Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

In Vitro Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53909
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Introduction

Influensa A-virus (IAV) er en omhyllet virus og tilhører familien av Orthomyxoviridae. Dens gener er kodet på en segmentert, negativ-sense og enkelt-trådet RNA-genom. Hos mennesker fører IAV luftveisinfeksjoner, som oppstår i sesong epidemiske utbrudd og bærer potensialet for globale pandemier 1. Ved binding til sialsyreresiduer på vertscelleoverflaten 2, er IAV internalisert av clathrin-avhengig endocytose og klatrin-uavhengige veier 3-8. Den sure miljø (pH <5,5) i de endocytiske vakuoler utløser en større konformasjonsendring i IAV pigg glykoprotein hemagglutinin (HA), noe som resulterer i sammensmelting av det virale og slutten av det endosomale membran 9. Når IAV kapsid (her også referert til som viral "kjerne") har unnsluppet fra sen endosomer (LES), blir den ubelagte i cytosol, etterfulgt av transport av de virale ribonucleoproteins (vRNPs) inn i kjernen - o områdetf virusreplikasjon og transkripsjon 10-13. Før syreaktivering av HA viruset opplever en gradvis reduksjon i pH-verdien i den endocytiske systemet, som klargjør kjerne for den etterfølgende demontering 14-16. I denne "priming" step M2 ionekanaler i viral membranen megle tilstrømningen av protoner og K +10,14,16. Endringen i ionekonsentrasjonen i viruset indre forstyrrer interaksjoner bygges opp av det virale proteinet matrise M1 og de ​​åtte vRNP bunten, og letter IAV avkapsling i cytoplasma følgende membranfusjon 10,14-17.

Direkte og kvantitativ analyse av grunningstrinn er blitt hemmet av det faktum at endosomer er vanskelig å få tilgang eksperimentelt. Oppføringen prosessen er dessuten svært ikke-synkrone. I tillegg trenger end-point-analyser, slik som QRT-PCR av frigjorte virale RNA eller infektivitet målinger, ikke gir et detaljert bilde om det biokjemiske tilstand av viral capsid på et gitt trinn av oppføring. Mens forstyrrelse av endosomes av siRNA eller medikamentell behandling har i betydelig grad bidratt til forståelsen av IAV oppføring 18-20, finjustering er vanskelig og utsatt for uspesifikke bivirkninger i kontrollert endosomet modning program.

For å unngå disse problemene, har vi tilpasset en tidligere utviklet in vitro protokoll basert på bruk av hastighetsgradienten sentrifugering 17. I motsetning til andre forsøk 21,22, 23,24, som var for det meste basert på kombinasjoner av proteolytisk spaltning og vaskemiddel behandling etterfulgt av EM-analyse, denne tilnærmingen mellom en lett målbar resultat. Sentrifugering gjennom forskjellige graderte lag gjør at sedimenterende partikler å bli utsatt for og reagerer med endrede forhold i en kontrollert måte. I den fremlagte protokoll, IAV avledet fra klaret allantoinvæske eller rensede virale partikler sedimenteres i en to-lags glycerolgradient hvor bunnlaget inneholder det ikke-ioniske vaskemiddel NP-40 (figur 1). Som viruset kommer inn i andre, vaskemiddel inneholdende lag, blir de virale kappe lipid og konvolutt glykoproteiner forsiktig oppløst og etterlot seg. Kjernen, som består av de åtte vRNP bunt og omgitt av en matrise lag, sedimenter som en stabil struktur inn i pellet fraksjonen. Virale kjerneproteiner, slik som M1 og vRNP-assosiert nukleoprotein (NP), kan identifiseres i pellet ved hjelp av SDS-PAGE og Coomassie-farging. Spesielt å utnytte kommersielt tilgjengelige gradient gels og farging med den svært følsomme kolloidalt Coomassie 25, gir høy presisjon og påvisning av selv små mengder viruskjerne-assosierte proteiner.

Dette setter grunnlaget for å teste om ulike forhold som pH, saltkonsentrasjon, og antatte avkapsling faktorer har effekter på sedimente oppførselen til kjernekomponenter og kjernen stabil ligheten. For å oppnå dette målet, er bare den nedre, vaskemiddel inneholdende lag i glycerol gradienten modifisert ved innføring av faktor eller tilstanden av interesse. Teknikken har vært spesielt verdifullt i å undersøke virkningen av forskjellige pH-verdier og saltkonsentrasjoner på integriteten til IAV kjerne 16. Mellomliggende trinn av IAV avkapsling kan bli overvåket inkluderer dissosiasjon av matrikslaget i svakt surt pH (<6,5) etterfulgt av vRNP dissosiasjon ved pH 5,5 og lavere 16,17 (figur 1). Det sistnevnte trinn ble ytterligere forbedret ved nærværet av høye K + konsentrasjon i glycerol lag, noe som reflekterer en sen endocytiske miljø 16. Således, som viruset og kjernen sedimentert gjennom graderingen de opplevde en endring miljø som etterligner forholdene i endosomer. Resultatet var en trinnvis demontering av viral kjerne in vitro, sammenfallende resultater avledet fra cellebiologi analyser.

t "> Metoden som presenteres her har gjort det mulig rask og reproduserbar analyse av IAV (X31 og A / WSN / 33) og IBV (B / Lee / 40) avkapsling utløst av sur pH og økende K +16,17 samt demontering av paramyksovirus kjerner ved alkalisk pH eksponering 17. det kan tenkes at tilnærmingen kan tilpasses andre kappekledde virus å få innsikt i de biokjemiske egenskaper av viral capsidstruktur og kapsid demontering under celle oppføring.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og arkivløsninger

  1. Forbered MNT buffer (20 mM MES, 30 mM Tris og 100 mM NaCl) ved oppløsning av 470 mg Tris hydroklorid, 390 mg MES hydrat og 580 mg NaCl i 80 ml ​​DDH 2 O. Juster buffer til pH 7,4 og bringe den til et sluttvolum på 100 ml med DDH 2 O.
  2. Fremstille tre identiske oppløsninger av 500 mM MES-buffer ved å oppløse 9,76 g MES-hydrat i 80 ml ​​dH 2 O hver. Juster buffere i pH 5,8, 5,4 og 5,0 henholdsvis, ved å titrere med konsentrert NaOH. Bringe hver buffer til et sluttvolum på 100 ml med dH 2 O.
  3. Fremstille to identiske løsninger av 500 mM Tris-buffer ved å oppløse 7,88 g tris-hydroklorid i 80 ml ​​dH 2 O hverandre og justere pH til 7,4 og 6,4, respektivt, ved å titrere med konsentrert HCl. Bringe buffer til et sluttvolum på 100 ml med dH 2 O.
  4. Forbered 50% glyserol løsning i dH 2 O og rør godt til glycErol er homogent blandet. Filtrer løsningen gjennom et Steritop filterenhet (0,22 um porestørrelse) inn i en glassflaske.
  5. Forbered 10% NP-40-løsning og en M NaCl i dH 2 O.
  6. Forbered 25x konsentrert proteasehemmer ved å oppløse to tabletter i 4 ml DDH 2 O.

2. Utarbeidelse av glyserol Graderinger

  1. Forbered 5 ml vaskemiddel buffer mester mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, konsentrert 2x proteasehemmer) løsning for hver pH tilstanden til test (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 og 5,0). For dette formål blander 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml av 25x proteaseinhibitor lager, og 9 ml DDH 2 0.
  2. For hver tilstand pH-pipette 4,4 ml av konsentrat-blanding inn i et 50 ml konisk rør.
  3. For pH-verdier over 5,8 Tilsett 0,6 ml av den respektive pH-justert 500 mM Tris-stamoppløsning til røret. For pH 5,8 og lavere Tilsett 0,6 ml av den respektive pH-justert 500 mM MES stamløsning.
  4. Gjør 5ml bufferoppløsning inneholdende 300 mM NaCl, 2 x protease-inhibitor, 60 mM Tris justert til pH 7,4 og DDH 2 O. Dette vil fungere som vaskemiddel-frie kontroll gradient buffer.
  5. Hvis det er nødvendig, fin-justering av pH i løsningene på pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 og 5,0 ved tilsetning av konsentrert HCl eller NaOH-oppløsninger, respektivt.
  6. Tilsett 5 ml av 50% glyserol lager til 5 ml av detergent-holdige og detergent-fri buffer-blandinger som resulterer i seks forskjellige 25% glyserol løsninger. Kontroller pH-verdier ved hjelp av pH-indikator strimler.
    MERK: Hvis målt pH skiller seg vesentlig fra den ønskede verdi, bør de respektive løsninger være forberedt igjen.
  7. Fremstille 15% glycerol-løsning ved å blande 50% glycerol lager med dH 2 O i en 3: 7-forhold.

3. Ultrasentrifugering av IAV

  1. Tilsett 3 ml 15% glyserol oppløsning inn i ultra klare sentrifugeringsrør (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) ved anvendelse av en 5 ml sprøyte og en needle (21 g, 9 cm lang). Ikke la dråpene i den indre veggen av røret, da dette kan forstyrre integriteten av gradienten. Gjenta dette for en total av seks sentrifugeringsrør, en for hver av de fem pH-betingelser for å teste og en for kontrollprøven.
  2. Plasser forsiktig 3,4 ml 25% glycerol oppløsning under 15% glycerol lag ved anvendelse av en 5 ml sprøyte og en lang nål. Pass på å ikke blande de to lagene. Gjenta dette for alle seks forhold for å teste med de respektive pH-justerte glyserol løsninger.
    MERK: Arbeid i klasse II biosikkerhet skap for de neste trinnene.
  3. Forsiktig overlegg av glyserol gradienter med 30 pl avklart allantoinvæske inneholder IAV (X31, H3N2) fortynnet i en ml MNT buffer (tilsvarer rundt 20-30 mikrogram total virusprotein) for hver gradient.
  4. Balanse motsatte rør og plassere dem i en SW41 ultracentrifugation rotor. Sentrifuger i 150 min, ved 55 000 xg, og 12 ° C.
  5. Etter sentrifugering, omhyggeligFjern supernatanten, dvs. både glyserol lag ved hjelp av en ren Pasteur pipette og en vifte. Resuspender pelleten i 40 ul (1x) ikke-reduserende prøvebuffer LDS. Det er viktig å pipettér opp og ned flere ganger for å oppløse pelleten fullstendig. Overføre prøven til et 1,5 ml mikrosentrifugerør.

4. SDS-PAGE av pellets Brøk og Coomassie Beising

  1. Oppvarm alle prøvene ved 95 ° C i 10 min. På dette tidspunkt prøvene kunne lagres ved -20 ° C inntil de blir analysert ved SDS-PAGE.
  2. Belastning 20 ul av de oppløste pellets bort på et pre-støpt gradient (4-12%) Bis-Tris mini-gel og kjørt i 1 time ved 200 V i 1 x MOPS-SDS buffer.
  3. Gjør fiksering løsning med 40% metanol og 10% iseddik i DDH 2 O.
  4. Inkuber gel i fikseringsløsning for en time og beis over natten i en 15 cm cellekultur parabolen med et tilstrekkelig volum av kolloidalt Coomassie løsning mens forsiktigristing ved romtemperatur.
    MERK: Det er viktig å lukke retten for å unngå fordamping av fargeløsning.
  5. Destain gelen i DDH 2 O. Bytt DDH 2 O hvert 15-20 min før gel bakgrunnen blir klar. Oppbevar gel i DDH 2 O ved 4 ° C til den er skannet for bandet kvantifisering.
  6. Skann gel med høy oppløsning og bruke kommersielt tilgjengelig eller skreddersydd programvare for kvantifisering av protein bandet intensiteter. Trekk fra bakgrunnssignalet fra et område i nærheten av de respektive bånd og normalisere disse verdiene til de detergent-fri kontrollprøver (ved pH 7,4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som allerede diskutert, grunning i endosomer er nødvendig for å gjengi IAV kjernen avkapsling kompetent. Protonering av kjernen svekker interaksjonen mellom M1 og vRNPs (sammensatt av det virale RNA, NP, og den polymerasekompleks PB1 / PB2 / PA). Denne prosessen blir initiert når innkommende virus utsettes for en pH-verdi på 6,5 (eller lavere) i tidlige endosomer (EES) og fortsetter inntil smelter viruset ved omkring pH 5,0 i LES.

For å etterligne reduksjon av pH, ble det nederste laget av glyserol-gradienter justert til verdier mellom pH 7,4 og 5,0 ved en konstant saltkonsentrasjon. X31 er avledet fra klaret allantoinvæske ble underkastet hastighetsgradient sentrifugering og analysert ved hjelp av SDS-PAGE (figur 2A, B). Uten vaskemiddel til stede i gradienten (figur 2A, lane1) intakte virioner pelleteres, som reflekteres av det karakteristiske mønster avbånd som representerer HA (HA1 og HA2, 63 kDa), NP (56 kDa), og M1 (27 kDa) i Coomassie-farget gel. Siden gelen ble kjørt under ikke-reduserende betingelser, blir proteolytisk spaltet HA1 og HA2 fortsatt er forbundet ved hjelp av disulfidbindinger, og løpe på omtrent 64 kDa. Under reduserende betingelser båndene svarende til HA1 og HA2 ville se ut like i nærheten av NP og M1 band, henholdsvis, noe som gjør det vanskelig å tolke og trofast bestemme båndintensitetene som er utelukkende avledet fra det virale kjerne (figur 2B).

Ved tilsetning av NP-40 til bunnen (25%) glycerol lag viruskappen inkluderer HA, NA, og M2 var oppløst og det virale kjerne alene sedimentert inn mot pellet under ultrasentrifugering (figur 1, figur 2, spor 2). Fra og med en pH-verdi under 6,5, er M1 gradvis mistet fra pelletfraksjonen, og nådde et minimum mellom pH 5,8 og 5,4 (figur2A, B). Nedenfor pH ble 5,8 vRNPs dissosiert og dermed tapt fra pelleten. Tidligere har det vist seg at, i virkeligheten, blir hele vRNPs frigjøres i det øvre lag, som deres frigivelse korrelert med tap av PB2 fra pelletfraksjonen 16. Protein bandet intensiteter ble bestemt, avslører to forskjellige pH-terskler for demontering av M1 lag og dissosiasjon av vRNP bunter, henholdsvis (figur 2). Ytterligere bånd kunne observeres på gelen, noe som kan tilsvare den polymerase proteiner PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), Pennsylvania (83 kDa) og M2 (11 kDa). På grunn av deres lavere kopiantall inne IAV virions vi ikke kunne sikkert fastslå deres identitet, og de ble derfor ikke tatt hensyn til kvantifiseringen.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av IAV in vitro kjerne demontering analysen. I korthet, blir rensede viruspartikler lastet på en to-trinns gradient glycerol. Bunnlaget inneholder vaskemiddel NP-40, og er justert til den ønskede pH og saltkonsentrasjon, mens den øvre, detergent-fri lag holdes på en konstant pH og saltkonsentrasjon. Avhengig av tilstanden i det nedre lag glycerol, fullstendige virale kjerner sedimentere til bunnen (1) eller dissosiert og forbli i glycerol lag (2). Nøytral pH fører til sedimentering av intakte virale kjerner består av M1 og vRNPs. Betingelser som er gunstige for avkapsling, som for eksempel sur pH (5,0), resulterer i dissosiering av de virale kjernekomponenter og derfor tap fra pelletfraksjonen. Etter ultrasentrifugering, er glyserol supernatantene fjernet og pellets blir analysert ved SDS-PAGE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. p>

Figur 2
Figur 2: IAV kjerne demontering in vitro ved surgjøring (A) In vitro demontering av X31 kjerner ved forskjellige pH-betingelser i det nedre lag glycerol.. Som en kontroll, ble NP-40 er utelatt fra det nederste lag glycerol (første felt). Prøver ble separert ved hjelp av SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser, etterfulgt av Coomassie-farging. Viral proteinbåndene er angitt til høyre. (B) Densitometrisk kvantifisering av intensitetene av virale proteinbånd som er vist i (A). Protein bandet intensiteter for M1 og NP ble normalisert til dem ved pH 7,4 uten NP-40. Data er representert som middel for forsøk in duplo for ± standardavvik (SD). Tilpasset fra Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Viral capsids er metastabile makromolekylære komplekser. Selv om montering av virioner krever innkapsling og kondensasjon av virusgenomet, initiering av den neste runde av infeksjon avhenger demontering av denne kompakte kapsid struktur. Virus har utviklet seg til å utnytte ulike cellulære mekanismer for kontroll av belegget-avkapsling syklus, inkludert cellulære reseptorer, anstand, proteolytiske enzymer, fysiske krefter som tilbys av motor proteiner eller heli samt pH og ioniske brytere 26,27. Her beskriver vi en in vitro-metode basert på en glycerol-sentrifugering for spesifikt å teste effekten av faktorer som fremmer demontering av IAV kjernen. Teknikken kan potensielt innrettet for å dissekere avkapsling prosesser for andre innkapslede virus.

Ved å bruke kolloidal Coomassie, de store strukturelle proteiner IAV M1, NP, og HA kan tydelig påvises i SDS-PAGE, selv med en forholdsvis liten virus particle nummer. Men en mer inngående karakterisering av den sedimenterte kapsid struktur og dens sammensetning ville kreve oppfølgingsanalyser, slik som elektronmikroskopi (som tidligere presentert 28), Western blotting, dynamisk lysspredning eller massespektrometri. Ytterligere forlengelse av protokollen kan inkludere fraksjonering av den lavere (25%) glycerol fase og analyse av de spesifikke kjernekomponenter.

Justering av den nedre glycerol lag til en optimal sammensmelting pH på 5,0 (for X31) førte til en nesten fullstendig dissosiering av matrisesjiktet (figur 2) 16. Imidlertid kan omkring 30% av inngangssignalet NP fremdeles detekteres ved denne pH. Det er mulig at på grunn av fraværet av cellulære avkapsling faktorer i dette oppsettet, som nylig identifisert histondeacetylase 6 (HDAC6) 18, skjer ufullstendig demontering. Inne i cellen, til langsom surgjøring av den virale kjerne og eksponering for en overgang fra Na + K + 16. Vi kan ikke utelukke at det i vår oppsett, ikke-ionisk vaskemiddel delvis forstyrrer syre-eksponerte og destabilisert kjerne. Det er imidlertid ingen effekt på kjernesedimenterende ved nøytral pH-verdi observert angitt med tilsvarende proteinbånd intensiteter sammenlignet med ikke-oppløste prøver (figur 2A, sammenlign felt 1 og 2). Selv om analysen presentert her vist seg å være meget reproduserbar og (som sådan er) robust nok for bandet kvantifisering, kan en viss variasjonsholdes.

Anvendelsen av glycerol i denne protokollen er avgjørende for resultatet av eksperimentet. Som tidligere rapportert 17, ultrasentrifugering gjennom en sukrose gradient destabiliserer IAV kjernen, noe som sannsynligvis skyldes et høyt osmotisk kraft skapt av sukrose. Rensing av IAV via sukrosegradienter kan utøve lignende effekter. Derfor sammenlignet vi egg-vokst X31 utledet fra cl arified allantoinvæske og sukrose-renset aksjer. Ingen vesentlig forskjell kunne ikke observeres med hensyn til påvirkning av sure pH på kjerne stabilitet (data ikke vist). Ikke desto mindre, for å utelukke eventuelle bivirkninger av osmotisk aktivt sukrose, anbefaler vi å utføre in vitro-avkapsling analysen med klar allantoiske væske eller konsentrerte cellekultursupernatanter.

Foruten valg av gradienten materiale, er det viktig å opprettholde integriteten av gradienten for å ikke påvirke sedimente oppførselen til de lyserte virale kjernene og sikre reproduserbare resultater. I tillegg har ufullstendig resuspensjon av pelleten fraksjonen etter ultrasentrifugering fører sannsynligvis til forskjellige resultater. Endelig anbefales det sterkt å justere pH-verdien i vaskeholdige bufferoppløsninger helst på den samme dag av eksperimentet som små endringer i ionekonsentrasjon kan ha en drastisk effekt på viruskjernestabilitet.

innhold "> Det er viktig å merke seg at avhengig av den bestemte IAV belastning, kan forskjellige demontering effektivitet skje basert på egenskapene til de respektive M1 og NP varianter. Dette kan også gjelde for mutantvirus. Dermed pH terskler for matrise lag og vRNP dissosiasjon har til å bli bestemt for den respektive IAV siles før testing ytterligere påvirkning. for analyse av spesifikke forhold på viruskjernestabilitet vi foreslår å justere bunn glycerol lag til en pH-verdi, slik at halv-maksimal demontering av M1 er oppnådd. det er mulig for å undersøke innflytelsen av spesifikke ioner eller reduksjonsmidler ved å modifisere vaskemiddel inneholdende lag tilsvarende. Antatte cellulære avkapsling faktorer kan bli tilsatt direkte til glycerol gradienten. i tilfelle av cytoplasmiske faktorer, kan et tredje glyserol lag på bunnen av gradienten bli innført, som er justert til nøytral pH, inneholder den cellulære faktoren av interesse, og er fri for detergent. på denne måte the tre-lags gradient ville enda nærmere etterligne passasje av viruset gjennom den endocytiske system og frigjøring av gensegmenter til nøytral cytoplasma.

Til sammen presenterer vi en robust men likevel enkel in vitro-analyse for å studere IAV priming og avkapsling, som har potensiale for allsidige modifikasjoner for å ta opp ulike spørsmål i forbindelse med IAV oppføring. I tillegg kan den bli brukt for å undersøke inngangsprosesser for andre innkapslede virus med tilhørende avkapsling mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Yohei Yamauchi og Roberta Mancini for å gi oss med reagenser. AH laboratoriet ble støttet av Marie Curie Initial Training Networks (ITN), European Research Council (ERC), og av den sveitsiske National Science Foundation (Sinergia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 11873580001 The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid Merck Millipore 100063
Glycerol anhydrous BioChemica AppliChem A1123
Hydrochloric acid Merck Millipore 100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Methanol Merck Millipore 106009
NP-40 Sigma-Aldrich I8896 Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm Life Technologies NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Technologies NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) Life Technologies NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0 Merck Millipore 109542
QC Colloidal Coomassie Stain BIO RAD 1610803
Sodium chloride Merck Millipore 106406
Sodiumhydroxide Merck Millipore 106498
Steritop filter unit Merck Millipore SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set Beckman Coulter 331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Tris hydrochloride  AppliChem A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid Virapur Freshly thawed on 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Tags

Infeksjon Influensa A-virus virus oppføring avkapsling M1 vRNPs ultrasentrifugering
<em>In Vitro</em> Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stauffer, S., Nebioglu, F.,… More

Stauffer, S., Nebioglu, F., Helenius, A. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (109), e53909, doi:10.3791/53909 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter