Introduction
Influenza A virus (IAV) is een omhuld virus en behoort tot de familie van Orthomyxoviridae. De genen worden gecodeerd op een gesegmenteerde negatieve-sense en enkelstrengs RNA genoom. Bij de mens, IAV veroorzaakt infecties van de luchtwegen, die voorkomen in seizoensgebonden epidemieën en draagt het potentieel voor wereldwijde pandemieën 1. Bij binding aan siaalzuur residuen van de gastheercel oppervlak 2 wordt IAV geïnternaliseerd door clathrine-afhankelijke endocytose en clathrine-onafhankelijke routes 3-8. De zure milieu (pH <5,5) in de endocytische vacuolen veroorzaakt een grote conformationele verandering in de iav spike glycoproteïne hemagglutinine (HA), waardoor fusie van de virale en endosomale membraan 9 late. Zodra de IAV capside (hier ook aangeduid als virale "kern") is ontsnapt uit late endosomen (GO) wordt onbekleed in het cytosol gevolgd door transport van de virale ribonucleoproteins (vRNPs) in de kern - de site of virus replicatie en transcriptie 10-13. Vóór zure activatie van het virus HA ervaart een geleidelijke afname in pH in de endocytische systeem, waarbij de kern voor de latere demontage 14-16 priemgetallen. In deze "priming" stap het M2 ionkanalen in het virale membraan bemiddelen de instroom van protonen en K +10,14,16. De verandering in ionische concentratie in het inwendige virus verstoort de interacties opgebouwd uit het virale eiwit matrix M1 en de acht vRNP bundel en vergemakkelijkt IAV ontmanteling in het cytoplasma volgende membraanfusie 10,14-17.
Directe en kwantitatieve analyse van de priming stap belemmerd doordat endosomen moeilijk om experimenteel. De vermelding proces is bovendien zeer non-synchrone. Daarnaast hebben eindpunt assays, zoals qRT-PCR van viraal RNA of vrijgegeven besmettelijkheidsmetingen, geen gedetailleerd beeld over de biochemische status van de virale Capsi biedend op elk stap van binnenkomst. Terwijl de verstoring van endosomen door siRNA of behandeling met geneesmiddelen aanzienlijk heeft bijgedragen aan het begrip van IAV binnenkomst 18-20, fine-tuning is moeilijk en gevoelig voor niet-specifieke bijwerkingen in de streng gecontroleerde endosoom rijping programma.
Om deze problemen te vermijden, hebben we een eerder ontwikkelde in vitro protocol gebaseerd op het gebruik van snelheidsgradiënt centrifugatie 17 aangepast. In tegenstelling tot andere pogingen 21,22, 23,24, die meestal zijn gebaseerd op combinaties van proteolytische splitsing en detergens behandeling, gevolgd door EM-analyse, deze benadering mogelijk een gemakkelijk meetbaar resultaat. Centrifugatie door verschillende helling lagen kan de sedimenteren deeltjes worden blootgesteld aan en reageren met veranderende condities op een gecontroleerde manier. In de gepresenteerde protocol IAV afgeleid van geklaarde allantoïsvocht of gezuiverde virale deeltjes gesedimenteerd in een tweelaags glycerolgradiënt waarbij de onderlaag bevat de niet-ionische detergens NP-40 (figuur 1). Omdat het virus komt in de tweede, detergent bevattende laag, wordt de virale lipide-envelop en envelop glycoproteïnen langzaam oplosbaar en achtergelaten. De kern, bestaande uit de acht vRNP bundel en wordt omgeven door een matrix laag, sedimenten als een stabiele structuur in de fractie pellet. Virale kerneiwitten zoals M1 en vRNP geassocieerde nucleoproteïne (NP), kunnen worden geïdentificeerd in de pellet door SDS-PAGE en Coomassie kleuring. Met name te maken van commercieel beschikbare gradiënt gelen en kleuring met de zeer gevoelige colloïdale Coomassie 25, maakt hoge precisie en detectie van zelfs kleine hoeveelheden virale kern geassocieerde eiwitten.
Dit stelt de basis voor testen of andere omstandigheden zoals pH, zoutconcentratie, en vermeende ontmanteling factoren hebben invloed op het sedimentatiegedrag van kernonderdelen en kern stabil teit. Hiertoe wordt alleen de onderste, detergent-bevattende laag in de glycerol gradiënt gemodificeerd door introductie van de factor of aandoening van belang. De techniek is bijzonder waardevol bij het onderzoek het effect van verschillende pH en zoutconcentraties op de integriteit van de kern 16 IAV geweest. Tussenstappen van IAV uncoating kan worden gevolgd onder dissociatie van de matrixlaag bij mild zure pH (<6,5), gevolgd door dissociatie vRNP bij pH 5,5 en lager 16,17 (Figuur 1). De laatste stap werd verder versterkt door de aanwezigheid van hoge K + -concentratie in de glycerollaag, als gevolg van een late endocytische omgeving 16. Zoals de virus en de kern gesedimenteerd door de gradiënt ervaren ze een veranderende milieu dat bootst omstandigheden in endosomen. Het resultaat was een stapsgewijze demontage van de virale kern in vitro, als aanvulling op de resultaten afgeleid van celbiologie assays.
t "> De hier gepresenteerde methode is snel ingeschakeld en zeer reproduceerbare analyse van IAV (X31 en A / WSN / 33) en IBV (B / Lee / 40) ontmantelingsmechanisme veroorzaakt door zure pH en het verhogen van K +16,17 evenals demontage van paramyxovirus kernen bij alkalische pH blootstelling 17. het is denkbaar dat de benadering kan worden aangepast aan andere omhulde virussen inzichten in de biochemische eigenschappen van het virale capside structuur en capside demontage groeit tijdens celinvoer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Buffers en Voorraadoplossingen
- Bereid MNT buffer (20 mM MES, 30 mM Tris en 100 mM NaCl) door het oplossen van 470 mg Tris HCl, 390 mg MES-hydraat en 580 mg NaCl in 80 ml DDH 2 O. Stel de buffer op pH 7,4 en brengen tot een eindvolume van 100 ml met DDH 2 O.
- Bereid drie identieke oplossingen van 500 mM MES buffer door het oplossen van 9,76 g MES hydrateren in 80 ml dH 2 O per stuk. Stel de buffers op pH 5,8, 5,4 en 5,0, respectievelijk door titratie met geconcentreerd NaOH. Breng elke buffer tot een eindvolume van 100 ml met dH 2 O.
- Bereid twee identieke oplossingen van 500 mM Tris-buffer door oplossen van 7,88 g Tris HCl in 80 ml dH 2 O en elk op pH 7,4 en 6,4, respectievelijk door titratie met geconcentreerd HCI. Breng de buffer tot een eindvolume van 100 ml met dH 2 O.
- Bereid 50% glycerol oplossing in dH 2 O en roer goed tot de glycErol is homogeen gemengd. Filtreer de oplossing door een Steritop filtereenheid (0,22 urn poriegrootte) in een glazen fles.
- Bereid 10% NP-40 oplossing en 1 M NaCl in dH 2 O.
- Bereid 25x geconcentreerde proteaseremmer door het oplossen van twee tabletten in 4 ml DDH 2 O.
2. Voorbereiding van de Glycerol Verlopen
- Bereid 5 ml detergent buffer master mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x geconcentreerd proteaseremmer) oplossing voor elke pH conditie te testen (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 en 5,0). Daartoe meng 9 ml van 1 M NaCl, 6 ml van 10% NP-40, 2,4 ml van 25x proteaseremmer beelden, en 9 ml DDH 2 0.
- Voor elke pH voorwaarde pipet 4,4 ml van de master mix in een 50 ml conische buis.
- Voor pH-waarden boven 5,8 voeg 0,6 ml van de respectieve pH 500 mM Tris voorraadoplossing aan de buis. Voor pH 5,8 en lager voeg 0,6 ml van de respectieve pH 500 mM MES voorraadoplossing.
- maak 5ml bufferoplossing met 300 mM NaCl, 2x proteaseremmer, 60 mM Tris pH 7,4 en DDH 2 O. Dit zal dienen als de detergens-vrije controle gradiëntbuffer.
- Eventueel fijn stel de pH van de oplossing op pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 en 5,0 door toevoeging van geconcentreerd HCI of NaOH oplossingen, respectievelijk.
- Voeg 5 ml van 50% glycerol tot 5 ml van het detergens-bevattende en detergens-vrije buffer mengsels resulterend in zes 25% glycerol oplossingen. Controleer de pH-waarden met behulp van pH-indicator strips.
LET OP: In het geval dat de gemeten pH-waarde aanzienlijk verschilt van de gewenste waarde, moet de respectievelijke oplossingen opnieuw worden voorbereid. - Bereid 15% glycerol oplossing door 50% glycerol voorraad dH 2 O in een 3: 7 verhouding.
3. Ultracentrifugatie van IAV
- Voeg 3 ml 15% glycerol oplossing in ultra-heldere centrifugeren buizen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) met behulp van een 5 ml spuit en een neeDLE (21 G, 9 cm lang). Niet druppels reactie op de binnenwand van de buis als deze de integriteit van de gradiënt kunnen verstoren. Herhaal dit tot een totaal van zes centrifugatie buizen, één voor elk van de vijf pH-omstandigheden te testen en een voor het controlemonster.
- Plaats voorzichtig 3,4 ml 25% glycerol oplossing onder de 15% glycerol laag met behulp van een 5 ml spuit en een lange naald. Zorg ervoor dat niet de twee lagen te mengen. Herhaal dit voor alle zes condities test met de respectieve pH glycerol oplossingen.
LET OP: Het werk in klasse II bioveiligheid kast voor de volgende stappen. - Voorzichtig overlay de glycerol gradiënten met 30 pi geklaarde allantoïsvocht dat IAV (X31, H3N2) verdund in 1 ml MNT buffer (komt overeen met ongeveer 20-30 ug totaal viraal eiwit) voor elk verloop.
- Balance tegengestelde buizen en plaats ze in een SW41 ultracentrifugatie rotor. Centrifugeer gedurende 150 min bij 55.000 xg en 12 ° C.
- Na het centrifugeren, zorgvuldigde bovenstaande vloeistof, dat wil zeggen, zowel glycerol lagen met behulp van een schone Pasteur pipet en een afzuiger. Resuspendeer de pellet in 40 pl (1x) niet-reducerende LDS monsterbuffer. Het is belangrijk om op en neer pipetteren meerdere malen de korrel volledig op te lossen. Breng het monster in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
4. SDS-PAGE van Pellet Fracties en Coomassie kleuring
- Verhit alle monsters bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Op dit punt kunnen monsters worden bewaard bij -20 ° C tot ze worden geanalyseerd door SDS-PAGE.
- Load 20 ul van de opgeloste pellets op een prefab gradiënt (4-12%) Bis-Tris mini gel en laat gedurende 1 uur bij 200 V in 1 x MOPS SDS loopbuffer.
- Maak fixatie-oplossing met 40% methanol en 10% ijsazijn in DDH 2 O.
- Incubeer de gel in fixatie oplossing 1 uur en vlekken overnacht in een 15 cm celkweekschaal met een voldoende hoeveelheid colloïdale Coomassie-oplossing onder zachtschudden bij kamertemperatuur.
Opmerking: Het is belangrijk om de schotel sluiten om verdamping van de kleuroplossing voorkomen. - Destain de gel in DDH 2 O. Vervang de DDH 2 O om de 15-20 min tot het gel achtergrond duidelijk wordt. Bewaar de gel in DDH 2 O bij 4 ° C totdat het wordt gescand op band kwantificering.
- Scan de gel met een hoge resolutie en het gebruik van in de handel verkrijgbare of op maat gemaakte software voor het kwantificeren van eiwit band intensiteiten. Trek het achtergrondsignaal uit een gebied dicht bij de respectievelijke banden en normaliseren deze waarden de detergentvrij controlemonsters (bij pH 7,4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals reeds besproken, priming in endosomen is nodig om de IAV kern uncoating bevoegd te maken. Protonering van de kern verzwakt interactie tussen M1 en vRNPs (uit het virale RNA, NP en de polymerasecomplex PB1 / PB2 / PA). Dit proces begint wanneer binnenkomende virus wordt blootgesteld aan een pH van 6,5 (of lager) begin endosomen (EE) en gaat door tot fuseert het virus bij ongeveer pH 5,0 les.
Om de daling van de pH nabootsen, de onderste laag van glycerol gradiënten werden op waardes tussen pH 7,4 en 5,0 bij een constante zoutconcentratie. X31 afgeleid van geklaarde allantoïsvloeistof werd onderworpen aan snelheidsgradiënt centrifugatie en geanalyseerd door SDS-PAGE (Figuur 2A, B). Zonder detergens in de gradiënt (figuur 2A lane1) intacte virions worden gepelleteerd, zoals blijkt uit de karakteristieke patroon vanbanden die HA (HA1 en HA2, 63 kDa), NP (56 kDa) en M1 (27 kDa) in de Coomassie gekleurde gel. Omdat de gel onder niet-reducerende omstandigheden werd uitgevoerd, worden proteolytisch gesplitst HA1 en HA2 nog verbonden door disulfidebindingen en laat deze ongeveer 64 kDa. Onder reducerende omstandigheden de banden die overeenkomen met HA1 en HA2 vlakbij de NP en M1 bands lijkt, respectievelijk, waardoor het moeilijk om getrouw interpreteren en vaststellen band intensiteiten die uitsluitend zijn afgeleid van de virale kern (figuur 2B).
Na toevoeging van NP-40 bij de bodem (25%) glycerol laag het virale envelop waaronder HA, NA en M2 waren oplosbaar en viruskern alleen tijdens ultracentrifugatie (Figuur 1 Figuur 2, laan 2) in de pellet neergeslagen. Beginnend met een pH beneden 6,5, is M1 geleidelijk verloren de pelletfractie, tot een minimum tussen pH 5,8 en 5,4 (Figuur2A, B). Hieronder pH 5,8 vRNPs werden gedissocieerd en dus verloren uit de pellet. Eerder is aangetoond dat in feite geheel vRNPs vrijkomen in de bovenlaag, zoals het vrijkomen gecorreleerd met het verlies van PB2 van de pellet fractie 16. Eiwitband intensiteiten bepaald, waaruit twee verschillende pH drempels voor het demonteren van de M1 laag en dissociatie van vRNP bundels respectievelijk (Figuur 2). Extra banden kunnen worden waargenomen op de gel, wat kan overeenstemmen met de polymerase-eiwitten PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa) en M2 (11 kDa). Door hun lagere kopie aantallen binnen IAV virions we konden niet op betrouwbare wijze hun identiteit vast te stellen en ze werden dan ook niet in aanmerking voor de kwantificering genomen.
Figuur 1: Schematische weergave van de IAV 
Figuur 2: IAV kern demontage in vitro na verzuring (A) In vitro demontage X31 kernen bij verschillende pH condities in de onderste glycerollaag.. Als controle werd NP-40 weggelaten uit de onderste glycerollaag (eerste baan). De monsters werden gescheiden door SDS-PAGE onder niet-reducerende omstandigheden, gevolgd door Coomassie kleuring. Virale eiwitbanden zijn aan de rechterkant aangegeven. (B) Densitometrische kwantificering van de intensiteit van virale eiwitbanden weergegeven in (A). Eiwitband intensiteiten voor M1 en NP werden genormaliseerd aan die bij pH 7,4 zonder NP-40. Gegevens worden weergegeven als middel duplo experimenten ± standaardafwijking (SD). Aangepast van Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virale capsiden zijn metastabiele macromoleculaire complexen. Tijdens de montage van de virionen inkapseling en condensatie van het virusgenoom vereist begin van de volgende ronde van infectie afhankelijk demontage van deze compacte capside structuur. Virussen zijn geëvolueerd om verschillende cellulaire mechanismen exploiteren om de coating-uncoating cyclus, zoals cellulaire receptoren, chaperones, proteolytische enzymen, fysische krachten door motor eiwitten of helicasen en pH en ionische schakelaars 26,27 regelen. Hier beschrijven we een in vitro benadering gebaseerd op een glycerol gradiënt centrifugatie specifiek het effect van aanjagers demontage van de IAV kern testen. De techniek kan eventueel worden aangepast ontleden uncoating processen van andere omhulde virussen.
Via colloïdale Coomassie, de grote structurele proteïnen iav M1, NP en HA kan duidelijk worden waargenomen in SDS-PAGE, zelfs met een relatief klein virus particle nummer. Nog een meer diepgaande karakterisering van de gesedimenteerde capside structuur en de samenstelling zou follow-up analyses vereisen, zoals elektronen microscopie (die eerder zijn voorgesteld 28), Western blotting, dynamische lichtverstrooiing of massaspectrometrie. Verdere uitbreiding van het protocol kan omvatten fractionering van het lager (25%) glycerol fase en analyse van de specifieke kerncomponenten.
Aanpassing van de onderste glycerollaag de optimale fusie pH van 5,0 (bij X31) leidde tot een bijna volledige scheiding van de matrixlaag (figuur 2) 16. Echter, ongeveer 30% van de invoer NP signaal nog aantoonbaar bij deze pH. Het is mogelijk dat door de afwezigheid van cellulaire factoren uncoating in deze opstelling, zoals recent geïdentificeerde histon deacetylase 6 (HDAC6) 18, onvolledige demontage gebeurt. In de cel, langzaam aanzuren van de virale kern en blootstelling aan een schakelaar van Na + K + 16. We kunnen niet uitsluiten dat in onze opstelling, de niet-ionische detergens gedeeltelijk zuur-belichte en gedestabiliseerd kern verstoort. Echter geen effect op de kern sedimenteren bij neutrale pH waargenomen aangeduid met gelijke eiwitband intensiteiten vergeleken met niet-oplosbaar monsters (Figuur 2A, vergelijk de lanen 1 en 2). Hoewel de test hier gepresenteerde bleek zeer reproduceerbare en voldoende zijn (als zodanig) robuust band kwantificeren, kan een bepaald bereik van verschil waargenomen.
Het gebruik van glycerol in dit protocol is essentieel voor de uitkomst van het experiment. Zoals eerder gemeld 17, ultracentrifugatie door een sucrosegradiënt destabiliseert de iav kern, die waarschijnlijk door een hoge osmotische kracht gecreëerd door sucrose. Zuivering van IAV via sucrose gradiënten kunnen vergelijkbare effecten uit te oefenen. Daarom vergeleken we-ei-gegroeid X31 afgeleid van cl arified allantoïsvocht en sucrose gezuiverd voorraden. Geen groot verschil waar te nemen met betrekking tot de invloed van zure pH op kernstabiliteit (gegevens niet getoond). Niettemin, met het oog op mogelijke bijwerkingen van het osmotisch actieve sucrose uit te sluiten, raden wij het uitvoeren van de in vitro uncoating assay met geklaarde allantoïsvocht of geconcentreerde celkweeksupernatants.
Naast de keuze van de gradiënt materiaal, is het belangrijk om de integriteit van de gradiënt teneinde geen invloed op de sedimentatiegedrag van de gelyseerde virale kernen en garanderen reproduceerbare resultaten te handhaven. Bovendien onvolledige resuspenderen van de pellet fractie na ultracentrifugatie waarschijnlijk leidt tot verschillende resultaten. Tenslotte raden wij de pH van het detergent bevattende bufferoplossingen voorkeur op dezelfde dag van het experiment kleine veranderingen in ionische concentratie drastisch effect op de virale kern stabiliteit kunnen hebben.
content "> Het is belangrijk op te merken dat afhankelijk van de specifieke iav stam verschillende demontage efficiënties kunnen optreden op basis van de eigenschappen van de respectievelijke M1 en NP varianten. Dit kan ook gelden voor mutante virussen. Derhalve pH drempels voor matrixlaag en vRNP dissociatie te bepalen voor de respectievelijke iav stam voor het meten extra invloeden. voor de analyse van specifieke voorwaarden voor virale core stability wij geven aanpassing van de onderste glycerollaag een pH-waarde zodat de helft-maximale demontage van M1 wordt bereikt. mogelijkheid de invloed van specifieke ionen of reductiemiddelen onderzoeken door aanpassing van de detergens bevattende laag dienovereenkomstig. Vermeende cellulaire uncoating factoren kunnen direct naar glycerol gradiënt worden toegevoegd. bij cytoplasmatische factoren kan een derde glycerollaag onderaan de gradiënt worden ingevoerd, die wordt ingesteld op neutrale pH, bevat de cellulaire factor van belang, en is vrij van detergens. zo the drielaags verloop zou nog beter bootsen de passage van het virus via de endocytische systeem en afgifte van gensegmenten in de neutrale cytoplasma.Samengenomen, geven we een robuuste maar eenvoudige in vitro bepaling voor IAV priming en ontmanteling, die de mogelijkheid van veelzijdige aanpassingen om diverse vragen in verband met IAV binnenkomst pakken heeft bestuderen. Bovendien kan het worden toegepast op invoerprocessen andere omhulde virussen met verwante uncoating mechanismen te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Yohei Yamauchi en Roberta Mancini voor het verstrekken van ons met reagentia. De AH laboratorium werd gesteund door de Marie Curie Initial Training Networks (ITN), de European Research Council (ERC), en door de Zwitserse National Science Foundation (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A.
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A.
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
