Summary
Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.
Abstract
Die Analyse von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und ihre Interaktion in vaskulären biology beteiligt Liganden ist oft eine Herausforderung aufgrund der konstitutiven Expression von Familien von verwandten Rezeptoren, ein breites Spektrum von verwandten Liganden und der Schwierigkeit, mit primären Kulturen von spezialisierten Endothelzellen handelt. Hier beschreiben wir einen Bioassay zum Nachweis von Liganden an den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (VEGFR-2), einem Schlüssel Wandler von Signalen, die Angiogenese und Lymphangiogenese fördern. Eine cDNA, die eine Fusion des extrazellulären (Liganden-bindenden) -Region von VEGFR-2 mit der Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR) ist in der faktorabhängigen Zelllinie Ba / F3 ausgedrückt. Diese Zellinie wächst in Gegenwart von Interleukin-3 (IL-3) und Entnahme dieses Faktors führt zu dem Tod der Zellen innerhalb von 24 Std. Die Expression des VEGFR-2 / EpoR-Rezeptor-Fusions stellt einen alternativen Mechanismus Überleben und Potentia zu fördernlly Proliferation von stabil transfizierten Ba / F3 - Zellen in Gegenwart eines Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Teil des Fusionsproteins (dh eine , die kann vernetzen die VEGFR-2 extrazellulären Region). Der Test kann in zwei Arten durchgeführt werden: eine semi-quantitative Ansatz, bei dem kleine Mengen von Ligand und die Zellen in 24 Stunden ein schnelles Ergebnis ermöglichen und eine quantitative Ansatz, der Surrogatmarker einer Lebendzellzahl. Der Test ist relativ einfach durchzuführen, ist in hohem Maße reaktions bekannten VEGFR-2-Liganden und extrazellulären Inhibitoren der VEGFR-2-Signalisierungs wie monoklonale Antikörper gegen den Rezeptor oder Liganden und lösliche Ligandenfallen aufnehmen kann.
Introduction
Die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) -Familie von sekretierten Protein Wachstumsfaktoren und ihre verwandten Zelloberflächenrezeptoren eine wichtige und vielfältige Gruppe von löslichen Liganden und Membran eingebettetem Rezeptoren bzw. diese Funktion in Signale über Zellmembranen transduzieren. Sie funktionieren vorwiegend in Endothelzellen , sondern auch in Zellen epithelialen Ursprungs und diejenigen des Immunsystems 1,2. Signalisierungs Eingriff Wege durch Liganden-aktivierte VEGF-Rezeptoren (VEGFRs) sind kritisch in großen Pathologien, wie altersbedingte Makuladegeneration und Krebs und Therapeutika ihnen sind in häufigen klinischen Gebrauch (zum Beispiel der monoklonale Antikörper Bevacizumab, die VEGF-A Targets) Targeting 3,4.
Einer der Komplexität der VEGF-Familie ist die Vielfalt der löslichen Liganden in der Natur (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Proteine durch die Parapockenvirusfamilie orf und Schlangengift VEGF codiert, plus andere hemmendIsoformen von VEGF-A) 2.
Diese Liganden interagieren mit drei Mitgliedern der Rezeptor-Tyrosin-Kinase-Familie, nämlich VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3. Diese Rezeptoren sind variabel auf verschiedenen Zelltypen exprimiert werden jedoch oft coexprimiert auf der Oberfläche von endothelialen Zellen , die Blut und Lymphgefäße aller Größen 5 auskleiden. VEGFR-2 binden kann die Säugetier-VEGF-A 6, VEGF-C - 7 und VEGF-D 8,9 sowie orf - Virus VEGF 10 und Schlangengift VEGF 11 - Liganden. VEGFR-2 spielt eine wichtige Rolle der Angiogenese (das Wachstum neuer Blutgefäße aus bestehenden Gefäßen) in der Embryonalentwicklung, Wundheilung, Krebs und Augenkrankheiten in Fahrt. In diesen Zusammenhängen Liganden wie VEGF-A, -C und -D binden und aktivieren den Rezeptor auf den Blut vaskulären Endothelzellen 12-15. Auf lymphatischen Endothelzellen spielt VEGFR-2 eine Rolle bei der Lymphangiogenese, die Bildung neuer Lymphgefäße 16. VEGFR-2 kann auch 17 Erweiterung und den Ausbau der großen Arterien und Lymphgefäße in gesunden Geweben und Krankheiten zu fördern. Ein vollständiges Verständnis von VEGFR-2: Ligand - Wechselwirkungen ist daher wichtig für die Entwicklung von Inhibitoren für die Verwendung in 18 - Angiogenese-abhängigen Erkrankungen zu behandeln. Während die meisten Isoformen von VEGF-A - Bindung an VEGFR-2 wird proteolytische Spaltung von VEGF-C und VEGF-D erforderlich , der VEGF-Homologiedomäne ein Fragment freizusetzen , besteht, die die Bindung an VEGFR-2 19,20 eine hohe Affinität aufweist.
Wir haben ein Bioassay entwickelt Liganden von VEGFR-2 zu überwachen , die ausgelegt ist , die Notwendigkeit einer primären Endothelzellen zu umgehen, die für den Durchgang technisch schwer, teuer in der Anschaffung und die Kultur (erfordern spezielle Medium) 21 und mehrere VEGFRs exprimieren und co- assoziierten Rezeptoren 22. Heterodimerisierung von VEGFR-2 mit anderen VEGF-Rezeptoren oder Co-Rezeptoren können unerwünschte Komplexität verursachen, wenn sie zu dem Ziel Bolzeny binäre Rezeptor-Ligand - Wechselwirkungen, Aktivität zurückzuführen auf einen spezifischen Rezeptor bewerten, oder die Wirkung von hemmenden Reagenzien zu beurteilen. 23. Der Bioassay behält Beweglichkeit des entsprechenden Rezeptor in der Zellmembran und erlaubt die Bewertung der Fähigkeit eines Liganden zu binden und zu vernetzen, das VEGFR-2-extrazelluläre Region.
Der Bioassay beruht auf der Schaffung eines chimären Rezeptors, in dem die extrazelluläre Region eines VEGF-Rezeptors (in diesem Fall VEGFR-2) an die Transmembran- geschmolzen und intrazellulären Regionen des Erythropoietin-Rezeptor (EpoR), ein Mitglied der Zytokin-Rezeptor-Familie 8,24. Dieses Fusionsprotein wird dann in der faktorabhängigen Pro-B-Zelllinie Ba / F3, auf die Stimulation mit einem Liganden, die zur Bindung und Vernetzung der extrazellulären Domäne des Rezeptors verursacht die Aktivierung der cytoplasmatischen Effektorregion exprimiert, die fähig ist, von ein Überlebenssignal über Janus-Kinasen (JAKs) Umwandlungs-Zelle zu fördernÜberleben und / oder Proliferation. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Volllängen-VEGFR-2 in dem gleichen Zelltyp, und die Stimulation mit dem Liganden, was anzeigt, nicht das Überleben der Zelle und die Proliferation fördert, dass der proximale Signalisierungs Effektoren des VEGFR-2-Weg in diesem Zelltyp nicht verfügbar sind.
Wir haben den Test in einer Vielzahl von Kontexten verwendet zu erforschen Bindung von neuartigen VEGFR-2 - Liganden 10,19,20,24-29. In Kombination mit einer VEGFR-3-EpoR-Ba / F3 - Assay haben wir die relativen Aktivitäten der VEGF-C und VEGF-D - Wachstumsfaktoren für die Bindung und Vernetzung VEGFR-2 und VEGFR-3 30 verglichen. Der Test wurde durchgeführt 31 , um die inhibitorische Aktivität von neutralisierenden monoklonalen Antikörpern gegen VEGFR-2 oder VEGF-D, VEGFR-2 lösliches Falle und Peptidomimetika Targeting der VEGF - Familie zu charakterisieren. Der Test wurde auch in primären Endothelzellen zu zeigen, die Fähigkeit von VEGF aus verschiedenen orf-Virus-Stämme zu binden und zu vernetzen, VEGFR-2 vor dem Test verwendet
Der Test wir beschreiben, ist einfach durchzuführen, und die semi-quantitative Version ermöglicht eine schnelle Bestimmung, die manchmal erforderlich sind, wenn die Herstellung oder Reinigung von Wachstumsfaktoren überwacht wird, Antikörper oder löslicher Rezeptordomänen für andere Experimente. Die einfache Bedienung des Assays ist es eine ideale Ergänzung zu weiteren und umfassendere Studien mit primären endothelialen Zellen aus Blut oder Lymphgefäße aus bestimmten Geweben oder Organsysteme abgeleitet durchgeführt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Quelle von IL-3 und Herstellung von WEHI-3D-konditioniertem Medium
Hinweis: Die Maus granulocytic Leukämiezelllinie WEHI-3D kultiviert wird ein konditioniertes Medium, das IL-3 zu erzeugen.
- Kultur WEHI-3D in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum (FBS), 1% langlebige Glutaminergänzung, 50 ug / ml Gentamicin. Beimpfen von 5 × 10 6 Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in 50 ml frischem Kulturmedium in einem T175 cm 3 Gewebekulturflasche und wachsen etwa 7 Tage , oder bis die Zellen die log - Phase des Wachstums vergingen etwa 24 bis 48 hr (übermäßige Zelltod in der Kultur zu vermeiden). Konditioniertes Medium ist in der Lage für mehrere Jahre bei -20 ° C gelagert werden, so Chargen von 200-500 ml auf einmal hergestellt werden.
- Dekantieren Flüssigkeit und Zellen aus den Kolben und Schleudern bei 1000 x g für 15 min Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Entfernen Sie die obere 90% der supernatant. Man filtriert durch ein 0,22 um-Filtereinheit.
- Aliquot WEHI-3D-konditioniertem Medium (CM) in 1 ml, 50 ml und 200 ml-Volumina für die Lagerung bei -20 ° C oder -70 ° C. Kleiner Aliquots sind nützlich für die Probenaufbereitung, Zwischenvolumen zur Herstellung von Kulturmedium für den Durchtritt von faktorabhängigen Zelllinien und größere Volumina für die Langzeitlagerung. IL-3 ist relativ stabil bei 4 ° C so aufgetauten Medium kann, wenn unter sterilen Bedingungen für einige Wochen gelagert werden.
- Alternativ verwenden, rekombinantes Maus-IL-3 auf einem Niveau von 50 ng / ml in Kulturmedium verdünnt, nachdem sie durch ein 0,22 um-Filtereinheit gefiltert wird.
2. Kultur und Evaluierung von VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 und die Kontrolle von Ba / F3-Zelllinien
- Kulturkontrolle Ba / F3-Zellen in DMEM, 10% FBS, 50 & mgr; g / ml Gentamicin oder Penicillin / Streptomycin Ergänzungsmittel, 1% stabilisiert L-Glutamin und 10% WEHI-3D-CM. Passage-Zellen um 1:15 Verdünnungen etwa alle drei Tage von Zellenin der log-Phase wachsen.
- Kultur VEGFR2-EpoR-Ba / F3-Zellen in DMEM, 10% FBS, 50 & mgr; g / ml Gentamycin, 1% stabilisiert L-Glutamin und 10% WEHI-3D-CM und 1 mg / ml G418. Passage-Zellen um 1:15 Verdünnungen von Zellen in der log-Phase wachsen. Siehe 24 für mehr Details über die Konstruktion und Expression des chimären Rezeptors.
- Erntesteuerung Ba / F3 oder VEGFR2-EpoR-Ba / F3-Zellen, die aus der mittleren logarithmischen Phase Kulturen. Vorsichtig pipettiert, diese nicht-adhärenten Zellen aus dem Boden des Kolbens zu entfernen. Waschen dreimal in Maus Tonizität phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,3 (PBS) (10 ml, Zentrifugieren bei 750 x g für 5 min Zellpellet wiederherzustellen) Medium , enthaltend IL-3 zu entfernen.
- Wasche die Zellen einmal mit DMEM und Zusatzstoffe, ohne die WEHI-3D-CM oder rekombinantem IL-3, und dann in diesem Medium bei einer Konzentration von 7,4 × 10 4 Zellen / ml (dh 1.000 Zellen pro 13,5 & mgr; l resuspendieren; 10.000 Zellen pro 135 & mgr; l, wie durch Zählen mit einem Hämozytometer bestimmt) fürverwenden in den semi-quantitative oder quantitative Versionen des Assays sind.
- Beurteilen Sie Zellen für die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss (ACHTUNG). Mischungs Trypan-Blau in PBS (0,4%) 1: 1 mit der Zellpopulation und zählen ein Minimum von 100 Zellen auf einem Hämozytometer. Zellen, die den Farbstoff aufzunehmen sind tot oder sterbend betrachtet. Lebensfähigkeit von mehr als 98% erforderlich, um den Test durchzuführen.
3. Halb quantitative Assay
- Hinzufügen gewaschenen Zellen (1000 Zellen) enthielt in 13,5 & mgr; l IL-3-defizienten Medium zu den Vertiefungen einer 72-well Mikrotiterplatte bei RT. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu mischen während Aliquotierung Zelle Einschwingzeit, um sicherzustellen, durch die Schwerkraft nicht Bias Zellkonzentration. Verwenden Sie einen gut kalibrierten P20 automatisierte Pipette und autoklavierten Spitzen.
- Hinzufügen Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen bei 10% Volumen (1,5 & mgr; l, um ein Endvolumen von 15 ul, enthaltend 1.000 Zellen pro Vertiefung zu machen), um eine kalibrierte P20 Pipette oder bevorzugt P2 Pipette. Nehmen care, um sicherzustellen, dass die Proben mit den Kulturbedingungen für die Ba / F3-Zellen im Hinblick auf pH, Salz und anderen potentiell cytotoxische / cytostatische Substanzen kompatibel sind. Wo es möglich ist , verwenden Sie ein kompatibles Medium oder Puffer (zB DMEM oder PBS, jeweils) oder in einem solchen Medium oder Puffer verdünnen. Verreiben mit der gleichen Spitze wird das Mischen zu gewährleisten.
- Für die Kontrollproben, umfassen (i) Medium allein enthaltenden kein IL-3; (Ii) WEHI-3BD-CM hinzugefügt Medium allein bei 10% Endvolumen; und / oder (iii) VEGF-A allein zu 100 ng / ml in Medium verdünnt, die kein IL-3.
- Füllen Sie alle nicht verwendeten Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit sterilem Wasser, PBS oder Medium und legen Sie die Platte in einem befeuchteten Behälter (mit Wasser getränkt Seidenpapier) ermöglicht Gasaustausch. Inkubiere Zellen innerhalb der Behälter in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO 2. Dieser Test kann bequem in 3 Stunden von einer Person aufgebaut werden, wenn die Testproben und Media-Komponenten zur Verfügung stehen.
- Beurteilen Sie Platten typischerweise nach 16 hInkubation bei welcher Zeit die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Proben offensichtlich. Siehe Abbildung 3 für Beispiele, wie Zellen in Kultur erscheinen. Analysieren Platten mit einem Standard-invertierten Phasenkontrastmikroskop bei 40 bis 100-facher Vergrößerung.
Anmerkung: Wells stützende Wachstumsfaktoren wie IL-3 oder VEGF-A enthält, enthalten Zellen, die rund und durchscheinend erscheinen. Wells ohne unterstützende Wachstumsfaktoren oder mit Medium wird allein eine verringerte Anzahl von runden Zellen, sowie tote oder sterbende Zellen und Zelltrümmer (zB 3C). Auswertung des Tests bei 24 bis 48 Stunden nach der Inkubation ist das Optimum für Empfindlichkeit.
4. Quantitative Bioassay
- Hinzufügen gewaschenen Zellen (10.000 Zellen in 135 ul) in IL-3-defizienten Medium zu den Vertiefungen einer Standard-96-Well-Mikrotiterplatte bei RT. Achten Sie darauf, die Zellsuspension zu mischen während Aliquotierung Zelle Absetzen durch Schwerkraft, um sicherzustellen, nicht ce beeinflussenll Konzentration.
- In Testproben und Kontrollen in die Vertiefungen bei 10% Volumen (15 ul) mit einer kalibrierten Pipette (P20). Achten Sie darauf, um sicherzustellen, dass die Proben mit den Kulturbedingungen kompatibel sind für Ba / F3-Zellen in Bezug auf pH-Wert, Salz oder andere potenziell zytotoxischen / zytostatischen Substanzen. Wo es möglich ist , verwenden Sie ein kompatibles Medium oder Puffer (z. B. DMEM oder PBS) oder in einem solchen Medium oder Puffer verdünnen. Filter sterilisieren kleine Volumina mit einem 0,22 um Poren Celluloseacetat Zentrifugenröhrchen Filtereinheit.
- Inkubieren der Mischung von Zellen, Wachstumsfaktoren und / oder Inhibitor Mittel in einer befeuchteten Atmosphäre von 10% CO 2 für 48 Stunden. Führen Sie den Test in einem befeuchteten Behälter, die mit Wasser getränkten Tissue-Papier und ermöglicht Gasaustausch hat. Bei der Beendigung der Inkubationsperiode bewerten Assay eines der alternativen Verfahren unter Verwendung der unten aufgeführten und Surrogatmarker der Lebendzellzahl in dem Bohrloch.
- Alternative # 1: 3 H-thymidine Incorporation
Anmerkung: Diese Quantifizierung der 96-Well-Plattenformat ausgelegt ist.- Nach der Inkubation der Testplatten für 48 Stunden bei 37 ° C (150 & mgr; l Volumen pro Napf), fügen 3 H-Thymidin in einem Volumen von 50 ul Testmedium (Ba / F3 Kulturmedium ohne IL-3 / WEHI-3D - CM) pro Vertiefung in einer Konzentration von 20 & mgr; Ci / ml, eine letzte Dosis von 1 uCi pro Vertiefung ergibt.
- Inkubieren Platten für weitere 4 Stunden bei 37 ° C vor der Zellen unter Verwendung eines Zellernters der Ernte. Extrahieren von einzelnen Proben, die durch die Filter in scintillant platzieren und zu quantifizieren, mit einem Flüssigszintillationszähler.
- Alternative # 2: Biolumineszenz Detektion von Cellular ATP
Anmerkung: Dieser Ansatz verwendet ein ATP Überwachung Reagenz, welches, wenn es mit Zelllysat kombiniert können ein Biolumineszenz-Signal erzeugen, das die lebensfähigen Zellen in der Population widerspiegelt.- Lyse Zellen ATP zu extrahieren und ein ATP-Monitoring-Reagens verwenden, um eine generierenLumineszenzsignal gemäß den Anweisungen des Herstellers. Lesen Lumineszenz eines Luminometers kompatibel mit einer 96-Well-Platte-Format.
- Alternative # 3: Enzymatische Reduktion eines Indikatorfarbstoffes durch Viable Cells
Hinweis: Resazurin basierte Assays gute Korrelation zu der Lebensfähigkeit der Zellen zeigen.- Kombinieren Sie kultivierten Zellen mit dem Resazurin Farbstoff auf der Basis und zu quantifizieren Assays ein Fluoreszenz-Plattenleser gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In diesem Abschnitt zeigen wir die Ergebnisse eines Experiments , die wesentlichen Merkmale eines VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay zeigt (Abbildung 1 für Prinzipien des Tests sehen). Andere veröffentlichte Studien zeigen , breitere Anwendungen des Assays für alternative VEGFR-2 - Liganden, mutierten VEGF - Moleküle und hemmenden monoklonalen Antikörpern 8,10,19,24-30.
Die hier dargestellten Daten stellen einen Assay , bei dem das VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay verwendet wird , um die Aktivität der drei rekombinanten humanen Liganden (VEGF-A 165, VEGF-C und VEGF-D) mit einer Spezifität für VEGFR zu quantifizieren -2 in Gegenwart eines inhibitorischen monoklonalen Antikörpers (Bevacizumab) an VEGF-A 165. die Daten wurden in Abhängigkeit von der Reaktion auf VEGF-A 165 allein (Figur 2) normalisiert. Wie erwartet, blockiert Bevacizumab die Wirkung von VEGF-A in dem Test 165, aberhatte keinen Einfluss auf die Aktivität von VEGF-C und VEGF-D.
In der semi-quantitative Version des Assays oder wenn der Test während seiner Entwicklung zu beobachten, die Anzeige der Assay eine Standard invertierten Phase Mikroskop können wertvolle Informationen über den Fortschritt des Tests zur Verfügung stellen. Eine Analyse eines Assays (Figur 3) zeigt die gute Lebensfähigkeit von VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen , wenn Bioassay mit Medium , das IL-3, oder einen Liganden für VEGFR-2, beispielsweise VEGF-A inkubiert. Diese Zellen sind groß und durchscheinend, und es besteht keine oder nur minimale Anzeichen von Körnigkeit in dem zellulären Zytoplasma oder Zelltrümmer in der Kultur. In der gut ohne zusätzliche Wachstumsfaktoren gibt es bereits Hinweise auf eine schlechtere Zellzahlen und wenige gesunde Zellen. Zellen, die erhebliche Granularität in ihrem Zytoplasma und Zelltrümmer ist ein konsistentes Merkmal der Kultur. Nach 48 Stunden gibt es keine Anzeichen von lebenden Zellen.
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Prinzipien der VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay. (A) Ba / F3 - Zellen faktorabhängig und erfordern einen exogenen Wachstumsfaktor, wie IL-3 beschreiben das Zellwachstum zu stimulieren / Lebensfähigkeit via endogene IL-3 Rezeptoren und die JAK-Signalweg. Wenn EpoR können in diesen Zellen exprimiert wird rescue auch über den JAK-Weg auftreten. Die Expression eines Rezeptor-Tyrosinkinase in voller Länge wie VEGFR-2 führt zu einer minimalen Signalisierung als Downstream-Targets von VEGFR-2-Aktivierung engagieren nicht die JAK-Weg. Ein chimärer Rezeptor mit der extrazellulären Region des VEGFR-2, fusioniert an die Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen EpoR, wenn sie in Ba / F3-Zellen transfiziert und mit spezifischen VEGFR-2-Liganden stimuliert wird, ist in der Lage, die JAK Weg der Aktivierung und ZellantriebsÜberleben und die Proliferation. (B) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen exprimieren bedeutende Mengen des chimären VEGFR-2-EpoR - Rezeptor, der Zytometrie verwendet werden kann quantifiziert fließen. Einmal gewaschen aus IL-3 enthaltendem Medium werden die Zellen in einer Vielzahl von Kulturbedingungen gegeben, die entweder das Überleben / Proliferation von Zellen antreiben. Nicht transfizierte Ba / F3 - Zellen oder VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen ohne spezifische Wachstumsfaktoren nicht zu wachsen / überleben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Bewertung von VEGFR-2 - Liganden in den VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay. IL-3-abhängigen Ba / F3 - Zellen , eine Maus VEGFR-2-EpoR - Chimäre exprimieren , wurden in Medium ausgesät , ohne IL-3 ( mit Ausnahme von fürdie + IL-3 Teilmenge, wie angegeben) sowie menschliche VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (dies ist eine Form von VEGF-C , die von dem zentralen Bereich besteht, aber ohne die N und C-terminalen Propeptide) oder VEGF-DΔNΔC (dies ist eine Form von VEGF-D, die die zentrale Region umfasst, aber ohne die N und C-terminalen Propeptide (VD)) bei 100 ng / ml und humanisierte neutralisierenden monoklonalen Antikörper Bevacizumab (was bindet und hemmt VEGF-A, aber nicht VEGF-C oder VEGF-D) oder die Kontrolle nicht-neutralisierende Antikörper Trastuzumab, wie bei 0,75 uM angegeben. NF = mittel keine zusätzlichen Wachstumsfaktoren enthält. Achtundvierzig Stunden später wurde die relative Lebendzellzahl unter Verwendung von Biolumineszenz Detektion von zellulären ATP quantifiziert. Die vertikalen Balken stellen Mittel (normalisiert gegen die Reaktion auf VEGF-A 165 allein, erste bar) und Standardfehler des Mittelwerts von drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier , um die vIEW eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Zellen sind abhängig von externen Wachstumsfaktoren für das Überleben. Beispiele für VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 - Bioassay , in denen IL-3-abhängigen Ba / F3 - Zellen, die eine Maus VEGFR- 2-EpoR - Chimäre wurden in einem Medium (A) mit 10% WEHI-3D - konditioniertes Medium ausgesät, zur Verfügung stellt IL-3, (B) 100 ng / ml humanen VEGF-A 165 (kein IL-3) oder (C) -Medium mit kein IL-3 oder zusätzliche Wachstumsfaktoren. Kultur dargestellt wird 24 h in den Assay sehr lebensfähige Zellen in Gegenwart von IL-3 (A) oder VEGF-A 165 (B), während die in der Kultur ohne IL-3 oder zusätzliche Wachstumsfaktoren (C) Zelltod darstellt und rotuced Lebensfähigkeit sind deutlich zu erkennen. Waagen Bars sind 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der Test hier beschriebenen beruht auf Zellen hoher Lebensfähigkeit mit Hilfe der für Wachstumsfaktoren abhängig sind. Zellen müssen daher sorgfältig kultiviert werden sie Faktor abhängig zu gewährleisten, und die Expression des chimären Rezeptors binden. Um sicherzustellen, dass das Medium frisch hergestellt ist und nicht für einen zu langen Zeitraum gespeichert und dass WEHI-3D-CM ist hochaktiv ist wichtig. Zellen benötigen, von IL-3 enthaltendem Medium in das Assaymedium gründlich gewaschen werden, um sicherzustellen, daß kein restliches IL-3, um den Assay verunreinigen, wenn die Zellen auf die Rettung von Liganden ausgesetzt wird. Als Liganden in einer Reihe von verschiedenen Formen kommen kann, muss darauf geachtet werden, wenn diese zur Untersuchung vorbereitet. Konservierungsmittel, antibakterielle Mittel, Salz oder Puffer verschiedener pH kann der Assay beeinflussen, und deshalb parallel Prüfung von nicht-transfizierten Ba / F3-Zellen zu pufferbezogenen Fragen informieren kann.
Wir verwenden sowohl die semi-quantitative und quantitative Protokolle. Der semi-quantitative-Assay ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Aktivität der Proben vor einer vollständig quantitative Assay zu begehen, die mehr Zeit und Probe erfordert. Die quantitative Methode wird ausschließlich verwendet, wenn Daten für die Veröffentlichung zu erzeugen. Die alternativen Verfahren zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Kultur Erfassungs sind relativ unkompliziert. Die quantitative Bestimmung wurde auf eine Anzahl von unterschiedlichen Formaten zur Quantifizierung der Proliferation angepasst worden, und wir verwendet haben (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) MTT 30, Biolumineszenz Nachweis von zellulären ATP (nicht veröffentlicht), Resazurin Farbstoff auf (Abbildung 2) und 3 H-Thymidin 31 mit Erfolg. In den letzten Jahren haben sich weiterentwickelt wir von der Verwendung von Strahlung weg Biolumineszenz Ansätze anzupassen und haben die Resazurin-basierten Farbstoff aufgrund seiner Wirtschaftlichkeit eingesetzt. Alle Ansätze geben entsprechende Ergebnisse und die Auswahl über die Verfügbarkeit von Reagenzien und ein abhängenssociated spezialisierte Plattenleser in einem bestimmten Labor / Institut oder Vertrautheit mit bestimmten Ansätzen.
Fehlerbehebungs dreht sich um die Aktivität der drei Hauptkomponenten des Assays, i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-Zellen und iii) stimulierenden Liganden. Schlechte Konzentrationen von IL-3 in CM aufgrund unzureichender WEHI 3D-Zellen in der ursprünglichen Kultur, schlechte Lagerungsbedingungen, übermäßige Gefrier-Auftau-Zyklen oder bei einer zu hohen Verdünnung verwendet, kann schlecht wachsenden Kulturen schaffen, die den Test behindern. Dies wird in der Regel in den Kontrollvertiefungen nachgewiesen, wie Zellpopulationen langsam wächst, ihre normalen hellen und runden Aussehen zu verlieren. Die VEGFR-2-EpoR-Ba / F3-Zellen-Assay können Zelloberflächenexpression des chimären Konstrukts im Laufe der Zeit verlieren, wenn in Kultur für ausgedehnte Zeiträume gehalten. Das Beibehalten der guten Zahlen von flüssigem Stickstoff Bestände ermöglicht frischen Kulturen von Zellen in hohem Grade den chimären Rezeptor exprimieren jederzeit zur Verfügung stehen. Bei Bedarf kann eine hohe exprimierenden Bevölkerung seinerreicht, indem Zellen in VEGFR-2-Liganden und Auswählen der Bevölkerung exprimieren große Mengen des chimären Rezeptors durch Durchflusszytometrie Sortier wächst. Diese Zellen werden dann weiter in Kultur expandiert zum Einfrieren.
Während die Technik zur Analyse von Interaktionen mit dem VEGFR-2 extrazelluläre Domäne eine bequeme und einfache Alternative ist, kann es nicht zu ersetzen kompliziertere Experimenten gesehen werden, wo die nativen Rezeptor auf primären Endothelzellen in Gegenwart anderer VEGFRs sondiert wird, co-Rezeptoren, wie Neuropiline. Die Zellen, auf denen dieser Test basiert (B-Zellen) unterscheiden sich von Endothelzellen und sollten deshalb nicht verwendet werden, um die cytoplasmatische Signalwege und Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die an VEGFR-2-Aktivierung in Endothelzellen reagieren. Dennoch liefert das Verfahren einen nützlichen Ansatz Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu analysieren, die zwischen einem einfachen Bindungsassay liegt, die mit einem immobilisierten recep Wechselwirkung eines Liganden untersuchttor-Konstrukt (beispielsweise ein löslicher Rezeptor extrazelluläre Region oder einen Rezeptor extrazellulären Region zu Immunglobulins fusioniert) und die Analyse der Rezeptorbindung und stromabwärts in Bindungsassays auf primären Endothelzellen gesehen Wirkungen. Es stellt ein System Bindung und Vernetzung von Rezeptoren zu ermöglichen, wobei die ersten zwei Stufen, mit denen viele Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ihre Signaltransduktionskaskade häufig initiieren. Ihre Anwendung in einer Reihe von wissenschaftlichen und kommerziellen Einstellungen wurde gezeigt für die Prüfung Bindungseigenschaften als nützlicher Test angenommen wird, insbesondere, wenn Variante Liganden oder Inhibitoren der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zu bewerten.
Der Test ist auch nützlich für die Analyse von neuen Inhibitoren des Rezeptors extrazelluläre Domäne oder dessen Liganden. Der Assay weiter schnell verwendet werden, um Varianten der Liganden screenen oder extrazelluläre Rezeptorregionen in Zusammenhang mit der genomischen Mutationen gesehen (beide geerbt und somatische) in menschlichen ge gefundennes in Krankheiten wie Krebs 32,33 auf ihre funktionelle Konsequenz bestimmen. Daher sind die Anwendungen dieser VEGFR-2-Test sind wahrscheinlich in der Zukunft zu erweitern. Ferner kann der allgemeine Ansatz diesen Test zugrunde liegenden breiter Kinasen für die Zelloberflächen-Rezeptor-Tyrosin verwendet werden, die von Signalmolekülen in Gesundheit und Krankheit eine große und wichtige Familie bilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Steven A. Stacker und Marc M. Achen sind Aktionäre in Circadian Technologies Ltd., ein Unternehmen der Entwicklung Therapeutika durch die VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren abzielen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer |
| G418 Sulphate (Geneticin) | Invivogen | ant-gn-5 | Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties. |
| 3H-Thymidine | PerkinElmer | NET-027 | This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation |
| Vialight Plus Kit | Lonza | LT07-221 | Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent |
| Prestoblue Cell Viability Reagent | Invitrogen | A13261 | Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell |
| Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well) | Thermo Scientific | 136528 | Small microtitre plate |
| 96 well Tissue Culture Plate | Falcon, Corning Inc. | 353072 | |
| DMEM (1X) | Gibco | 11965-92 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Cell Harvester | Tomtec Life Sciences | Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester | |
| Liquid Scintillation Counter | LKB Wallac | 1205 | LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter |
| UniFilter-96 GF/B | Perkin Elmer | 6005177 | White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 µm poresize |
| Gentamicin | Gibco, Life Technologies | 15750-060 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco, Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.22 um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit | Costar, Corning Inc. | 8160 | Centrifuge tube filters have a 0.22 µm pore CA membrane-containing filter unit within a 500 µl capacity polypropylene microcentrifuge tube. |
| Fluorescence Reader | BioTek | BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader |
References
- Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 9, 669-676 (2003).
- Achen, M. G., Stacker, S. A. Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance. Growth Factors. 5, 283-296 (2012).
- Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration. Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).
- Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).
- Korpelainen, E. I., Alitalo, K.
- Senger, D. R., et al. Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Joukov, V., et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. EMBO J. 15, 290-298 (1996).
- Achen, M. G., et al. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).
- Leppanen, V. M., et al. Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity. Blood. 117, 1507-1515 (2011).
- Wise, L. M., et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).
- Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2). J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).
- Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K.
- Stacker, S. A., et al. VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics. Nat Med. 7, 186-191 (2001).
- Skobe, M., et al. Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis. Nat Med. 7, 192-198 (2001).
- Mandriota, S. J., et al. Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis. EMBO J. 20, 672-682 (2001).
- Stacker, S. A., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer. Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).
- Karnezis, T., et al. VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium. Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).
- Folkman, J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).
- Stacker, S. A., et al. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).
- McColl, B. K., et al. Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D. J Exp Med. 198, 863-868 (2003).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).
- Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).
- Pacifici, R. E., Thomason, A. R. Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand. J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).
- Stacker, S. A., et al. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).
- Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding. J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).
- Wise, L. M., et al. Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens. J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).
- Davydova, N., et al. Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies. Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).
- Baldwin, M. E., et al. Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis. J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).
- Baldwin, M. E., et al. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).
- Makinen, T., et al. Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3. EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).
- Achen, M. G., et al. Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3. Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).
- Bamford, S., et al. The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website. Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2010).
