Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In vitro Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53909
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Introduction

Influenza A-virus (IAV) er et kappebærende virus og hører til familien af Orthomyxoviridae. Dets gener er kodet på et segmenteret negativ-sense og enkeltstrenget RNA-genom. Hos mennesker IAV forårsager luftvejsinfektioner, som opstår i årstidens udbrud af epidemier og bærer risikoen for globale pandemier 1. Efter binding til sialinsyrerester på værtscellens overflade 2, er IAV internaliseret af clathrin-afhængig endocytose og clathrin-uafhængige veje 3-8. Den sure miljø (pH <5,5) i de endocytiske vakuoler udløser en større konformationel ændring i IAV spike glycoprotein hemagglutinin (HA), hvilket resulterer i fusion af den virale og den sene endosomale membran 9. Når IAV capsidet (her også omtalt som viral "kerne") er undsluppet fra sent endosomer (LES), er det uovertrukne i cytosolen efterfulgt af transport af de virale ribonucleoproteiner (vRNPs) ind i kernen - sitet of virus replikation og transkription 10-13. Forud for syre aktivering af HA virussen oplever et gradvist fald i pH i endocytiske system, som primtal kernen for den efterfølgende demontering 14-16. I denne "priming" step M2 ionkanaler i den virale membran mægle tilstrømningen af protoner og K +10,14,16. Ændringen i ionkoncentration i virusset indre forstyrrer interaktionerne opbygget af det virale matrixprotein M1 og vRNP bundtet otte, og letter IAV uncoating i cytoplasmaet efter membranfusion 10,14-17.

Direkte og kvantitativ analyse af priming skridt er hæmmet af, at endosomer er vanskelige at få adgang til eksperimentelt. Punktet proces er i øvrigt særdeles ikke-synkron. Hertil kommer, at end-point assays, såsom QRT-PCR af frigivne virale RNA eller infektivitet målinger, ikke give et detaljeret billede om den biokemiske tilstand virale capsid på ethvert givet trin med post. Mens forstyrrelse af endosomer med siRNA eller lægemiddelbehandling har bidraget væsentligt til forståelsen af IAV post 18-20, finjustering er vanskelig og udsat for uspecifikke bivirkninger i tæt kontrolleret endosomet modning program.

For at undgå disse problemer har vi tilpasset en tidligere udviklet in vitro protokol baseret på anvendelsen af hastigheden gradientcentrifugering 17. I modsætning til andre forsøg 21,22, 23,24, som for det meste var baseret på kombinationer af proteolytisk spaltning og rengøringsmiddel behandling efterfulgt af EM analyse, denne tilgang aktiveret en let kvantificerbare resultat. Centrifugering gennem forskellige gradient lag tillader sedimenterende partikler, der skal udsættes for og reagerer med skiftende betingelser på en kontrolleret måde. I det præsenterede protokol, IAV afledt fra klaret allantoisvæske eller oprensede viruspartikler bundfældes i en to-lags glycerolgradient, hvor det nederste lag indeholder den ikke-ionisk detergent NP-40 (figur 1). Da virus ind i andet detergent-holdige lag, er de virale lipidkappe og kappeglycoproteiner forsigtigt solubiliseret og efterladt. Kernen, der består af de otte vRNP bundt og omgivet af en matrix lag, sedimenter som en stabil struktur i pelletfraktionen. Virale kerneproteiner, såsom M1 og vRNP-associeret nukleoprotein (NP), kan identificeres i pelleten ved SDS-PAGE og Coomassie-farvning. Især udnytter kommercielt tilgængelige gradientgeler og farvning med den meget følsomme kolloidt Coomassie 25, muliggør stor præcision og detektering af selv små mængder af virale kerne-associerede proteiner.

Dette sætter grundlaget for at teste, om forskellige forhold, såsom pH, saltkoncentration, og formodede overtrækkende faktorer har virkninger på sedimentering adfærd kernekomponenter og core stabil tet. Til dette formål er kun den nederste, detergent-indeholdende lag i glycerolgradient modificeret ved indføring faktoren eller tilstand af interesse. Teknikken har været særligt værdifulde undersøge virkningen af forskellige pH-værdier og saltkoncentrationer på integriteten af IAV kerne 16. Mellemliggende trin af IAV uncoating kunne overvåges herunder dissociering af matrixlaget ved mildt sur ​​pH (<6,5) efterfulgt af vRNP dissociation ved pH 5,5 og lavere 16,17 (figur 1). Det sidstnævnte trin blev yderligere forstærket af tilstedeværelsen af høj K + koncentration i glycerol lag, hvilket afspejler en sen endocytiske miljø 16. , Idet virus og kernen sedimenterede gennem gradienten oplevede de således en skiftende miljø, som efterligner tilstande i endosomer. Resultatet var en trinvis adskillelse af den virale kerne in vitro, der supplerer resultater stammer fra cellebiologiske assays.

t "> Metoden præsenteres her har muliggjort hurtig og meget reproducerbar analyse af IAV (X31 og A / WSN / 33) og IBV (B / Lee / 40) overtrækkende udløst ved sur pH og stigende K +16,17 samt demontering af paramyxo kerner upon alkalisk pH eksponering 17. det er tænkeligt, at denne metode kan tilpasses andre indkapslede vira at få indblik i de biokemiske egenskaber af det virale capsid struktur og capsid demontering under celleindtrængning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af buffere og stamopløsninger

  1. Forbered MNT puffer (20 mM MES, 30 mM Tris og 100 mM NaCl) ved at opløse 470 mg Tris hydrochlorid, 390 mg MES hydrat og 580 mg NaCl i 80 ml ​​Hedeselskabet 2 O. Juster buffer til pH 7,4 og bringe det til et endeligt volumen på 100 ml med Hedeselskabet 2 O.
  2. Forbered tre identiske opløsninger af 500 mM MES-buffer ved opløsning 9,76 g MES-hydrat i 80 ml ​​dH2O hver. Juster buffere til pH 5,8, 5,4 og 5,0, henholdsvis ved titrering med koncentreret NaOH. Bringe hver buffer til et endeligt volumen på 100 ml med dH 2 O.
  3. Forbered to identiske opløsninger af 500 mM Tris-buffer ved opløsning 7,88 g Tris-hydrochlorid i 80 ml ​​dH2O hver og pH indstilles til 7,4 og 6,4, henholdsvis ved titrering med koncentreret HCI. Bring buffer til et endeligt volumen på 100 ml med dH 2 O.
  4. Forbered 50% glycerolopløsning i dH2O og rør godt indtil Glycerol er homogent blandet. Opløsningen filtreres gennem et Steritop filterenhed (0,22 um porestørrelse) i en glasflaske.
  5. Forbered 10% NP-40-opløsning og 1 M NaCl i dH 2 O.
  6. Forbered 25x koncentreret proteasehæmmer ved at opløse to tabletter i 4 ml Hedeselskabet 2 O.

2. Fremstilling af glycerol Gradienter

  1. Forbered 5 ml detergent buffer mastermix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x koncentreret proteaseinhibitor) opløsning til hver pH tilstand til test (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, og 5,0). Til dette formål blandes 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml af 25x proteaseinhibitoren lager, og 9 ml Hedeselskabet 2 0.
  2. For hver pH tilstand pipette 4,4 ml master mix i en 50 ml konisk rør.
  3. For pH-værdier over 5,8 tilsættes 0,6 ml af de respektive pH-justeret 500 mM Tris-stamopløsning til røret. For pH 5,8 og lavere tilsættes 0,6 ml af de respektive pH-justeret 500 mM MES stamopløsning.
  4. Lav 5ml bufferopløsning indeholdende 300 mM NaCl, 2x proteaseinhibitor, 60 mM Tris indstillet til pH 7,4 og Hedeselskabet 2 O. Dette vil tjene som vaskemiddel-fri kontrol gradient buffer.
  5. Om nødvendigt fin-indstille pH af løsningerne på pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, og 5,0 ved tilsætning af koncentreret HCl eller NaOH-opløsninger, henholdsvis.
  6. Der tilsættes 5 ml af 50% glycerol lager til 5 ml af detergenten-holdige og detergent-fri buffer-blandinger resulterer i seks forskellige 25% glycerolopløsninger. Kontroller pH-værdier ved hjælp af pH-indikator strips.
    BEMÆRK: I tilfælde den målte pH adskiller sig væsentligt fra den ønskede værdi, skal de respektive løsninger være forberedt igen.
  7. Forbered 15% glycerolopløsning ved blanding 50% glycerol lager med dH2O i en 3: 7-forhold.

3. Ultracentifugering af IAV

  1. Tilsættes 3 ml 15% glycerolopløsning i ultra-klare centrifugeringsrør (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) ved anvendelse af en 5 ml sprøjte og en neeDLE (21 g, 9 cm lang). Efterlad ikke dråber ved den indre væg af røret, da dette kan forstyrre integriteten af ​​gradienten. Gentag dette for i alt seks centrifugeringsrør, en for hver af de fem pH-betingelser for at teste og én for kontrolprøven.
  2. Anbring forsigtigt 3,4 ml 25% glycerol-opløsning under 15% glycerol lag ved anvendelse af en 5 ml sprøjte og en lang nål. Pas på ikke at blande de to lag. Gentag dette for alle seks betingelser for at teste med de respektive pH-justerede glycerol løsninger.
    BEMÆRK: Arbejde i klasse II biosikkerhed kabinet til de følgende trin.
  3. Forsigtigt overlay de glycerol gradienter med 30 pi afklaret allantoisvæske indeholdende IAV (X31, H3N2) fortyndet i 1 ml MNT buffer (svarer til omkring 20-30 pg totalt viralt protein) for hver gradient.
  4. Balance modsatrettede rør og placere dem i en SW41 ultracentrifugering rotor. Centrifugeres i 150 min, ved 55.000 xg, og 12 ° C.
  5. Efter centrifugeringen, omhyggeligtFjern supernatanten, dvs., både glycerol lag ved hjælp af en ren Pasteur pipette og en aspirator. Pellet resuspenderes i 40 pi (1x) ikke-reducerende LDS prøvebuffer. Det er vigtigt at pipetteres op og ned flere gange for at opløse pelleten fuldstændigt. Overfør prøven i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.

4. SDS-PAGE af Pellet Brøker og Coomassie Farvning

  1. Opvarm alle prøver ved 95 ° C i 10 min. På dette tidspunkt prøverne kunne opbevares ved -20 ° C, indtil de analyseres ved SDS-PAGE.
  2. Load 20 pi af det opløste pellets ned på en præ-støbt gradient (4-12%) Bis-Tris mini gel og kørt i 1 time ved 200 V i 1 x MOPS SDS-løbebuffer.
  3. Lav fiksering løsning med 40% methanol og 10% iseddike i Hedeselskabet 2 O.
  4. Inkubere gelen i fiksering opløsning i 1 time og plette natten over i en 15 cm celledyrkningsskål med et tilstrækkeligt volumen af ​​kolloid Coomassie-opløsning under forsigtigomrystning ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at lukke fadet for at undgå fordampning af farveopløsning.
  5. Affarves gelen i Hedeselskabet 2 O. Udskift Hedeselskabet 2 O hver 15-20 min, indtil gelen baggrund bliver klar. Opbevar gelen i Hedeselskabet 2 O ved 4 ° C, indtil det er scannet for band kvantificering.
  6. Scan gelen ved høj opløsning og bruge kommercielt tilgængelige eller skræddersyet software til kvantificering af protein band intensiteter. Fratræk baggrundssignalet fra en region tæt på de respektive bånd og normalisere disse værdier til de detergent-fri kontrolprøver (ved pH 7,4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som allerede diskuteret, priming i endosomer er forpligtet til at gøre IAV kerne uncoating kompetent. Protonering af kernen svækker interaktionen af ​​M1 og vRNPs (sammensat af det virale RNA, NP, og polymerasen komplekse PB1 / PB2 / PA). Denne proces påbegyndes, når indkommende virus udsættes for en pH-værdi på 6,5 (eller lavere) i tidlige endosomer (EBS) og fortsætter indtil fusionerer virusset ved omkring pH 5,0 i LES.

For at efterligne fald i pH, blev det nederste lag af glycerol gradienter justeret til værdier mellem pH 7,4 og 5,0 ved en konstant saltkoncentration. X31 afledt fra klaret allantoisvæske blev underkastet hastighedsgradient centrifugering og analyseret ved SDS-PAGE (figur 2A, B). Uden vaskemiddel til stede i gradienten (figur 2A, bane 1) intakte virioner pelleteres, som afspejlet ved den karakteristiske mønster afbands repræsenterer HA (HA1 og HA2, 63 kDa), NP (56 kDa), og M1 (27 kDa) i Coomassie-farvet gel. Da gelen blev kørt under ikke-reducerende betingelser, spaltes proteolytisk HA1 og HA2 stadig er forbundet ved disulfidbindinger og kørt ved ca. 64 kDa. Under reducerende betingelser de bånd svarende til HA1 og HA2 synes meget tæt på NP- og M1 bands henholdsvis gør det vanskeligt at trofast fortolke og bestemme båndintensiteter, der udelukkende er fremstillet virale kerne (figur 2B).

Efter tilsætning af NP-40 til bunden (25%) glycerol lag viruskappen herunder HA, NA, og M2 var solubiliseret og den virale kerne alene sedimenteret i pelleten under ultracentrifugering (figur 1, figur 2, bane 2). Startende med en pH-værdi under 6,5, er M1 gradvist tabt fra pellet fraktion, nåede et minimum mellem pH 5,8 og 5,4 (figur2A, B). Nedenfor pH blev 5,8 vRNPs dissocieret og dermed tabt fra pillen. Tidligere er det blevet vist, at i virkeligheden er hele vRNPs frigives i det øvre lag, som deres frigivelse korreleret med tabet af PB2 fra pelletfraktionen 16. Protein båndintensiteter blev bestemt, afslører to særskilte pH tærskler for demontering af M1 lag og dissociation af vRNP bundter, henholdsvis (figur 2). Yderligere bånd kunne observeres på gelen, hvilket kan svare til polymeraseproteiner PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), og M2 (11 kDa). På grund af deres lavere tal kopi inde IAV virioner kunne vi ikke pålideligt bestemme deres identitet, og de blev derfor ikke taget i betragtning til kvantificering.

figur 1
Figur 1: Skematisk afbildning af IAV in vitro core demontering assay. Kort fortalt oprensede viruspartikler fyldt på en to-trins glycerol-gradient. Bundlaget indeholder detergent NP-40 og justeres til den ønskede pH og saltkoncentration, mens den øvre, detergent-fri lag holdes ved en konstant pH og saltkoncentration. Afhængigt af tilstanden i det nedre glycerol lag, komplette virale kerner sedimenterer til bunden (1) eller dissocieres og forbliver i glycerol lag (2). Neutral pH fører til bundfældning af intakte virale kerner bestående af M1 og vRNPs. Gunstige betingelser for uncoating, såsom sur pH (5,0), resulterer i dissociation af de virale kernekomponenter og derfor tab fra pellet-fraktionen. Efter ultracentrifugering, er glycerol supernatanter fjernet og pellets analyseres ved SDS-PAGE. Klik her for at se en større version af dette tal. p>

Figur 2
Figur 2: IAV core demontering in vitro ved syrning (A) In vitro afmontering af X31 kerner ved forskellige pH-betingelser i den nedre glycerol lag.. Som en kontrol blev NP-40 udeladt fra bunden glycerol lag (første bane). Prøver blev separeret ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser efterfulgt af Coomassie-farvning. Virale proteinbånd er angivet til højre. (B) Densitometrisk kvantificering af intensiteterne af virale proteinbånd vist i (A). Protein band intensiteter for M1 og NP blev normaliseret til dem ved pH 7,4 uden NP-40. Data er repræsenteret som middel til dobbeltforsøg ± standardafvigelse (SD). Tilpasset fra Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Virale capsider er metastabile makromolekylære komplekser. Mens samlingen af ​​virioner kræver indkapsling og kondensation af virusgenomet, initiering af den næste runde af infektion afhænger demontering af denne kompakte capsid struktur. Vira har udviklet sig til at udnytte forskellige cellulære mekanismer til at kontrollere belægningen-uncoating cyklus, herunder cellulære receptorer, chaperoner, proteolytiske enzymer, fysiske kræfter leveret af motordrevne proteiner eller helicaser samt pH og ioniske omskiftere 26,27. Her beskriver vi en in vitro fremgangsmåde baseret på en glycerol-gradient centrifugering til specifikt at teste virkningen af faktorer, som fremmer adskillelse af IAV kerne. Teknikken kan potentielt indrettet til dissekering overtrækkende processer af andre indkapslede vira.

Ved at bruge kolloid Coomassie, de store strukturelle IAV proteiner M1, NP, og HA klart kan påvises i SDS-PAGE selv med et relativt lille virus particle nummer. Men en mere dybdegående karakterisering af det sedimenterede capsid struktur og dens sammensætning vil kræve opfølgning analyser, såsom elektronmikroskopi (som tidligere præsenterede 28), Western blotting, dynamisk lysspredning eller massespektrometri. Yderligere forlængelse af protokollen kunne omfatte fraktionering af den nedre (25%) glycerol fase og analyse af de specifikke kernekomponenter.

Justering af det nedre glycerol lag til det optimale fusion pH på 5,0 (for X31) førte til en næsten fuldstændig dissociation af matrixlaget (figur 2) 16. Imidlertid kan stadig påvises cirka 30% af input NP-signalet ved denne pH. Det er muligt, på grund af fraværet af cellulære overtrækkende faktorer i denne opsætning, såsom nylig identificeret histon deacetylase 6 (HDAC6) 18, ufuldstændig adskillelse forekommer. Inde i cellen, at langsom syrning af den virale kerne og eksponering for et skift fra Na + K + 16. Vi kan ikke udelukke, at i vores setup, det ikke-ioniske detergent delvis forstyrrer syre-eksponerede og destabiliseret kerne. Imidlertid ingen virkning på kernen sedimenterende ved neutral pH observeret angivet med lignende intensiteter proteinbånd sammenlignet med ikke-opløseliggjorte prøver (figur 2A, sammenlign bane 1 og 2). Selv om analysen præsenteres her vist sig at være særdeles reproducerbar og (som sådan) robust nok til band kvantificering, kunne observeres et bestemt interval af variation.

Anvendelsen af ​​glycerol i denne protokol er kritisk for resultatet af forsøget. Som tidligere rapporteret 17, ultracentrifugering gennem en saccharosegradient destabiliserer IAV kerne, hvilket sandsynligvis skyldes en høj osmotisk kraft skabt af saccharose. Oprensning af IAV via saccharosegradienter kunne udøve lignende virkninger. vi sammenlignet derfor æg-dyrket X31 afledt af cl arified allantoisvæske og sucrose-oprenset bestande. Ingen større forskel kunne observeres med hensyn til indflydelsen af ​​sur pH på core stabilitet (data ikke vist). Men for at udelukke potentielle bivirkninger af den osmotisk aktive saccharose, anbefaler vi at udføre in vitro uncoating assay med klaret allantoisvæske eller koncentrerede cellekultursupernatanter.

Udover valget af gradienten materiale, er det vigtigt at bevare integriteten af ​​gradienten til ikke påvirke sedimentation opførsel af lyserede virale kerner og sikre reproducerbare resultater. Desuden ufuldstændig resuspension af pelleten fraktion efter ultracentrifugering sandsynligvis fører til forskellige resultater. Endelig anbefaler vi kraftigt justering af pH i de detergent-indeholdende bufferopløsninger helst på samme dag af forsøget som små ændringer i ionkoncentration kan have en drastisk virkning på den virale kerne stabilitet.

indhold "> Det er vigtigt at bemærke, at afhængigt af den særlige IAV stamme, kan forskellige afmontering effektiviteter ske på baggrund af egenskaberne af de respektive M1 og NP varianter. Dette kan også gælde for mutantvirus. Således pH tærskler for matrixlag og vRNP dissociation har skal bestemmes for de respektive IAV stammen før teste yderligere påvirkninger. til analyse af specifikke forhold på viral core stabilitet vi foreslår at justere bunden glycerol lag til en pH-værdi, så halvmaksimal afmontering af M1 er opnået. det er muligt, at undersøge indflydelsen af ​​specifikke ioner eller reduktionsmidler ved at modificere detergent-holdige lag tilsvarende. Formodede cellulære overtrækkende faktorer kunne tilføjes direkte til glycerol-gradient. i tilfælde af cytoplasmatiske faktorer, kan et tredje glycerol lag i bunden af ​​gradienten være indført, som justeres til neutral pH, indeholder den cellulære faktor af interesse, og er uden detergent. på denne måde the trelags gradient ville endda mere nøje efterligner passage af virus gennem endocytiske systemet og frigivelse af gensegmenter til neutral cytoplasma.

Tilsammen præsenterer vi en robust alligevel enkel in vitro assay at studere IAV priming og uncoating, som har potentiale for alsidige ændringer for at løse forskellige spørgsmål i forbindelse med IAV indrejse. Desuden kan den anvendes til at undersøge entry processer af andre indkapslede vira med beslægtede overtrækkende mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Yohei Yamauchi og Roberta Mancini til at forsyne os med reagenser. Den AH laboratorium blev støttet af Marie Curie Initial Training Networks (ITN), Det Europæiske Forskningsråd (ERC), og af den schweiziske National Science Foundation (Sinergia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 11873580001 The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid Merck Millipore 100063
Glycerol anhydrous BioChemica AppliChem A1123
Hydrochloric acid Merck Millipore 100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Methanol Merck Millipore 106009
NP-40 Sigma-Aldrich I8896 Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm Life Technologies NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Technologies NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) Life Technologies NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0 Merck Millipore 109542
QC Colloidal Coomassie Stain BIO RAD 1610803
Sodium chloride Merck Millipore 106406
Sodiumhydroxide Merck Millipore 106498
Steritop filter unit Merck Millipore SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set Beckman Coulter 331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Tris hydrochloride  AppliChem A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid Virapur Freshly thawed on 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Tags

Infektion influenza A-virus virus indrejse uncoating M1 vRNPs ultracentrifugering
<em>In vitro</em> Demontering af influenza A-virus capsider ved gradientcentrifugering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stauffer, S., Nebioglu, F.,… More

Stauffer, S., Nebioglu, F., Helenius, A. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (109), e53909, doi:10.3791/53909 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter