Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53863
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

ERRATUM NOTICE

Introduction

Streptomycetes הם חיידקי אדמת שוכני המאופיינות מחזור התפתחותית מורכב המעורב בידול מורפולוגיים מ תפטיר רב-תאי, הדחה-מזין רדום, נבגי unigenomic 1-3.

תחת תנאי גידול נוחים שנבג Streptomyces הטיפוסי מתחיל לנבוט ידי לשיחול צינורות ניבטים אחד או שניים (איור 1). צינורות אלה להאריך ובהרחבת טיפ ולגדול לרשת hyphal קנים המכונית התפטיר וגטטיבי. צמיחת פולאר הסתעפות hyphal מופנה על ידי DivIVA החלבון החיוני. חלבון מפותל, סליל זהו חלק ממכלול ציטופלסמית גדול שנקרא polarisome, שהוא חיוני עבור החדרת חומר מעטפה הסלולרית החדש בקצה הארכת 4-7. במהלך צמיחה של צמח, חוטי hyphal להיות ממודרים כתוצאה מהיווצרותם הנדירה של מה שנקרא חוצת קירות 8. ההיווצרות של קירות הצולבים אלה מחדש quires FtsZ, החלבון cytoskeletal דמוי טובולין כי הוא חיוני עבור חלוקת התא רוב החיידקים 9. בשנת Streptomyces, לעומת זאת, קירות צלב וגטטיבי אלה אינם להוביל לפרידת התכווצות תאי תאים ולכן מסת mycelial נשארה כרשה של תאי סינסיציאלי מחובר יתר. בתגובת הגבלת מזין ואיתות אחרים שאינם מובנים היטב, עובש אוויר מיוחד להתנתק התפטיר וגטטיבי ולגדול לאוויר 3. הקמת המבנים אלה יוזמת את שלב הרבייה של פיתוח, שבמהלכו עובש האוויר רב-גנומי הארוך להיות מחולק עשרות תאי prespore unigenomic השווה בגודלן. אירוע חלוקת תא מסיבי זה הוא מונע על ידי ההתכווצות סינכרוני של טבעות FtsZ מרובות בתוך 2,10 עובש sporogenic היחיד. בידול מורפולוגי הושלם על ידי השחרור של רדומים, בעובי דופן, נבגים פיגמנט.

t "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
איור 1:. Streptomyces מחזור החיים על תקשורת מוצקה זהו מודל של מחזור החיים מבוסס על מחקרים קלסיים של ס coelicolor גדל על צלחות אגר. פיתוח הסלולר של נבג מתחיל עם ההיווצרות של צינורות ניבטים אחד או שניים, אשר גדלים באמצעות רחבת טיפ ליצירת רשת של הסתעפות עובש. הצמיחה פולאר הסתעפות של העובש וגטטיבי היא נוהלה על ידי DivIVA (אדום). ההיווצרות של חוצת קירות וגטטיבי דורשת FtsZ (ירוק). בתגובה להגבלות מזין אותות אחרים, עובש אווירי מוקמים. מעצר של צמיחה אווירית מרוכז באופן הדוק עם ההרכבה של סולם של FtsZ-טבעות, אשר מעוררות את septa נביגה כי למדר את עובש sporogenic לתאי prespore דמוי קופסא. תאים אלה להרכיב קיר נבג עבה והם בסופו של דבר released נבגים פיגמנט מבוגרים.

האירועים התפתחותי החשובים של מחזור חי Streptomyces הם גם מאופיינים 1,3. עם זאת, מה הוא עדיין נדיר מחקרי תא ביולוגי מעסיקות הקרינה מיקרוסקופיה זמן לשגות לספק תובנה תהליכי subcellular שבבסיס בידול, כגון דינמיקת לוקליזציה חלבון, תנועת כרומוזום חלוקת תא מבחינת התפתחותית מבוקרת. Live- תא הדמיה של פיתוח Streptomyces כבר מאתגר בגלל המורכבות של מחזור החיים ואת המאפיינים הפיזיולוגיים של האורגניזם. מחקרים קודמים על צמיחת צמח ו בשלבים הראשונים של septation נביגה יש מועסקים לתאי הדמיה חדיר-חמצן, או הצמיחה נתמכת agarose של coelicolor Streptomyces על במת מיקרוסקופ 11-15. שיטות אלה, עם זאת, מוגבלים על ידי מספר גורמים. חלק מהמערכות רק לאפשר הדמיה לטווח קצר של צמיחה הסלולרחלבוני ניאון ד לפני תאים סובלים אספקת חמצן מספיקה או לצמוח מתוך המטוס מוקד בשל דפוס תלת ממדי של פיתוח hyphal. במקרים בם הדמיה לטווח ארוך אפשרית, טיפוח תאים על גבולות רפידות agarose גמישות ניסיון, כי התאים לא יכולים להיחשף תנאי גידול או מתח חלופיים, ואת קרינת הרקע מהמדיום של רפידות agarose מגבילה מאוד את היכולת לנטר ניאון חלש אותות.

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces להשלים עם דיוק ורגישות מעולה. על ידי הגדלה Streptomyces במכשיר microfluidic מחובר מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield (איור 2), אנו יכולים כעת לעקוב אחר נביטה, צמיחה צמח ו נביגה septation על פני פרק זמן של עד 30 שעות. זה קל מאוד על ידי השימוש של Streptomyces אורגניזם המודל החדש venezuelae כי זה sporulates להשלמה ליד בתרבות השקועה ובכך מתגבר על המגבלה של מיני מודל הקלסיים ס coelicolor, אשר sporulates רק על תקשורת מוצקה 16-20. כדי לעזור לחזות צמיחה צמח ו נביגה, אנו שיתוף-Express fluorescently מתויג גרסאות של DivIVA סמן הקוטביות בתא ואת החלבון חלוקת התא מפתח FtsZ.

אנחנו משתמשים במכשיר microfluidic זמינים מסחרית כי הועסק בהצלחה עבור mycobacteria, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, subtilis Bacillus ושמרים 21-25. מערכת מלכודות תאי מטוס בודד מוקדי ומאפשרת שליטת זלוף הרציפה של מדיום תרבות ממאגרים שונים. בפרוטוקול המפורט ננצל בתכונה זו כדי לחשוף ס venezuelae תפטיר וגטטיבי על downshift תזונתי לקדם נביגה.

הדה הפרוטוקולscribed הוא עבור דימות תאים חיים של מחזור החיים Streptomyces כולו, אבל התנאים תקשורת אלטרנטיבית או הגדרות מיקרוסקופ ניתן לבחור אם בשלבים התפתחותיים ספציפיים הם בעלי עניין מיוחד.

איור 2
איור 2: סכמטי המתאר את זרימת העבודה הניסויית. שלושת הצעדים העיקריים המתוארים בפרוטוקול מוצגים. ראשית, נבגים ובינוניים בילו ערוכים מתרבות נייחת פאזיים. שנית, נבגים טריים נטענים לתוך מערכת microfluidic וס venezuelae הוא צלם לאורך כל מחזור החיים ההתפתחותיים שלו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אוטומטית לחלוטין עם תא דגירה לשמור על טמפרטורה לצמיחה אופטימלית. שלישית, סדרת הזמן לשגות שהתקבלה מנותחת ומעובד באמצעות תוכנת הקוד הפתוח פיג'י.

Protocol

1. ניתוק של טרי S. נבגי venezuelae ואת הכנת בינוני תרבות שהות

  1. לחסן 30 מ"ל מלטוז-שמרים-מאלט חלץ חלץ (MYM) בינוני, בתוספת 60 μl פתרון אלמנט עקבות R2 (TE), עם 10 נבגים μl של SV60 זן [pSS209 :: BT1 φ attB (divIVA P - divIVA-mCherry P ftsZ -ftsZ-ypet)]. לצמיחה עקבית נביגה של התאים, להשתמש בבקבוק מבולבל או בקבוקון המכיל באביב כדי לאפשר אוורור מספיק.
  2. תרבות תאים עבור 35-40 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 250 סל"ד.
  3. בדוק את התאים על ידי מיקרוסקופיה נוזלי רכוב שלב ניגודיות. בשלב זה שברים ונבגי mycelial יהיו גלויים.
  4. צנטריפוגה 1 מ"ל תאים בצנטריפוגה בטבלה העליונה ב 400 XG דקות 1 עד גלולה תפטיר ושברי תאים גדולים יותר.
  5. העבר כ 300 שיתוף supernatant μlntaining השעיה של נבגים לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשמור על קרח. שמור את מדיום התרבות הנותרת עבור צעד 1.7.
  6. לדלל נבגים 01:20 ב MYM-TE (ריכוז סופי: 0.5-5 x 10 7 נבגים / מ"ל) ולשמור על הקרח עד הצורך (ראה שלב 2.3).
    הערה: למרות התנאים המדויקים המפעילים נביגה ב Streptomyces אינם מובנים, באמצעות מדיום MYM-TE בילו, לרבות כל אותות תאיים ידועים מתרבה sporulating, מגרה נביגה.
  7. מסנן לעקר 10 מ"ל של מדיום תרבות הנותרים כדי להשיג בילה MYM-TE כי הוא חופשי של נבגים ושברי mycelial. שימוש במסנן 0.22 מיקרומטר מזרק סטרילי ולהעביר בילה MYM-TE לצינור 15 מ"ל סטרילי.
  8. שמור את מוכן בילה MYM-TE במשך כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס אם ניסויים נוספים באמצעות תנאי הגידול דומים הם להתנהל.

2. הכנת המכשיר microfluidic

הערה: כל PLA microfluidicte מאפשר עד ארבעה ניסויים בלתי תלויים להתבצע. כדי למנוע זיהום של תאי זרימה בשימוש, השתמש פתרונות סטרילי ותנאי עבודה בעת הגדרת ניסוי.

  1. הסר פתרון משלוח מהצלחת microfluidic ולשטוף את הבארות עם MYM-TE סטרילי.
  2. הוספת 300 μl MYM-TE כדי מפרצון גם 1 ו 300 μl בילה MYM-TE לבארות 2 עד 6.
  3. 40 טענו μl מדולל נבגים משלבים 1.6 טעינת תא היטב 8 של השביל "A" ו לאטום את הסעפת לצלחת פי הוראות מייצרות.
  4. הפעל את תוכנת בקרת מיקרופלואידיקה, לבחור את סוג הצלחת המתאים ולהקים תכנית זרימת ממשלת ערוץ הזרימה הקאמרית תרבות ידי בינוני זורם מבארות כניסה 1 עד 5 בשעה 6 psi במשך 2 דקות לכל טוב.
  5. בשנת תוכנות שליטת מיקרופלואידיקה, ליצור פרוטוקול זרימה לניסוי: זורם MYM-TE מבאר כניסה 1 עבור 6 שעות, כדי לאפשר נביטה וצמיחה וגטטיבי של התאים. מֶתֶגאז כדי טפטוף של בילה MYM-TE מבארים 2 עד 5 בפעם הנותרת של הניסוי. במהלך הניסוי לשמור קבוע בלחץ הזרימה 6 psi (המקביל ל כ 9 μl בינוני / hr). התחל תוכנית תזרים לאחר שלב 3.5.

3. הגדר של מיקרוסקופ פרוטוקול זמן לשגות

הערה: שיטה זו יושמה על מיקרוסקופ widefield הפוך ממונעת האוטומטי לחלוטין מצוידת במצלמת sCMOS, מנורת מתכת הליד, פוקוס אוטומטי חומרה, בעל קרקע צלחות 96-היטב בתא סביבתי.

  1. טרום לחמם את החדר הסביבתי עד 30 מעלות צלזיוס מראש על מנת למנוע בעיות עם הפוקוס האוטומטי לאחר תחילת הניסוי. הזמן הדרוש תלוי בתא הסביבתי בשימוש, המיקרוסקופ ומערכת החימום. התחל כדי לחמם את המערכת בלילה שלפני הניסוי.
  2. הפעל את Softwa מיקרוסקופ ואוטומציה מיקרוסקופיה ובקרהמִחָדָשׁ. השתמש צמצם מספרי גבוהת טבילה אובייקטיבי שמן (NA) לאיסוף אותות אופטימלי ברזולוציה מרחבית, כגון 100X, 1.46 אובייקטיבי NA שמן דסק"ש. בחר מסננים מתאימים ומראות dichromatic לרכוש התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) תמונות ותמונות של תערובות חלבון צהוב-ניאון אדום ניאון.
  3. מניח טיפת שמן טבילה על המטרה ולהוסיף נוזל טבילה לתחתית חלון ההדמיה על צלחת microfluidic לשפר פוקוס תא במהלך רכישת תמונה. בזהירות הר מכשיר microfluidic האטום (שלב 2.5) על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה. ודא כי הצלחת מונחת היטב בעל הבמה אינו עוברת במהלך הניסוי.
  4. לחץ על חלון ההדמיה של תא תרבות microfluidic אל מוקד באמצעות סמני עמדה המוטבעות להתמצאות. פוקוס על החלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשונה (שכותרתו "A") עם הגודל מהלכודה 5, המקבילה לגובה מלכודת של 0.7 מיקרומטר.
  5. בתוכנת מיקרופלואידיקה, תאי עומס מן המפרצון גם 8 ב 4 psi במשך 15 שניות. בדוק את צפיפות התאים בתא התרבות ידי הזזת הבמה על חלון ההדמיה. אם לא נבגים נלכדו, לחזור על שלב טעינת תא או לחלופין להגביר את לחץ הטעינה ו / או זמן עד צפיפות התאים הרצויה מושגת (1-10 נבגים לכל חלון הדמיה עם 2,048 x 2,048 פיקסלים). הימנע להעמיס את חדר התרבות.
    הערה: בדרך כלל אנחנו משתמשים מלכודת גודל 5 הדמית Streptomyces, אבל אנחנו גם השגנו תוצאות טובות עם מלכודת בגדלי 4 ו -3, עיינו במדריך למשתמש של הספק לקבלת הצעות נוספות על אופטימיזציה של תהליך טעינת תא.
  6. הפעילו את תוכנית הזרימה תוכנות שליטה משלב 2.5 ולאפשר הצלחת microfluidic לחום-לאזן במשך שעה 1 בשלב מיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה.
  7. בשנת תוכנות שליטת מיקרוסקופ, להקים רכישה רבה ממדים לקחת muתמונות רובים של בעמדות במה מרובות לאורך זמן:
    1. עבור שמירה אוטומטית: לציין ספרייה עבור שמירה אוטומטית של קבצי תמונה.
    2. לקבלת הגדרות תאורה, לקבוע הגדרות תאורה אופטימלית עבור כל מבנה ספציפי מראש. לצורך הניסוי המתואר, השתמש פעמי החשיפה הבאות: דסק"ש 150 msec, YFP 250 msec, RFP 100 msec.
    3. עבור זמן-סדרה: להגדיר סדרה עתית לרכוש תמונות בנקודות הזמן הרצוי ברצף. הדמית מחזור החיים של ס venezuelae, לבחור מרווח זמן 40 דקות במשך 24 שעות.
    4. למשרות במת פוקוס אוטומטית: לסרוק את חדר התרבות על ידי הזזת עמדות במת חנות במה לכל תפקיד הדמיה של עניין. ודא כי עמדות חד-שלבי ממוקמים מספיק מזה כדי למזער photobleaching ו phototoxicity.Typically להשתמש עד 12 עמדות. שגרת פוקוס אוטומטית מפעיל עבור כל נקודת זמן לתקן מוקדי סחף האט. אם אפשרות זו זמינה תוכנות שליטה מיקרוסקופ, אסטרטגית פוקוס אוטומטית מוגדר "עדכון שטח מקומי על ידי פוקוס אוטומטי חומרה". לאחר Z-הקואורדינטות של עמדות הבמה שנבחרו מאומתות, להפעיל את הפוקוס אוטומטי חומרה.
  8. הפעל את הניסוי זמן לשגות של תוכנות שליטה מיקרוסקופ.
  9. בדוק שכל העמדות הבמה עדיין בפוקוס בנקודות מאוחר יותר. בניסויי זמן לשגות פועלים במשך כמה שעות, מעת לעת אנו מבחינים להיסחף הבמה גם בעת שימוש פוקוס אוטומטי. אם עמדות במה צריכות להיות refocused, להפסיק את הניסוי בכל נקודת זמן מתאימה, לשנות את הפוקוס ולהפעיל מחדש את הניסוי בתוך פרק הזמן המוגדר הדמיה (שלב 3.7.3). ראה שלב 4.3 עבור איך לשרשר סדרת הזמן.
  10. עצור רכישת תמונה לאחר 24-30 שעות או כאשר העובש באזור של עניין יש בדיל לתוך נבגים (ראה סדרת תמונת DIC). לעצור את תוכנית תזרים בתוכנה לפרק את המכשיר microfluidic.
  11. כן צלחת microfluidic משומש STO לטווח קצרזַעַם. הסר הנותרים MYM-TE ובילה MYM-TE מבאר 1 עד 6, גם בזבוז ריק 7 וטעינה התא היטב 8. בתנאים סטריליים, למלא מחדש בשימוש בארות של השביל "A" ובארות של נתיבים שאינם בשימוש ( "B" כדי "D") על צלחת עם בופר פוספט סטרילית (PBS). חותם את הצלחת עם parafilm כדי למנוע ממנו להתייבש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

4. דור של זמן לשגות סרטים שימוש פיג'י תוכנה

הערה: יש לציין כי חבילות תוכנה מסחרית וחופשית שונות זמינות כדי לעבד תמונות מיקרוסקופיה זמן לשגות כולל ZenBlue, Metamorph, קפוא, ImagePro או ImageJ. כאן נתמקד פיג'י, אשר הנה תכנית עיבוד תמונת קוד פתוח מבוססת על ImageJ, ואשר כבר מספק מספר התוספים המותקנים מראש שימושיים.

  1. נתוני הדמיה העברת מניסוי זמן לשגות למחשב אשר פיג'י מותקן.
  2. השקת התוכנית ולייבא את הקובץ הדמיה באמצעות &# 34; קובץ> יבוא> ביו-פורמטים ". או פשוט על ידי גרירת קובץ ההדמיה לתוך פיג'י ב" אפשרויות היבוא ביו-הפורמטים ", סמן את התיבה" ערוצים לפצל "כדי לקבל ערימת תמונה נפרדת עבור כל ערוץ תאורה (DIC , RFP, YFP).
  3. אופציונאלי: כדי למזג זמן-סדרות נפרדות נובעות הפסקה ברכישת התמונה בשל refocusing (שלב 3.9), פתח ערימות תמונת בהתאמה וברח "תמונה> סטאקס> כלים> לשרשר" לכל ערוץ (DIC, RFP, YFP ).
  4. להעריך את איכות נתוני הזמן לשגות ידי גלילת ערימות תמונה. חפש עובש כי נשאר בפוקוס לאורך זמן, צמיחת mycelial מופע ובסופו של דבר ליצור נבגים (מחסנית DIC). בדוק את לוקליזציה subcellular הצפויה DivIVA-mCherry על קצות hyphal (מחסנית RFP) ו FtsZ-YPet להרכיב טבעות יחידות או מבנים רבים, כמו-סולם וגטטיבי או עובש sporogenic (מחסנית YFP), בהתאמה.
  5. לבודד אזור של אינטרס עבור processi במורד הזרםng של תמונות. זמן לשגות מיקרוסקופ לעתים קרובות מייצרת קבצים גדולים והדבר עשוי להאט עיבוד על ידי פיג'י. לכן מומלץ לזהות ולבודד אזור של העניין (ROI) ולבצע צעדי עיבוד תמונה נוספים על גרסה קטנה יותר זה של מחסנית התמונה.
    1. בחר באפשרות "הבחירה מלבנית" בתפריט וצייר ROI מלבני בערימת תמונת DIC בצורה כזאת כי העובש בפיתוח מוקף על ידי ROI במהלך סדרת התמונה.
    2. שכפל ROI מחסנית עם "Ctrl" + "Shift" + "D".
    3. הקש על הבר שם ערימת תמונת YFP ובחר "ערוך> בחירה> שחזר בחירה" בתפריט כדי לשחזר את הבחירה מלבני הקודמת של דסק"ש המקורי מחסנית לאותה ההופעה במיקום בערימת YFP לשכפל את ההחזר על ההשקעה עם "Ctrl" + "Shift" + "D".
    4. חזור על תהליך זה עבור מחסנית RFP.
  6. יישר את התמונות בתמונה השלוש ערימות to להסיר מרחף במה במישור xy לאורך זמן. גלול אל המסגרת האחרונה במחסנית דסק"ש ובחר "Plugin> הרשמה> StackReg> RigedBody" מהתפריט. חזור על שלב זה עבור RFP ואת מחסנית תמונת YFP. במידת הצורך, לחתוך את ההחזר על ההשקעה על ידי חזרה על צעד 4.5.1-4.5.3.
  7. אופציונלי: כוונון הבהירות והניגודיות באופן ידני עבור כל ערימה התמונה עם "כוונון הבהירות והניגודיות כלי" ( "Ctrl" + "Shift" + "C") או בחר "תהליך> שפר ניגודיות" מהתפריט ולהחיל את "לנרמל" פקודה לכל התמונות בערימה. יצוין כי הפקודה האחרונה תשנה ערכי הפיקסלים ולכן עשוי להשפיע ניתוח התמונה במורד הזרם.
  8. אופציונאלי: שלב ערימות פרט (מרה לפורמט קובץ RGB, ראה 4.11) אופקי או אנכי באמצעות התוסף "תמונה> סטאקס> כלים> שלב".
  9. הוספת סרגל קנה מידה ( "נתח> כלים> בר סולם") ואת חתם זמן (&# 34; תמונה> סטאקס> זמן סטמפר ").
  10. שמור ערימות תמונה שונות כרצף תמונה בפורמט ".tiff". כדי להפיק סרט, שמירה בשם ".אבי". לחלופין, סדרת תמונת יצוא בפורמט QuickTime באמצעות התוסף "ביו-פורמטים> ביו-פורמטי יצואן" ובחר את סוג הקובץ ".mov".
  11. כדי להשיג תמונות מסגרות יחידות, בחר במסגרת של הריבית לשכפל את התמונה "Ctrl" + "Shift" + "D". שינוי סוג של התמונה המתקבלת כדי "RGB" או "8-bit" תחת "תמונה> סוג> צבע RGB או 8 סיביות" ולשמור את התמונה בשם ".tiff".
    הערה: פיג'י מציעה מספר פונקציות נוספות בהמשך ויסמנו או תהליך הסדרת הזמן לשגות. עבור אל תמיכה מקוונת פיג'י לקבלת מידע מפורט (http://fiji.sc/Fiji).

Representative Results

ההדמיה לחיות התאים המוצלחת של ס כולו מחזור החיים venezuelae מניב זמן-סדרה רצופה כולל שלבי ההתפתחות העיקריים של נביטה, צמיחה צמח ו נביגה (איור 3, סרט 1). ויזואליזציה של ההתקדמות דרך מחזור החיים משופרת נוספת על ידי לוקליזציה subcellular הברורה של DivIVA-mCherry ו FtsZ-YPet. במהלך נביטה וצמיחה וגטטיבי, DivIVA-mCherry מצטבר בלעדי בקצות hyphal גדלו או סימני טביעה חדש נקודות סניף (איור 4 א). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מיצוב subcellular שדווח בעבר של 12,26 DivIVA. לעומת זאת, FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמויי טבעת במרווחים לא סדירים של תפטיר גדל (איור 4B). מבנים אלה מספקים את הפיגום לסינתזה של קירות צלב וגטטיבי שאינם מגבילים, המוביל להיווצרות של interconnמדורי hyphal ected 8. בידול הסלולר של גדל עובש לתוך עובש sporogenic הופך לגלוי על ידי היעלמות מוקדי קוטב DivIVA-mCherry, מעצרו של צמיחת קוטב והעלייה במקבילה של קרינת FtsZ-YPet (האיור 4C). בשנת sporulating העובש, דפוס לוקליזציה של FtsZ-YPet משתנה באופן דרמטי; חוטי סליל FtsZ-YPet הראשונים מתגלגלים לאורך hypha ולאחר מכן, אירוע סינכרוני פתאומי, כמעט, סלילים אלה להתגבש סולם צלצולי YPet FtsZ פזור. תחת תנאי הניסוי המתואר כאן, מופץ באופן שווה אלה סולמות FtsZ-YPet להימשך כ -2 שעות. לבסוף, מחיצה נביגה להיות ניכר הניגוד התערבות ההפרש (DIC) תמונות (איור 4D) ולבסוף נבגים חדשים מתפרסמים.

הפרוטוקול הבא המתאר את עיבוד התמונה באמצעות תוכנת פיג'י קובעה TEP-אחר-צעד הסבר כיצד להפיק סרט לפרסום מהסדרת הזמן לשגות רכש (סרט 1).

איור 3
איור 3: תמונות Snapshot מתוך סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות נציג ס venezuelae הפיק שכותרתו fluorescently FtsZ (ירוק) DivIVA (אדום) מוצגים הם מסגרות נבחרות תמונות ממוזגות (פנל עליון: RFP-YFP-DIC, פנל תחתון: DIC). לדמיין את מחזור חי Streptomyces כולל נביטה, צמיחת צמח ו נביגה. תמונות נלקחו סרט 1. זמן נמצא hr: דקות. ברי סולם = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ד / 53,863 / 53863fig4.jpg "/>
איור 4: נציג תוצאות עבור סדרה הזמן לשגות מוצלחת של מחזור חי Streptomyces (א) לוקליזציה של DivIVA-mCherry.. מוצגים הם תמונות של שתי נקודות בפעם הבאות מסרט 1 עם תמונות ממוזגות של RFP וערוצי דסק"ש. DivIVA-mCherry מסמן אתרי סניף hyphal חדשים (ראש חץ מלא) ו localizes בקצה hyphal לכוון צמיחה קוטבית (ראש חץ פתוח). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר (ב) לוקליזציה FtsZ-YPet במהלך הצמיחה וגטטיבי (ראש חץ). FtsZ-YPet יוצר יחיד מבנים דמוי טבעת (פנל עליון) כי לא להצר (DIC, פנל תחתון). (C) FtsZ-YPet (ירוק) לוקליזציה במהלך septation נביגה. מוקדי DivIVA-mCherry מוצגים באדום, עם זמן שחלף המתואר להלן (HR: דקות). סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. (ד) מקביל תמונות דסק"ש של עובש sporulating מ (C) מראה את הטופסation של תאי prespore עם septa נביגה הגלוי (בתמונה משמאל), אשר בסופו של דבר להבשיל לכדי שרשרת של נבגים (בתמונה מימין). זמן הוא hr: דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מסגרת מסרט 1
סרט 1: סדרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי זמן לשגות של Streptomyces venezuelae מחזור החיים הסרט מורכב תמונות RFP-YFP הממוזגת (משמאל) ואת התערבות ההפרש לעומת המקביל (DIC) תמונות (מימין).. DivIVA-mCherry מוצג YPet-FtsZ האדום בירוק. מרווח הזמן בין יחיד מסגרות הוא 40 דקות. בר סולם = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה תיסרט של.

Discussion

זמן לשגות מיקרוסקופית של מחזור החיים Streptomyces כבר מאתגר מבחינה טכנית בעבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול חזק כדי לבצע דימות תאי חיים של מחזור החיים המלא באמצעות התכת חלבון פלואורסצנטי אל DivIVA סמן הקוטבי בתא וחטיבת חלבון תא FtsZ לעזור לחזות להתחקות התקדמות באמצעות תכנית התפתחותית (איור 2).

מרכזי לשיטה זו היא הטיפוח של ס venezuelae במכשיר microfluidic המאפשר זלוף בינוני קבוע ואת חילופי מדיום הגידול רגיל (MYM-TE) עם המדיום בילה (בילה MYM-TE). השינוי של מצב ההתרבות חשוב בפרוטוקול תאר כי downshift התזונתי כמו גם בארות עדיין שום אותות תאיים לא מזוהים (למשל מניין אותות חישה) במדיום תרבות בילו, לקדם נביגה, ואילו אספקה ​​רציפה של מדיום תזונתי עשירה מגרה growt וגטטיבישעות עם היווצרות כמעט נבג (מידע לא מוצג). לפיכך, culturing תאים במערכת microfluidic זו עדיף על תאי culturing על agarose כי הוא מציע גמישות ניסיון יותר ומאפשר ניטור ארוך טווח של שינויי התפתחות חיידקים בתגובה לשינויים בתנאי תרבות. למרות צלחות microfluidic מיועדות לשימוש יחיד בלבד, לזרום ערוצים שלא היה מחוסן עם תאים יכול לשמש בניסויים הבאים. אנו ממליצים להשתמש בכל ערוצי צלחת microfluidic תוך שבוע, כפי שחווינו בעיות איטום סעפת צלחות שנפתחו לזמנים ארוכים יותר.

בעת הגדרת ניסוי, מצאנו כי נבגים מוכנים טרי מונבטים בתוך שתי שעות של נטען לתוך תא הזרימה, ואילו נבגים נגזרו מנית גליצרול קפוא נדרשים לפחות 6 שעות לפני צינורות ניבטו יצאו (מידע לא מוצג). עיכוב זה בלבלוב משתרע לכל אורכה של הניסוי יכול להפריעזמינות הציוד תנאי הניסוי. כמו כן, חשוב להתחיל את הניסוי עם טפטוף של MYM-TE לפחות 3 שעות כדי לספק חומרים מזינים מספיק לפיתוח תולדה של צינורות נבט. זלוף עם MYM-TE יכול להתארך מעבר hr הראשונית 3 אם הניסוי נועד ללמוד הצמיחה וגטטיבי. בעוד נבגים לספק הבחירה המועדפת של חומר המוצא, שברי hyphal קצר יכול גם להיות טעון לתוך צלחת microfluidic. עם זאת, את יעילות הטעינה בעת שימוש תפטיר טעון היא משמעותית נמוכה ולעתים קרובות דורשת מספר ריצות טעינה אשר עשוי להציג מגבלה כאשר בוחנים מוטנטים שאינם sporulating. ללא קשר לסוג של בידוד המשמש, חשוב לא להעמיס על חדר התרבות עם נבגים או שברי hyphal כמו זה יוביל צפיפות מהירה שיכול להפריע דיפוזיה תקשורת לסבך ניתוח תמונה.

חשוב לתכנן את בניית חלבוני כתב carefully לשימוש הדמיה זמן לשגות הקרינה Streptomyces. אורך לינקר בין חלבון המטרה ואת כתב הניאון והבחירה של N- או בשילובי C- מסוף יכול להיות קריטי. יתר על כן, תנאי ניסוי אופטימליים, כוללים תדירות הדמיה וזמן חשיפה, צריכים להיקבע מראש עבור כל חלבון fluorescently- מתויג. ס פלואורסצנציה אוטומט תערוכת עובש venezuelae בערוץ הירוק / צהוב שעשויות להיות בעייתיים כאשר הדמית חלבון שכותרתו fluorescently כי מתבטא ברמות נמוכות. בנוסף, יש לציין כי, במהלך הנביטה ואת שלב הצמיחה וגטטיבי הראשונית, S. venezuelae הוא רגיש במיוחד אור באורך גל קצר (למשל בעת שימוש בשילובי חלבון CFP).

למרות ההתקדמות המתמשכת בטכניקות הדמיה ומערכות כתב ניאון עבור הדמיה לחיות תאים של חיידקים, ברוב חבילות התוכנה (למשל MicrobeTracker, Schnitzelcאמות, CellProfiler) לעיבוד האוטומטי הבא של אלו סוגים של ערכות נתונים אינן תומכות הניתוח של תמונות נגזרות חיידקים פילמנטיות עם סגנון חיים רב-תאיים 27-29. לפיכך, יש צורך לפתח אלגוריתם מתאים לניתוח תפוקה גבוהה כמותי של נתונים הדמיה מ- Streptomyces וחיידקים filamentous אחרים.

לסיכום, העבודה המתוארת כאן ממחישה את הפוטנציאל העצום של ס venezuelae כמערכת התפתחותית מודל חדשה מהמין, בגלל יכולתה sporulate בנוזל. מכשיר culturing microfluidic הוא פשוט לשימוש גם עבור משתמשים לא מנוסים. הוא מספק פלטפורמה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים תא מרכזיים מחזור חי Streptomyces, כולל לוקליזציה חלבון דינמית, צמיחה מקוטבת, ואת הבידול מורפולוגיים של תפטיר רב-תאי לתוך רשתות של נבגי unigenomic. בנוסף זה הניסיון להגדיר up גם מספק נקודת מוצא מפתה כדי לחקור את האירועים בפיתוח שדורשים לסירוגין התנאים תרבות, או את השימוש של צבעי ניאון כגון חומצות -amino D ניאון כדי לפקח סינתזה פפטידוגליקן או יודיד propidium ו 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כדי לחזות כרומוזום ארגון 30,31.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells Merck-Millipore B04A-03-5PK Microfluidic culture plates
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) Merck-Millipore EV-262 The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Microscope Zeiss 431007-9902-000 Fully automated and motorized inverted widefield microscope
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 Zeiss 411857-9061-000 Environmental chamber surrounding the microscope
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective Zeiss 420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2 Hamamatsu Photonics K.K. C11440-22CU
Illuminator HXP 120V Zeiss 423013-9010-000
FL Filter Set 46 HE YFP shift free Zeiss 489046-9901-000 Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm
FL Filter Set 63 HE RFP shift free Zeiss 489063-0000-000 Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm
Mounting frame K-M for multiwell plates Zeiss 000000-1272-644 Stage holder for microfluidic plate
ZEN pro 2012 Zeiss 410135-1002-120 Microscope control software
ZEN Module Time Lapse Zeiss 410136-1031-110 Software module to set up time-lapse microscopy experiments
ZEN Module Tiles/Positions Zeiss 410136-1025-110 Software module to save specific stage positions (xzy)
Fiji open-source software package http://fiji.sc/Fiji Generation of time-lapse movies
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM)
4 g Maltose
4 g Yeast extract
10 g Malt extract
add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving		 Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60
R2 Trace element solution (TE)
8 mg ZnCl2
40 mg FeCl3-6H2O
2 mg CuCl2-2H2O
2 mg MnCl2-4H2O
2 mg Na2B4O7-10H2O
2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O
add 200 ml H2O
Autoclave and store at 4 oC		 Add 0.002 volumes to MYM
PBS (phosphate buffered saline) Sigma P4417-100TAB Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage.
0.22 µm syringe filters Satorius stedim 16532-K Preparation of spent MYM-TE
SV60 John Innes Centre strain collection S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes. Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).
  2. Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere? Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).
  3. McCormick, J. R., Flärdh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).
  4. Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).
  5. Hempel, A. M., et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).
  6. Fuchino, K., et al. Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).
  7. Holmes, N. A., et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).
  8. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).
  9. Margolin, W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).
  10. Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).
  11. Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput. Biol. 8, e1002423 (2012).
  12. Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).
  13. Wolanski, M., et al. Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).
  14. Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).
  15. Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces. Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).
  16. Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures. J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).
  17. Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN. Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).
  18. Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development. PLoS Genet. 10, e1004554 (2014).
  19. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. MBio. 4, e00684-e00613 (2013).
  20. Tschowri, N., et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development. Cell. 158, 1136-1147 (2014).
  21. Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis. PLoS Genet. 11, e1005299 (2015).
  22. Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (e50456), (2013).
  23. Meniche, X., et al. Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).
  24. Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum. PLoS One. 8, e55078 (2013).
  25. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).
  26. Flärdh, K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).
  27. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).
  28. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).
  29. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
  30. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).
  31. Szafran, M., et al. Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation. J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).

Tags

אימונולוגיה גיליון 108, זמן לשגות מיקרוסקופית FtsZ DivIVA צמיחה קוטב נביגה פיתוח המכשיר microfluidic תוכנה פיג'י.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 07/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schlimpert, S., Flärdh, K.,… More

Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (108), e53863, doi:10.3791/53863 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter