepararation of lysate |
| DTT | Sigma | 43815 | Prepararation of lysate |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | Prepararation of lysate |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | Prepararation of lysate |
| Sucrose | Sigma | S5016 | Sucrose gradient preparation |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima LE-80K | Sucrose gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | SW 41 Ti | Sucrose gradient centrifugation |
| Polyallomer tube | Beckman Coulter | 331372 | Sucrose gradient centrifugation |
| Density Gradient Fractionation System | Teledyne Isco | 67-9000-176 | Sucrose gradient fractionation |
| AFM | Asylum Research | Cypher | Polysome visualization |
References
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Russell, J. B., Cook, G. M. Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions. Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).
- Vogel, C., et al. Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line. Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13, 220 (2012).
- Kondrashov, N., et al. Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning. Cell. 145 (3), 383-397 (2011).
- Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Pircher, A., et al. An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome. Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).
- Simms, C. L., et al. An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA. Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).
- Kraushar, M. L., et al. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).
- van Heesch, S., et al. Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes. Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).
- Preissler, S., et al. Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast. EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).
- Palade, G. E. A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).
- McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).
- Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome. Nature. 2 (197), 430-435 (1963).
- Dimitriadis, E. K., et al. Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).
- Allen, M. J., et al. Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences. Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).
- Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution. Science. 289 (5481), 905-920 (2000).
- Schluenzen, F., et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution. Cell. 102 (5), 615-623 (2000).
- Ben-Shem, A., et al. The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution. Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).
- Anger, A. M., et al. Structures of the human and Drosophila 80S ribosome. Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).
- Brandt, F., et al. The native 3D organization of bacterial polysomes. Cell. 136, 261-271 (2009).
- Myasnikov, A. G., et al. The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes. Nat. Commun. 5, 5294 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study. Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).
- Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation. Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).
- Viero, G., et al. Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes. J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).
- Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells. Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).
- Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy. Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).
- Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).
- Mikamo, E. C., et al. Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy. J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).
- Mikamo-Satoh, E. A., et al. Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging. Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).
- Bernabò, P., et al. Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling. J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Lauria, F., et al. RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J Vis Exp. (100), e52853 (2015).
- Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin. Science. 138, 1399-1403 (1962).
- Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy. J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).
