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Immunology and Infection

ढाल centrifugation द्वारा इन्फ्लुएंजा एक वायरस capsids की इन विट्रो disassembly में

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53909
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Introduction

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (IAV) एक छा वायरस है और Orthomyxoviridae के परिवार का है। अपने जीन एक खंडों, नकारात्मक भावना और एकल असहाय आरएनए जीनोम पर इनकोड किया गया है। मनुष्यों में, IAV श्वसन संक्रमण, मौसमी महामारी फैलने में जो घटित कारण बनता है और वैश्विक महामारी 1 के लिए संभावित भालू। मेजबान कोशिका की सतह पर 2 सियालिक एसिड के अवशेष के लिए बाध्य करने पर, IAV क्लैथ्रिन पर निर्भर endocytosis और क्लैथ्रिन स्वतंत्र रास्ते 3-8 से भली भाँति है। अम्लीय वातावरण (पीएच <5.5) endocytic रिक्तिकाएं में IAV कील ग्लाइकोप्रोटीन hemagglutinin (हेक्टेयर), जो वायरल के विलय और देर endosomal झिल्ली 9 में यह परिणाम में एक प्रमुख गठनात्मक परिवर्तन हो सके। एक बार जब IAV कैप्सिड (यहाँ के रूप में भी वायरल "कोर" कहा जाता है) देर endosomes (लेस), यह cytosol नाभिक में वायरल ribonucleoproteins (vRNPs) के परिवहन के द्वारा पीछा में uncoated है से बच गया है - साइट ओएफ वायरस प्रतिकृति और प्रतिलेखन 10-13। हा के एसिड सक्रियण से पहले वायरस endocytic प्रणाली है, जो इसके बाद disassembly 14-16 के लिए कोर primes में पीएच में एक क्रमिक कमी अनुभव करता है। इस "भड़काना" में कदम वायरल झिल्ली में M2 आयन चैनल प्रोटॉन और कश्मीर +10,14,16 की आमद मध्यस्थता। वायरस इंटीरियर में आयनिक एकाग्रता में परिवर्तन परेशान बातचीत वायरल मैट्रिक्स प्रोटीन एम 1 और आठ vRNP बंडल से ऊपर का निर्माण, और झिल्ली संलयन 10,14-17 निम्नलिखित कोशिका द्रव्य में IAV uncoating की सुविधा।

भड़काना कदम के प्रत्यक्ष और मात्रात्मक विश्लेषण तथ्य यह है कि endosomes प्रयोगात्मक उपयोग करने के लिए मुश्किल हो जाता है के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। प्रवेश प्रक्रिया, इसके अलावा अत्यधिक गैर-तुल्यकालिक है। इसके अलावा, इस तरह के जारी किया वायरल शाही सेना या संक्रामकता माप की QRT- पीसीआर के रूप में अंत बिंदु assays, वायरल capsi के जैव रासायनिक स्थिति के बारे में एक विस्तृत चित्र प्रदान नहीं करतेप्रविष्टि के किसी भी कदम पर घ। जबकि siRNA या नशीली दवाओं के उपचार से endosomes की गड़बड़ी काफी IAV प्रविष्टि 18-20 की समझ के लिए योगदान दिया है, ठीक ट्यूनिंग मुश्किल और कसकर नियंत्रित इंडोसोम परिपक्वता कार्यक्रम में unspecific साइड इफेक्ट का खतरा है।

इन समस्याओं से बचने के लिए, हम एक पहले से विकसित इन विट्रो वेग ढाल centrifugation 17 के उपयोग पर आधारित प्रोटोकॉल ढाल लिया है। अन्य प्रयास 21,22, 23,24, जिनमें से ज्यादातर प्रोटिओलिटिक दरार और डिटर्जेंट उपचार ईएम विश्लेषण के बाद के संयोजन पर आधारित थे के विपरीत, इस दृष्टिकोण एक आसानी से मात्रात्मक परिणाम सक्षम होना चाहिए। विभिन्न परतों के माध्यम से ढाल centrifugation sedimenting कणों के संपर्क में है और एक नियंत्रित तरीके से स्थितियों को बदलने के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति देता। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, IAV स्पष्ट किया द्रव्य या शुद्ध वायरल कणों से निकाली गई एक दो परत ग्लिसरॉल में sedimented रहे हैंढाल, जिसमें नीचे की परत गैर ईओण डिटर्जेंट एनपी 40 (चित्रा 1) शामिल हैं। वायरस दूसरा, डिटर्जेंट युक्त परत में प्रवेश करती है, वायरल लिपिड लिफाफा और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन धीरे solubilized और पीछे छोड़ दिया जाता है। कोर, आठ vRNP बंडल से बना है और एक मैट्रिक्स परत से घिरा हुआ है, गोली अंश में एक स्थिर संरचना के रूप में तलछट। ऐसे एम 1 और vRNP जुड़े nucleoprotein (एनपी) के रूप में वायरल कोर प्रोटीन, एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला द्वारा गोली में पहचाना जा सकता है। विशेष रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ढाल जैल का लाभ ले रही है और अत्यधिक संवेदनशील कोलाइडयन Coomassie 25 के साथ धुंधला हो जाना, उच्च परिशुद्धता और वायरल कोर जुड़े प्रोटीन की भी थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है।

इस तरह के पीएच, नमक एकाग्रता, और ख्यात uncoating कारकों मुख्य घटक और कोर stabil के अवसादन व्यवहार पर प्रभाव पड़ता है के रूप में अलग अलग परिस्थितियों है कि क्या परीक्षण के लिए आधार सेट अल्पसंख्यक। इस उद्देश्य के लिए, ग्लिसरॉल ढाल में केवल कम, डिटर्जेंट युक्त परत कारक या ब्याज की हालत को शुरू करने से संशोधित किया गया है। तकनीक IAV कोर 16 की अखंडता पर अलग पीएच मान और नमक सांद्रता के प्रभाव की जांच में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है। IAV uncoating के मध्यवर्ती कदम हल्का अम्लीय पीएच (<6.5) पीएच 5.5 और कम 16,17 (चित्रा 1) में vRNP हदबंदी के द्वारा पीछा किया पर मैट्रिक्स परत की हदबंदी सहित नजर रखी जा सकती है। उत्तरार्द्ध कदम आगे ग्लिसरॉल परत में उच्च + K एकाग्रता की उपस्थिति द्वारा बढ़ाया गया था, एक देर endocytic माहौल 16 को दर्शाती है। इस प्रकार, के रूप में वायरस और कोर ढाल के माध्यम से sedimented वे एक बदलते परिवेश कि endosomes में mimics की स्थिति का अनुभव किया। परिणाम इन विट्रो में वायरल कोर के एक stepwise disassembly था, कोशिका जीव विज्ञान assays से निकाली गई परिणामों के पूरक।

टी "> यहां प्रस्तुत विधि तेजी से सक्षम है और IAV की अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण (x31 और ए / डब्लूएसएन / 33) और IBV (बी / ली / 40) अम्लीय पीएच से शुरू हो रहा है और कश्मीर +16,17 बढ़ती disassembly के रूप में रूप में अच्छी तरह uncoating क्षारीय पीएच जोखिम 17 पर पैरामिक्सोवायरस कोर की। यह कल्पना है कि दृष्टिकोण अन्य छा वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता सेल प्रवेश के दौरान वायरल capsid संरचना और capsid disassembly के जैव रासायनिक गुणों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए।

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Protocol

1. बफ़र और शेयर समाधान की तैयारी

  1. MNT बफर (20 ​​मिमी एमईएस, 30 मिमी Tris और 100 मिमी NaCl) 80 मिलीलीटर DDH 2 ओ में 470 मिलीग्राम Tris हाइड्रोक्लोराइड, 390 मिलीग्राम एमईएस हाइड्रेट और 580 मिलीग्राम सोडियम क्लोराइड भंग द्वारा तैयार करें 7.4 पीएच को समायोजित करें और बफर DDH 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के लिए इसे लाने
  2. 80 मिलीलीटर DH 2 हे प्रत्येक में 9.76 जी एमईएस हाइड्रेट भंग द्वारा 500 मिमी एमईएस बफर के तीन समान समाधान तैयार करें। केंद्रित NaOH के साथ titrating द्वारा पीएच 5.8, 5.4, और 5.0, क्रमशः, के लिए बफ़र्स समायोजित करें। DH 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए प्रत्येक बफर लाओ
  3. DH 2 हे 80 मिलीलीटर में 7.88 छ Tris हाइड्रोक्लोराइड भंग प्रत्येक से 500 मिमी Tris बफर के दो समान समाधान तैयार है और, 7.4 और 6.4 क्रमश: पीएच को समायोजित केंद्रित एचसीआई साथ titrating द्वारा। DH 2 ओ के साथ 100 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के बफर लाओ
  4. DH 2 हे में 50% ग्लिसरॉल समाधान तैयार है और glyc जब तक अच्छी तरह से हलचलErol homogenously मिश्रित है। एक कांच की बोतल में एक Steritop फिल्टर यूनिट (0.22 माइक्रोन रोमकूप आकार) के माध्यम से समाधान फ़िल्टर।
  5. 10% एनपी 40 समाधान और DH 2 ओ में 1 एम NaCl तैयार
  6. 4 मिलीलीटर DDH 2 ओ में दो गोलियाँ भंग द्वारा 25x केंद्रित protease अवरोध तैयार

2. ग्लिसरॉल ढ़ाल की तैयारी

  1. 5 मिलीलीटर डिटर्जेंट बफर मास्टर मिश्रण तैयार परीक्षण करने के लिए प्रत्येक पीएच हालत के लिए समाधान (300 मिमी NaCl, 2% एनपी 40, 2x protease अवरोध केंद्रित) (पीएच 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, और 5.0)। इस प्रयोजन के लिए, 25x protease अवरोध शेयर 2.4 मिलीलीटर 9 मिलीलीटर DDH 2 0 1 एम NaCl के 9 मिलीलीटर, 10% एनपी 40 के 6 मिलीलीटर, और मिश्रण।
  2. प्रत्येक पीएच हालत pipet के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मास्टर मिश्रण के 4.4 मिलीलीटर।
  3. पीएच मान 5.8 के लिए ऊपर ट्यूब करने के लिए संबंधित पीएच समायोजित 500 मिमी Tris स्टॉक समाधान के 0.6 मिलीलीटर जोड़ें। पीएच 5.8 और निचले लिए संबंधित पीएच समायोजित 500 मिमी एमईएस स्टॉक समाधान के 0.6 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. बनाओ 5बफर 300 मिमी NaCl युक्त समाधान के मिलीलीटर, 2x protease अवरोध, 60 मिमी Tris पीएच 7.4 और DDH 2 ओ के लिए निकाला इस डिटर्जेंट मुक्त नियंत्रण ढाल बफर के रूप में काम करेगा।
  5. यदि आवश्यक हो, केंद्रित एचसीआई या NaOH समाधान, क्रमशः जोड़कर 7.4 पीएच, 6.4, 5.8, 5.4, और 5.0 के समाधान के पीएच ठीक से समायोजित।
  6. डिटर्जेंट युक्त और डिटर्जेंट मुक्त बफर छह अलग-अलग 25% ग्लिसरॉल समाधान में जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण के 5 मिलीलीटर से 50% ग्लिसरॉल स्टॉक के 5 मिलीलीटर जोड़ें। पीएच सूचक स्ट्रिप्स का उपयोग करके पीएच मान की जाँच करें।
    नोट: इस मामले में मापा पीएच वांछित मूल्य से काफी अलग है, संबंधित समाधान फिर से तैयार किया जाना चाहिए।
  7. 7 अनुपात: एक 3 में DH 2 हे के साथ 50% ग्लिसरॉल स्टॉक के मिश्रण से 15% ग्लिसरॉल समाधान तैयार है।

3. IAV की ultracentrifugation

  1. 3 एमएल 15% ग्लिसरॉल समाधान (13.2 मिलीलीटर, 14 मिमी x 89 मिमी) एक 5 मिलीलीटर सिरिंज और एक Nee का उपयोग करके अल्ट्रा स्पष्ट centrifugation ट्यूबों में जोड़ेdle (21 जी, 9 सेमी लंबे)। ट्यूब के भीतरी दीवार पर बूँदें छोड़ के रूप में इस ढाल की अखंडता परेशान हो सकता है। छह centrifugation ट्यूब, पांच पीएच शर्तों में से प्रत्येक का परीक्षण करने के लिए एक और नमूना नियंत्रण के लिए एक के एक कुल के लिए इस दोहराएँ।
  2. ध्यान से एक 5 मिलीलीटर सिरिंज और एक लंबी सुई का उपयोग करके 15% ग्लिसरॉल परत के नीचे 3.4 मिलीलीटर 25% ग्लिसरॉल समाधान जगह है। दो परतों मिश्रण नहीं करने के लिए ध्यान रखना। सभी छह की स्थिति में संबंधित पीएच समायोजित ग्लिसरॉल समाधान के साथ परीक्षण करने के लिए इस दोहराएँ।
    नोट: निम्न चरणों के लिए वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में काम करते हैं।
  3. धीरे अपरापोषिक IAV (x31, H3N2) 1 मिलीलीटर MNT बफर में पतला युक्त तरल पदार्थ स्पष्ट किया 30 μl के साथ ग्लिसरॉल ढ़ाल उपरिशायी प्रत्येक ढाल के लिए (लगभग 20-30 ग्राम के कुल वायरल प्रोटीन के लिए मेल खाती है)।
  4. शेष नलियों का विरोध करने और उन्हें एक SW41 ultracentrifugation रोटर में जगह है। 150 मिनट, 55,000 XG पर, और 12 डिग्री सेल्सियस के लिए अपकेंद्रित्र।
  5. centrifugation के बाद, ध्यानएक साफ पाश्चर विंदुक और एक Aspirator का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला, यानी, दोनों ग्लिसरॉल परतों को हटा दें। 40 μl (1x) गैर को कम करने एलडीएस नमूना बफर में गोली Resuspend। यह गोली पूरी तरह से भंग करने के लिए कई बार नीचे pipet और करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में नमूना हस्तांतरण।

गोली भागों और Coomassie धुंधला 4. एसडीएस पृष्ठ

  1. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सभी नमूनों हीट। इस बिंदु पर नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, जब तक वे एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण कर रहे हैं।
  2. लोड एक पूर्व डाली ढाल (4-12%) पर भंग छर्रों के 20 μl बीआईएस Tris मिनी जेल और 200 वी 1x MOPS एसडीएस में कम 1 घंटे के लिए चलाने के बफर चल रहा है।
  3. 40% मेथनॉल और DDH 2 ओ में 10% हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ नियतन समाधान करें
  4. 1 घंटे के लिए निर्धारण समाधान में जेल सेते हैं और जबकि धीरे कोलाइडयन Coomassie समाधान की पर्याप्त मात्रा के साथ एक 15 सेमी सेल संस्कृति डिश में रात भर दागकमरे के तापमान पर मिलाते हुए।
    नोट: यह आदेश धुंधला समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए पकवान बंद करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. DDH 2 ओ में जेल Destain DDH 2 हे हर 15-20 मिनट की जगह ले जब तक जेल पृष्ठभूमि स्पष्ट हो जाता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर DDH 2 हे में जेल स्टोर जब तक यह बैंड मात्रा का ठहराव के लिए स्कैन किया जाता है।
  6. उच्च संकल्प पर जेल स्कैन और प्रोटीन बैंड तीव्रता की मात्रा का ठहराव के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या कस्टम बनाया सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। एक क्षेत्र संबंधित बैंड के करीब से पृष्ठभूमि संकेत घटाना और (7.4 पीएच) में डिटर्जेंट मुक्त नियंत्रण नमूने के लिए इन मूल्यों को मानक के अनुसार।

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Representative Results

पहले से ही चर्चा की, endosomes में भड़काना IAV कोर सक्षम uncoating प्रस्तुत करने के लिए आवश्यक है। कोर के protonation एम 1 और vRNPs की बातचीत को कमजोर (वायरल शाही सेना, एनपी से बना है, और पोलीमर्स जटिल PB1 / PB2 / पीए)। जब भेजे गए वायरस 6.5 (या कम) जल्दी endosomes (EEs) में का पीएच से अवगत कराया और लेस में चारों ओर 5.0 पीएच पर वायरस फ़्यूज़ तक जारी है यह प्रक्रिया शुरू की है।

आदेश में पीएच की कमी की नकल करने के लिए, ग्लिसरॉल ढ़ाल के नीचे की परत एक निरंतर नमक एकाग्रता में पीएच 7.4 और 5.0 के बीच मूल्यों को समायोजित किया गया। X31 स्पष्ट किया द्रव्य से निकाली गई एसडीएस पृष्ठ से वेग ढाल centrifugation के अधीन है और विश्लेषण किया गया था (चित्रा 2A, बी)। ढाल (चित्रा 2A, lane1) में मौजूद डिटर्जेंट के बिना बरकरार virions pelleted हैं, के रूप में की विशेषता पैटर्न से परिलक्षितहा (HA1 और HA2; 63 केडीए) का प्रतिनिधित्व बैंड Coomassie में, एनपी (56 केडीए), और एम 1 (27 केडीए) जेल दाग। चूंकि जेल गैर को कम करने की शर्तों के तहत चलाया गया था, proteolytically cleaved HA1 और HA2 अभी भी डाइसल्फ़ाइड बांड से जुड़ा हुआ है और लगभग 64 केडीए चलाए जा रहे हैं। को कम करने शर्तों के तहत बैंड HA1 और HA2 करने के लिए इसी क्रमश: बहुत एनपी और एम 1 बैंड के करीब दिखाई देते हैं, यह मुश्किल ईमानदारी से व्याख्या और बैंड तीव्रता है कि केवल वायरल कोर (चित्रा 2 बी) से प्राप्त कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए कर रही है।

नीचे करने के लिए एनपी 40 के अलावा पर ​​(25%) ग्लिसरॉल हा, एनए सहित वायरल लिफाफा परत, और M2 solubilized थे और वायरल कोर अकेले ultracentrifugation (चित्रा 1, चित्रा 2, 2 लेन) के दौरान गोली में sedimented। नीचे 6.5 पीएच के साथ शुरू, एम 1 धीरे-धीरे गोली अंश से खो दिया है, पीएच 5.8 और 5.4 (चित्रा के बीच एक न्यूनतम तक पहुँचने2A, बी)। पीएच 5.8 से नीचे vRNPs अलग है और इस तरह गोली से खो गए थे। इससे पहले, यह दिखाया गया है कि, वास्तव में, पूरे vRNPs ऊपरी परत में, के रूप में उनकी रिहाई गोली अंश 16 से PB2 के नुकसान के साथ सहसंबद्ध जारी कर रहे हैं। प्रोटीन बैंड तीव्रता निर्धारित किया गया है, एम 1 परत और vRNP बंडलों में क्रमश: (चित्रा 2) की हदबंदी के disassembly के लिए दो अलग-अलग पीएच थ्रेसहोल्ड खुलासा। अपर बैंड जेल है, जो पोलीमर्स प्रोटीन PB1 (87 केडीए), PB2 (86 केडीए), फिलीस्तीनी अथॉरिटी (83 केडीए), और M2 (11 केडीए) के अनुरूप हो सकता है पर मनाया जा सकता है। IAV virions के अंदर उनके कम प्रतिलिपि संख्या के कारण हम मज़बूती से अपनी पहचान निर्धारित नहीं कर सका और वे फलस्वरूप मात्रा का ठहराव के लिए विचार में नहीं लिया गया।

आकृति 1
चित्रा 1: IAV की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व इन विट्रो कोर disassembly परख। संक्षेप में, शुद्ध वायरल कणों एक दो कदम ग्लिसरॉल ढाल पर लोड कर रहे हैं। नीचे की परत डिटर्जेंट एनपी 40 में शामिल है और जबकि ऊपरी, डिटर्जेंट मुक्त परत एक निरंतर पीएच और नमक एकाग्रता में रखा जाता है वांछित पीएच और नमक एकाग्रता के लिए निकाला जाता है। कम ग्लिसरॉल परत में स्थिति पर निर्भर करता है, पूरा वायरल कोर (1) नीचे करने के लिए तलछट या अलग कर रहे हैं और ग्लिसरॉल परत (2) में रहते हैं। तटस्थ पीएच बरकरार वायरल एम 1 और vRNPs से बना कोर की अवसादन की ओर जाता है। ऐसे अम्लीय पीएच (5.0) के रूप में uncoating के लिए अनुकूल परिस्थितियों, वायरल मुख्य घटक की हदबंदी और इसलिए गोली अंश से नुकसान में परिणाम है। Ultracentrifugation के बाद, ग्लिसरॉल supernatants हटा रहे हैं और छर्रों एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। p>

चित्र 2
चित्रा 2: अम्लीकरण पर इन विट्रो में IAV कोर disassembly (ए) कम ग्लिसरॉल परत में अलग पीएच की स्थिति में x31 कोर की इन विट्रो disassembly।। एक नियंत्रण के रूप में, एनपी 40 नीचे ग्लिसरॉल परत (पहली लेन) से छोड़ा गया था। नमूने Coomassie धुंधला द्वारा पीछा गैर को कम करने की शर्तों के तहत एसडीएस पृष्ठ से अलग हो गए थे। वायरल प्रोटीन बैंड सही पर संकेत कर रहे हैं। (बी) (ए) में दिखाया गया वायरल प्रोटीन बैंड की तीव्रता के densitometric मात्रा का ठहराव। एम 1 और एनपी के लिए प्रोटीन बैंड तीव्रता एनपी 40 बिना पीएच 7.4 पर उन लोगों के लिए सामान्यीकृत थे। डेटा मानक विचलन (एसडी) ± डुप्लिकेट प्रयोगों के साधन के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। स्टौफ़्फ़ेर एट अल।, 2014 16 से अनुकूलित।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वायरल capsids metastable macromolecular परिसरों हैं। virions की विधानसभा encapsidation और वायरस जीनोम का संक्षेपण की आवश्यकता है, संक्रमण के अगले दौर की दीक्षा इस कॉम्पैक्ट कैप्सिड संरचना के disassembly पर निर्भर करता है। वायरस सेलुलर रिसेप्टर्स, संरक्षक, एंजाइमों, मोटर प्रोटीन या helicases के साथ ही पीएच और ईओण स्विच 26,27 द्वारा प्रदान की भौतिक बलों सहित कोटिंग-uncoating चक्र को नियंत्रित करने के विभिन्न सेलुलर तंत्र का दोहन करने के लिए विकसित किया है। यहाँ, हम इन विट्रो एक ग्लिसरॉल ढाल centrifugation के आधार पर विशेष रूप से IAV कोर के disassembly को बढ़ावा देने वाले कारकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन। तकनीक संभवतः अन्य छा वायरस के uncoating प्रक्रियाओं विदारक के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

कोलाइडयन Coomassie, प्रमुख संरचनात्मक प्रोटीन IAV एम 1, एनपी, और हा स्पष्ट रूप से एसडीएस पृष्ठ में भी एक अपेक्षाकृत छोटे वायरस खास के साथ पता लगाया जा सकता का उपयोग करकेLe संख्या। फिर भी, एक और अधिक में गहराई से sedimented कैप्सिड संरचना के लक्षण वर्णन और इसकी संरचना अनुवर्ती की आवश्यकता होगी विश्लेषण करती है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में इस तरह के (पहले प्रस्तुत के रूप में 28), पश्चिमी सोख्ता, गतिशील प्रकाश बिखरने या मास स्पेक्ट्रोमेट्री। प्रोटोकॉल के आगे विस्तार कम (25%) ग्लिसरॉल चरण और विशिष्ट मुख्य घटक के विश्लेषण के विभाजन शामिल हो सकते हैं।

5.0 (x31 के लिए) का इष्टतम संलयन पीएच को कम ग्लिसरॉल परत का समायोजन मैट्रिक्स परत के एक लगभग पूर्ण हदबंदी (चित्रा 2) 16 के लिए नेतृत्व किया। हालांकि, इनपुट एनपी संकेत के 30% के आसपास अभी भी इस पीएच में पता लगाया जा सकता है। ऐसा नहीं है कि इस तरह के हाल ही में पहचान हिस्टोन deacetylase 6 (HDAC6) 18 के रूप में इस सेटअप में सेलुलर uncoating कारकों के अभाव की वजह से अधूरा disassembly होता है संभव है। सेल के अंदर, कश्मीर को ना + से वायरल कोर और एक स्विच करने के लिए जोखिम की धीमी अम्लीकरण + 16 primes। हम बाहर नहीं कर सकते कि हमारे सेटअप में, गैर ईओण डिटर्जेंट आंशिक रूप से एसिड अवगत कराया और अस्थिर कोर बाधित। हालांकि, कोर तटस्थ पीएच पर sedimenting पर कोई प्रभाव नहीं गैर solubilized नमूनों की तुलना में समान प्रोटीन बैंड तीव्रता ने संकेत दिया मनाया जाता है (चित्रा 2A तुलना गलियों 1 और 2)। हालांकि, यहाँ प्रस्तुत साबित कर दिया परख अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत करने के लिए पर्याप्त बैंड मात्रा का ठहराव के लिए हो सकता है (जैसे) है, बदलाव की एक निश्चित सीमा के लिए मनाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में ग्लिसरॉल का उपयोग प्रयोग के परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि पहले 17 सूचना दी, एक सूक्रोज ढाल के माध्यम से ultracentrifugation सुक्रोज के द्वारा बनाई गई एक उच्च आसमाटिक बल के कारण IAV कोर, जो की संभावना है destabilizes। सुक्रोज ढ़ाल के माध्यम से IAV की शुद्धि समान प्रभाव डालती हो सकता है। इसलिए हम अंडे देसी x31 सीएल से निकाली गई तुलना arified द्रव्य और सुक्रोज शुद्ध शेयरों। कोई बड़ा फर्क कोर स्थिरता पर अम्लीय पीएच के प्रभाव के संबंध में मनाया जा सकता है (डेटा) नहीं दिखाया। फिर भी, आदेश osmotically सक्रिय सुक्रोज के संभावित दुष्प्रभावों को बाहर करने में, हम तरल पदार्थ या केंद्रित सेल संस्कृति supernatants अपरापोषिक स्पष्ट किया साथ इन विट्रो uncoating परख प्रदर्शन सलाह देते हैं।

ढाल सामग्री की पसंद के अलावा, यह ढाल lysed वायरल कोर की अवसादन व्यवहार को प्रभावित करने और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए नहीं की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, ultracentrifugation के बाद गोली अंश की अधूरी मेजबान संभावना विभिन्न परिणामों की ओर जाता है। अंत में, हम दृढ़ता से प्रयोग के एक ही दिन में आदर्श डिटर्जेंट युक्त बफर समाधान के पीएच को एडजस्ट करने की सिफारिश के रूप आयनिक एकाग्रता में छोटे परिवर्तन वायरल कोर स्थिरता पर भारी असर पड़ सकता है।

सामग्री "> यह है कि विशेष रूप IAV तनाव के आधार पर, विभिन्न disassembly क्षमता संबंधित एम 1 के गुणों पर आधारित हो सकता है ध्यान दें करने के लिए महत्वपूर्ण है और एनपी वेरिएंट। यह भी उत्परिवर्ती वायरस के लिए आवेदन कर सकता है। इस प्रकार, मैट्रिक्स परत और vRNP के लिए पीएच थ्रेसहोल्ड हदबंदी अतिरिक्त प्रभावों के परीक्षण से पहले संबंधित IAV तनाव के लिए निर्धारित किया है करने के लिए किया जाना है। वायरल कोर स्थिरता हम एक पीएच मान इतना है कि एम 1 के आधा अधिक से अधिक disassembly हासिल की है करने के लिए नीचे ग्लिसरॉल परत समायोजित करने की सलाह पर विशिष्ट परिस्थितियों के विश्लेषण के लिए। यह संभव है तदनुसार डिटर्जेंट युक्त परत को संशोधित करके विशिष्ट आयनों या एजेंटों को कम करने के प्रभाव की जांच करने के लिए। ख्यात सेलुलर uncoating कारकों ग्लिसरॉल ढाल को सीधे जोड़ा जा सकता है। cytoplasmic कारकों के मामले में, ढाल के तल पर एक तिहाई ग्लिसरॉल परत हो सकता है शुरू की है, जो तटस्थ पीएच को समायोजित किया जाता है, ब्याज की सेलुलर कारक होता है, और डिटर्जेंट के लिए स्वतंत्र है। इस तरह, वेंई तीन परत ढाल भी अधिक बारीकी से तटस्थ कोशिका द्रव्य में endocytic प्रणाली और जीन क्षेत्रों की विज्ञप्ति के माध्यम से वायरस के पारित होने की नकल करेंगे।

साथ में ले ली, हम IAV भड़काना और uncoating, जो आदेश IAV प्रविष्टि के संदर्भ में विविध प्रश्नों का समाधान करने के लिए बहुमुखी संशोधनों के लिए क्षमता है अध्ययन करने के लिए एक मजबूत अभी तक साधारण इन विट्रो परख प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, यह संबंधित uncoating तंत्र के साथ अन्य छा वायरस के प्रवेश प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Acknowledgments

हम अभिकर्मकों के साथ हमें प्रदान करने के लिए Yohei यामाउचि और रोबर्टा मैनसिनी धन्यवाद। एएच प्रयोगशाला मैरी क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क (ITN) द्वारा समर्थित किया गया, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी), और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा (Sinergia)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 11873580001 The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid Merck Millipore 100063
Glycerol anhydrous BioChemica AppliChem A1123
Hydrochloric acid Merck Millipore 100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Methanol Merck Millipore 106009
NP-40 Sigma-Aldrich I8896 Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm Life Technologies NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Technologies NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) Life Technologies NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0 Merck Millipore 109542
QC Colloidal Coomassie Stain BIO RAD 1610803
Sodium chloride Merck Millipore 106406
Sodiumhydroxide Merck Millipore 106498
Steritop filter unit Merck Millipore SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set Beckman Coulter 331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Tris hydrochloride  AppliChem A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid Virapur Freshly thawed on 4 °C

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References

  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

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संक्रमण अंक 109 इन्फ्लुएंजा ए वायरस वायरस प्रवेश uncoating एम 1 vRNPs ultracentrifugation
ढाल centrifugation द्वारा इन्फ्लुएंजा एक वायरस capsids की <em>इन विट्रो</em> disassembly <em>में</em>
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Stauffer, S., Nebioglu, F.,… More

Stauffer, S., Nebioglu, F., Helenius, A. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (109), e53909, doi:10.3791/53909 (2016).

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