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방법 논문

마우스 동정맥루 내피에 관내 약물 전달

9.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53905

⸱

2016년 3월 4일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery and the Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale University, 2Department of Vascular Surgery, University of Tokyo, 3Department of Vascular Surgery, VA Connecticut Healthcare Systems, 4Department of Vascular Surgery, International University of Health and Welfare Mita Hospital

이 논문에서

요약

하대정맥(IVC)을 통해 대동맥을 뚫어 마우스에 대동맥강 누공을 만든 후, 약물이 포함된 용액을 동일한 바늘을 통해 IVC에 주입한 다음 배양합니다. 이 방법은 외부 경로에 비해 정맥 내피에 더 강력한 약물 전달을 가능하게 합니다.

초록

치료제의 배달 동정맥루 (AVF) 성숙이 중 관내 또는 외부 경로를 통해 투여 될 수있다 강화한다. 간단한 AVF 뮤린 모델 누공 생성과 동시에 정맥 내피 약액 관내 투여와 결합시켰다. 이 모델의 기술적 인 측면을 설명합니다. 전신 마취하에 복부 절개가 이루어지고 대동맥과 하대 정맥 (IVC)가 노출된다. 적외선 신장 대동맥과 IVC는 클램핑에 대한 해부한다. 근위 및 원위 클램프 후에 천자 부위가 노출되고 25 G 바늘은 대동맥 및 IVC로 양쪽 벽을 천공하는데 사용된다. 즉시 천자 후, 리포터 유전자 발현 바이러스 벡터는 15 분 인큐베이션 한 후, 동일한 니들을 통해 IVC에 주입 하였다. 관내 투여 방법은 외부 경로에 의한 투여에 비해 정맥 내피 더 강력한 바이러스 성 유전자 전달을 활성화. 이 노브배달 방법은 L AVF 성숙에서 내피 세포의 역할을 살펴 수술시의 관내 약물 전달을 활성화 연구를 촉진 할 것이다.

서론

쥐 aortovenous 루 (AVF) 대동맥과 하대 정맥 (IVC) 사이의 구멍 모델은 지금에 나오는이 모델에서 확립 된 기술. 1, 25 G 바늘을 천공하는 적외선 신장 대동맥의 양쪽 벽이다 적외선 신장 대정맥 인접; 전방 대동맥 입구 구멍은 간단한 압축 수리 및 봉합 수리를 필요로하지 않습니다. 고해상도 도플러 초음파 조직 학적 분석에 의해 일련 후속 검사 성숙 단계 후 실패한 단계 인간 AVF의 알려진 기전을 recapitulating을 가지고 AVF를 나타낸다. 2

AVF의 성숙을 조절하는 메커니즘을 탐구하기 위해, 성숙 AVF의 내피 세포로 치료제의 전달을위한 개선 된 방법이 필요하다. 혈관 치료제의 배달 중 혈관 내 전달을 통해 루멘, 또는 외막에 외부 배달을 통해 할 수있다. 외부 납품의 일례이다 COMmonly는 플루로 닉 겔의 외막 응용 프로그램을 사용했다. 체온으로 가온 될 때이 공중 합체는, 열 가역성 겔 및 고체에서 액체로 변환된다. 플루 겔 혼합 약물이 생체 내에서 국소 적으로 적용될 때 종래 연구 도시 한 지속적인 약물 전달이 달성된다. 바이러스 벡터 또는 플루 겔의 siRNA 3,4- 외막 애플리케이션 혈관 주위 전달체로서 효과적인 것으로보고되었다. 5,6-에게 우리를 또한 펩타이드에 의해 외막 자극과 외식 인간 복재 정맥의 치료가 내피 세포 수용체 단백질의 인산화 결과보고 있습니다. (7)

반면에, 연구자들은 또한 정맥 이식편의 8 ~ 10 개 토끼 11, 12 모델 모두 바이러스 성 및 비 바이러스 벡터의 관내 배달을 사용하고 있습니다. 이 보고서에서 유전자 전달 수확을 정맥 후 생체 하였다. Eslami 등은. 혈관 내 바이러스 성 유전자 전달보고y를 바이 패스를 생성하지 않고 현장에서 혈관을 경동맥합니다. 13 Gloverman 등. 쥐 대퇴 동맥 - 표면 상복부 정맥 루에서 벌거 벗은 DNA의보고 관내 및 외막 배달. 14 메이요 그룹은 마우스 경동맥 동맥 - 경정맥 정맥 루의 외막 약물 전달을 보도했다. (15, 16) 그러나,이 이전에보고 된 모델을 만들 봉합 문합이 필요 AVF. 이 보고서에서 쥐에서 동시 AVF 생성과 관내 약물 전달은 AVF 창조의 봉합이없는 모델을 사용하여 설명한다. 이 변형 AVF 뮤린 모델을 사용하여 누공 정맥 사지 관내 약물 전달을위한 간단한 방법이 수행 될 수있다.

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프로토콜

해당 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻을 수있다.

1. 마취 및 수술 전 절차

  1. 아크릴 유도 챔버에 투여 기화 3 % 이소 플루 란과 0.8 L / 분 산소와 남성 C57BL / 6 얼음, 세 팔주를 마취.
  2. 발가락 핀치에 반응의 부족으로 적절한 마취를 확인합니다. 연속 흡입에 의해 3 %의 이소 플루 란 - 작업 테이블에 마우스 부정사를 놓고 실리콘 마스크를 위치 2 기화 제공한다.
  3. 화학적 제모 크림을 사용하여 복부 이하로 목에서 복부 머리를 제거합니다.
  4. 관심의 영역에서 동맥과 정맥의 흐름과 혈관 직경의 기본 특성을 기록하기 전에 AVF 수술에 도플러 초음파 검사를 수행합니다. 1,2
  5. 25 G 바늘로 1 ML의 주사기를 연결하고 원하는 약물을 주사기를로드합니다. 벤드 요구로부터 60도 각도로 바늘 약 4mm제작 팁. 곡선 바늘 홀더로 25 G 바늘을 잡고.

2. 수술 절차

  1. 국소 방부제와 절개 사이트를 준비하고 외과 드레이프를 적용합니다. 수술 전반에 걸쳐 무균 기술을 유지하기 위해 멸균 장갑과 악기를 사용합니다.
  2. 메스 그냥 치골 위를 하단 간 날의 수준에서 연장 중간 선 복부 절개를합니다.
  3. 트랙터를 삽입하고 오른쪽 방향으로 복강에서 모든 창자를 내용 만. 식염수로 적신 거즈에 창자를 감싸. 대동맥과 IVC의 전체보기를 얻기 위해 역 복막 및​​ 하부 대장을 연결하는 멤브레인을 해부하다.
  4. 근위 및 원위 체결을 준비하고, 주변 조직에서 적외선 신장 대동맥과 IVC를 해부하다.
  5. 근위 대동맥 바로 왼쪽 신장 정맥 아래 수준에서 근위 IVC 모두에서 하나의 미세 클립을 배치합니다. D 모두에서 두 번째 미세 클립을 배치istal 대동맥 및 말초 IVC.
  6. 대동맥 주위의 결합 조직을 잡고 대동맥의 등 표면이 약간 동맥 천자에 대한 노출되도록 전술 한 바와 같이, 내측 회전합니다. (1)
  7. 빠르게 펑크 사이트를 노출합니다. 천자 사이트는 혈관, 대동맥 분기에 왼쪽 신장 정맥으로부터의 거리의 약 3 분기 꼬리 측면에있을 것입니다. 오른손 천자 있도록 충분한 노출이되도록 왼쪽으로 회전 된 위치에 유지 대동맥, 대동맥의 왼쪽 측면 마진을 해부. 대동맥과 IVC 사이 해부하지 않도록주의하십시오.
  8. 회전 위치를 유지하고 대동맥 부착 1ml를 주사기 함유 약액에 25 G 바늘을 사용을 통해 IVC에 대동맥 천공. (도 1a)
  9. 왼손 사용 - (200 μL, 100) 약액을 주입. 바늘 팽창 얇은 통해 알 수있는투명 약액이 IVC (도 1B, C)에서 정맥혈 변위 IVC 벽. 남아 15 분 동안 위치에 바늘을 유지한다.
  10. 만 원위부 대동맥 및 말초 IVC를 클램프를 해제하기 위해 말초 미세 클립을 제거합니다.
  11. 바늘을 제거한 후 인접 역 복막 조직을 당겨 대동맥의 천자 사이트를 다룹니다.
  12. 근위 대동맥과 근위 IVC를 해제 클램프 근위 미세 클립을 제거합니다. 디 클램핑시, 동맥 혈액은 IVC 대신 어두운 정맥 혈류로 유입 관찰된다. 1 분 동안 구멍 구멍을 덮고 보관하십시오.
  13. 압축없이 30 초 동안 관찰하여 지혈의 확인 후, 그들의 자연적인 위치로 창자를 반환하고 승인 된 동물 프로토콜에 따라 실행 봉합과 복부를 닫습니다.

3. 수술 후 절차

  1. 복부의 폐쇄 후, ANEST을 중지hesia. 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 권장하는 지침에 따라 진통과 상처 치료를 포함한 수술 후 치료를 적용합니다. 진통제를 위해 우리는 / kg이 intrasmuscularly 24 시간마다 12 시간이 수술 절차에 따라 0.1 밀리그램에서 프레 노르 핀을 사용합니다.
  2. 수술 후 첫 날, AVF의 개통을 확인하는 도플러 초음파를 수행합니다. 또한, 다른 선박을 측정하고 연속적으로 유동 특성 및 수술 전 기본 값의 변화를 비교한다. 1,2

figure-protocol-1
AVF 수술시 관내 배달을보기 그림 1. (A) 수술 사진. 근위 및 말초 동맥뿐만 아니라, 미세 클립을 적용하여 IVC 클램프. 연결된 주사기 함유 약액에 25 G 바늘을 사용을 통해 IVC에 대동맥 천공. (B)를 HIG그녀의 전원 사진 주입하기 전에 구멍 IVC의 (4 배 확대). 바늘 끝은 어두운 색의 정맥혈에 의해 가려한다. 노란 화살촉은 주입 후 천공 IVC의 IVC. (C) 높은 전원 사진 (4 배 배율)의 벽에 벽 직경을 나타낸다. 니들 팁 (흑색 화살표) 정맥혈 변위 투명 약액 등 가볍게 팽창 IVC 얇은 벽 (노란 화살표 머리)를 통해 볼 수있다.

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결과

마우스 (33)의 연속으로, 제 수술 일에 생존은 97.0 %였다; 초음파에 의해 결정 AVF 개통, 84.9 %였다.

기존의 외부 노선이 혈관 내 전달 경로의 유전자 전달 효율을 비교 하​​였다. 관내 배달 (ILD), 즉시 천자 후, 아데노 바이러스-GFP의 200 μL (AD-GFP) 벡터 솔루션 (1 × 10 9 PFU / ml)에 15 분 배양 시간 뒤에, 천공 바늘을 통해 IVC에 주입했다 . 제어 마우스 플루 겔을 사용 IVC에 광고-GFP (1 × 10 9 PFU / ㎖)의 외막 전달 (AD)를 받았다. 시편은 아데노 바이러스 벡터에 노출 후 24 시간에서 외식 하였다. IVC 벽에서 GFP 및 누공의 발현은 항 GFP를 이용하여 섹션 형광 현미경뿐만 아니라 조직 학적 검사에 의해 내막에서 EN 얼굴 관찰에...

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토론

AVF 뮤린 모델이 수정 AVF 생성시 정맥 내피 관내 약물 전달을 포함한다. AVF는 25 G 바늘 적외선 신장 대동맥을 천공과 같은 바늘을 통해 약물 용액을 주입 한 다음 IVC에 반대 대동맥 벽을 통해 구멍을 확장하여 만들어졌습니다. 용액 내 대정맥 유지된다, 즉., AVF의 정맥 상지에서, 디 클램핑까지. 어떤 다른 쥐 AVF 모델 17-19에서이 모델을 구별하는 분자 분석 협착, 급성 혈전증, 가능한 간섭을 일으킬 수 있습니다 봉합 또는 접착제의 부족이다. 또한 AVF 루멘에 약물을 전달하기 위해 AVF를 만들 같은 대동맥을 천공 바늘과 IVC를 사용하는 능력은 최소한의 용기 조작으로 간단하게 제공 할 수 있습니다.

절차의 성공률과 일관성을 개선하기위한 몇 가지 중요한 단계 및 포인트가있다. 홍보IVC 대동맥과 oximal 클램프는 왼쪽 신장 정맥 아래에 배치됩니다. 적외선 신장 IVC의 상부에 대형 요추 정맥이있는 경우,이 선박 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 미국 재향 군인 사무국 생물 의학 실험실 연구 및 개발 프로그램 Merit Review Award I01-BX002336, 국립 보건원 보조금 R56-HL095498, 그리고 코네티컷 주 웨스트 헤이븐에 있는 VA Connecticut Healthcare System의 자원 및 시설 사용의 일부 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250Gd-water GFP 항체에서 30% 용액으로 사용
NOVUS BIOLOGICALS INCNB100-1770
Ad-CMV-GFPVECTOR BIOLABS1060
0.9% 염화나트륨 관개, USPBaxter2F7122
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8BD305122
BD 1 ml 주사기 투베르큘린 슬립 팁BD309659
ScalpelSurgical Design Inc22079707
6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c 리버스 커팅ETHICON INC697G
Vevo 770 초음파 기계 비주얼 소닉스 20 - 60 Mhz 스캔 헤드; RMV-704
혈관 클램프 Roboz 수술 기구 Co.RS-5424
클램프 적용 펜치 Roboz 수술 기구 Co.RS-5410

참고문헌

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