Introduction
Vírus da Influenza A (IAV) é um vírus envolvido que pertence à família de Orthomyxoviridae. Seus genes são codificados em uma, de sentido negativo e segmentada genoma de ARN de cadeia simples. Nos seres humanos, IAV causa infecções respiratórias, que ocorrem em surtos epidêmicos sazonais e tem o potencial para pandemias globais 1. Após a ligação de resíduos de ácido siálico na superfície das células de acolhimento 2, IAV é internalizado por endocitose dependente de clatrina e vias independentes de clatrina 3-8. O meio ácido (pH <5,5) nos vacúolos de endocitose desencadeia uma mudança conformacional na IAV pico glicoproteína hemaglutinina (HA), o que resulta na fusão do vírus e no final da membrana endossomal 9. Uma vez que a cápside IAV (aqui também referido como "núcleo" viral) escapou de endossomas tardios (EIE), que é não revestidos no citosol seguido por transporte das ribonucleoproteínas virais (vRNPs) no núcleo - o local de Oa replicação do vírus e transcrição F 10-13. Antes da activação de ácido HA do vírus sofre uma redução gradual do pH no sistema endocítico, que prepara o núcleo para a sua desmontagem posterior 14-16. Neste "priming" intensificar os canais de íon M2 na membrana viral mediar o influxo de prótons e K +10,14,16. A mudança na concentração iônica no interior vírus perturba as interações construir pela proteína da matriz viral M1 ea vRNP pacote de oito, e facilita IAV uncoating no citoplasma seguindo a fusão da membrana 10,14-17.
análise directa e quantitativa do passo de iniciação tem sido dificultada pelo facto de endossomas são difíceis de aceder experimentalmente. O processo de entrada é, aliás, altamente não-síncrona. Além disso, ensaios de ponto final, como qRT-PCR de RNA ou da infecciosidade medições virais libertados, não fornecem uma imagem detalhada sobre o estado bioquímico do capsi virald em qualquer etapa de entrada. Enquanto perturbação da endossomas por siRNA ou tratamento de drogas tem contribuído significativamente para a compreensão de entrada IAV 18-20, ajuste fino é difícil e propenso a efeitos colaterais não específicos no programa endosome maturação rigidamente controlado.
Para evitar estes problemas, nós adaptamos um protocolo previamente desenvolvido in vitro, com base na utilização de centrifugação em gradiente de velocidade de 17. Em contraste com outras tentativas 21,22, 23,24, que eram na maior parte baseados em combinações de clivagem proteolítica e tratamento com detergente, seguido por análise de EM, esta abordagem permitiu um resultado facilmente quantificáveis. Centrifugação através de diferentes camadas de gradiente permite que as partículas sedimentam a ser expostos e reagem com mudança de condições, de forma controlada. No protocolo apresentado, IAV derivados a partir de fluido alantóico clarificado ou partículas virais purificadas são sedimentadas numa glicerol de duas camadasgradiente em que a camada inferior contém o detergente não-iónico NP-40 (Figura 1). Tal como o vírus entra na segunda camada, contendo detergente, o envelope lipídico e glicoproteínas do envelope viral são suavemente solubilizada e deixado para trás. O núcleo, composto pelo feixe vRNP e oito rodeado por uma camada de matriz, sedimentos como uma estrutura estável na fracção de sedimento. proteínas de núcleo virai, tais como M1 e nucleoproteína vRNP-associado (NP), pode ser identificado no sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Em particular, tomando vantagem de géis de gradiente disponíveis comercialmente e a coloração com Coomassie coloidal altamente sensível 25, permite alta precisão e a detecção de mesmo pequenas quantidades de proteínas associadas ao núcleo virai.
Isso define a base para testar se condições diferentes, como pH, concentração de sal, e os fatores não revestidos putativos têm efeitos sobre o comportamento de sedimentação dos componentes do núcleo e stabil núcleo dade. Para este objectivo, apenas a camada inferior, contendo o detergente em o gradiente de glicerol é modificado através da introdução do factor ou condição de interesse. A técnica tem sido particularmente útil em investigar o efeito de diferentes valores de pH e concentrações de sal sobre a integridade do núcleo 16 IAV. Etapas intermediárias de IAV desencapsulamento poderia ser monitorada incluindo dissociação da camada de matriz a um pH ligeiramente ácido (<6,5), seguido de vRNP de dissociação a pH 5,5 e inferior 16,17 (Figura 1). O último passo foi adicionalmente reforçada pela presença de alta concentração de K + na camada de glicerol, reflectindo um ambiente endocítica final 16. Assim, como o vírus e o núcleo sedimentado através do gradiente que experimentaram uma mudança de meio, imitando as condições em endossomas. O resultado foi uma desmontagem gradual do núcleo virai in vitro, completando os resultados derivados a partir de ensaios de biologia celular.
t "> O método aqui apresentado, permitiu rápido e altamente reprodutível análise de IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) desencapsulamento desencadeada pelo pH ácido e aumentando +16,17 K, bem como desmontagem de núcleos paramixovírus após exposição pH alcalino 17. é concebível que a abordagem pode ser adaptada para outros vírus com envelope para obter insights sobre as propriedades bioquímicas da estrutura da cápside virai e desmontagem da cápside durante a entrada na célula.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de tampões e soluções de Stock
- Preparar tampão de MNT (MES 20 mM, Tris 30 mM e NaCl 100 mM) por dissolução de 470 mg de Tris, cloridrato de 390 mg de hidrato de MES e 580 mg de NaCl em 80 ml de ddH 2 O. Ajustar o tampão a pH 7,4 e trazê-lo para um volume final de 100 ml com ddH 2 O.
- Preparar três soluções idênticas de tampão 500 mM MES dissolvendo 9,76 g MES hidratado em 80 ml de dH2O cada um. Ajustar as memórias intermédias para um pH de 5,8, 5,4, e 5,0, respectivamente, por titulação com NaOH concentrado. Traga cada tampão para um volume final de 100 mL com dH2O
- Preparar duas soluções idênticas de tampão Tris 500 mM por dissolução de 7,88 g de Tris cloridrato em 80 ml de dH2O cada e ajustar o pH para 7,4 e 6,4, respectivamente, por titulação com HCl concentrado. Traga o tampão para um volume final de 100 mL com dH2O
- Preparar a solução de glicerol a 50% em dH 2 O e agita-se bem até a GlycErol é homogeneamente misturada. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro Steritop (0,22 de tamanho de poro) para um frasco de vidro.
- Preparar solução a 10% de NP-40 e NaCl 1 M em dH2O
- Prepare 25x inibidor de protease concentrada por dissolução de dois comprimidos em 4 ml DDH 2 O.
2. Preparação de gradientes de glicerol
- Prepare 5 ml de tampão detergente de mistura principal solução para cada condição de pH (300 mM de NaCl, 2% de NP-40, inibidores da protease 2x concentrado) de teste (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, e 5.0). Para este efeito, mistura 9 ml de NaCl 1 M, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml de solução stock de inibidor de protease, 25x e 9 ml de ddH 2 0.
- Para cada condição pipeta pH 4,4 ml da mistura principal em um tubo de 50 ml.
- Para valores de pH acima de 5,8 adicionar 0,6 ml da respectiva solução de estoque de 500 mM de Tris com pH ajustado ao tubo. Para pH 5,8 e inferior adicionar 0,6 ml da respectiva solução de MES 500 mM com o pH ajustado.
- Faça 5ml de solução tampão contendo NaCl 300 mM, inibidor de protease de 2x, Tris 60 mM ajustado para pH 7,4 e ddH 2 O. Isto irá servir como tampão de gradiente de controlo sem detergente.
- Se necessário, ajustar com precisão o pH das soluções para pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, e 5,0 por adição de soluções de HCI ou NaOH concentrado, respectivamente.
- Adicionar 5 ml de solução stock de glicerol a 50% e 5 ml de as misturas tampão contendo detergente e sem detergente, resultando em seis diferentes soluções de glicerol a 25%. Verifique os valores de pH utilizando papel indicador de pH.
NOTA: No caso de o pH medido difere significativamente do valor desejado, as respectivas soluções devem ser preparadas novamente. - Preparar solução de glicerol a 15% por mistura de estoque de glicerol a 50% com dH 2 O em uma proporção de 3: 7.
3. Ultracentrifugação da IAV
- Adicionar solução de glicerol a 3 ml de 15% em tubos de centrifugação ultra-claros (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) usando uma seringa de 5 ml e uma needle (21 G, 9 cm de comprimento). Não deixar gotas para a parede interior do tubo como este poderia perturbar a integridade do gradiente. Repetir este para um total de seis tubos de centrifugação, uma para cada um dos cinco condições de pH para testar e uma para a amostra de controlo.
- Com cuidado, coloque solução de glicerol a 3,4 ml de 25% sob a camada de glicerol 15%, utilizando uma seringa de 5 ml e uma agulha longa. Tome cuidado para não misturar as duas camadas. Repita este procedimento para todas as seis condições para testar com as respectivas soluções de glicerol com o pH ajustado.
NOTA: Trabalho na classe II biossegurança gabinete para as etapas seguintes. - Suavemente sobrepor os gradientes de glicerol com 30 ul clarificadas fluido alantóide que contém IAV (X31, H3N2) diluído em 1 ml de tampão de MNT (corresponde a cerca de 20-30 ug da proteína virai total) para cada gradiente.
- Equilíbrio oposição tubos e colocá-los em um rotor SW41 ultracentrifugação. Centrifugar durante 150 minutos, a 55000 x g, e 12 ° C.
- Após a centrifugação, cuidadosamenteremover o sobrenadante, isto é, ambas as camadas de glicerol, usando uma pipeta de Pasteur limpa e um aspirador. Ressuspender o sedimento em 40 ul (1x) não redutoras tampão de amostra LDS. É importante para pipetar para cima e para baixo várias vezes para dissolver completamente o sedimento. Transferir a amostra para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. SDS-PAGE de fracções de pellets e coloração com Coomassie
- Aquecer todas as amostras a 95 ° C durante 10 min. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até serem analisadas por SDS-PAGE.
- Carga de 20 ul das pelotas dissolvidas em um gradiente de pré-molde (4-12%) em gel de mini-Bis-Tris e correr durante 1 h a 200 V em MOPS SDS 1x tampão de corrida.
- Fazer a solução de fixação com 40% de metanol e ácido acético glacial a 10% em DDH 2 O.
- Incubar o gel na solução de fixação durante 1 hora e manchar durante a noite numa placa de cultura celular 15 cm, com um volume suficiente de solução de Coomassie coloidal enquanto suavementeagitação à temperatura ambiente.
NOTA: É importante para fechar o prato, a fim de evitar a evaporação da solução de coloração. - Destain o gel em ddH 2 O. Substitua o DDH 2 O a cada 15-20 minutos até que o fundo gel torna-se clara. Armazenar o gel em ddH2O a 4 ° C até ser digitalizada para quantificação banda.
- Digitalizar o gel em alta resolução e use um software disponível ou personalizado comercialmente para a quantificação de intensidades das bandas de proteína. Subtrair o sinal de fundo a partir de uma região próxima às respectivas bandas e normalizar estes valores para as amostras de controlo sem detergente (a pH 7,4).
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Representative Results
Como já foi discutido, priming em endossomos é necessária para tornar o núcleo IAV perda do revestimento competente. A protonação do núcleo enfraquece interacção de M1 e vRNPs (composto do RNA viral, NP, e o complexo de polimerase PB1 / PB2 / PA). Este processo inicia-se quando o vírus de entrada está exposta a um pH de 6.5 (ou inferior) em endossomas precoces (EES) e continua até que os fusíveis de vírus em torno de pH 5,0 em les.
A fim de imitar a diminuição do pH, a camada inferior dos gradientes de glicerol foram ajustadas para valores entre pH 7,4 e 5,0, a uma concentração constante de sal. X31 derivada a partir de fluido alantóico clarificada foi submetida a centrifugação em gradiente de velocidade e analisadas por SDS-PAGE (Figura 2A, B). Sem detergente presentes na gradiente (Figura 2A, lane1) viriões intactos são sedimentadas, tal como reflectido pelo padrão característico debandas que representam HA (HA1 e HA2; 63 kDa), NP (56 kDa), e M1 (27 kDa) no gel corado com Coomassie. Uma vez que o gel foi corrida sob condições não redutoras, HA1 e HA2 proteoliticamente clivado ainda estão ligados por ligações dissulfureto e executar a aproximadamente 64 kDa. Sob condições redutoras as bandas correspondentes a HA1 e HA2 afiguram-se muito perto das bandas NP e M1, respectivamente, tornando-se difíceis de interpretar fielmente e determinar intensidades de bandas que são exclusivamente derivados do núcleo virai (Figura 2B).
Após a adição de NP-40 para a parte inferior (25%) de glicerol camada do envelope viral, incluindo HA, NA e M2 foram solubilizadas e o núcleo viral sozinho sedimentado em pelete durante a ultracentrifugação (Figura 1; a Figura 2, pista 2). Começando com um pH abaixo de 6,5, M1 é gradualmente perdida a partir da fracção sedimento, atingindo um mínimo entre pH 5,8 e 5,4 (Fig2A, B). Abaixo de pH 5.8 vRNPs foram dissociadas e, portanto, perdido a partir do sedimento. Anteriormente, demonstrou-se que, de facto, vRNPs inteiras são libertados para a camada superior, como a sua saída correlacionada com a perda de PB2 da fracção de sedimento 16. Foram determinadas as intensidades banda de proteína, revelando dois limiares distintos de pH para a desmontagem da camada de M1 e de dissociação de feixes vRNP, respectivamente (Figura 2). bandas adicionais podem ser observados no gel, o que pode corresponder à proteínas de polimerase PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), e M2 (11 kDa). Devido aos seus números de cópias menores dentro virions IAV não foi possível determinar com segurança a sua identidade e que, consequentemente, não foram levados em consideração para a quantificação.
Figura 1: Representação esquemática do IAV 
Figura 2: IAV desmontagem núcleo in vitro mediante acidificação (A) in vitro desmontagem de núcleos X31 em diferentes condições de pH na camada de glicerol inferior.. Como um controlo, NP-40 foi omitido da camada de glicerol inferior (primeira coluna). As amostras foram separadas por SDS-PAGE sob condições não redutoras, seguido de coloração com Coomassie. bandas de proteínas virais estão indicadas à direita. (B) densitométrica quantificação das intensidades das bandas de proteínas virais mostrado em (A). Proteína intensidades de banda de M1 e NP foram normalizados para aqueles a pH 7,4 sem NP-40. Os dados estão representados como médias de experiências em duplicado ± o desvio padrão (SD). Adaptado de Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
cápsides virais são complexos macromoleculares metaestáveis. Enquanto a montagem de viriões requer a encapsidação e condensação do genoma do vírus, o início da próxima ronda de infecção depende de desmontagem desta estrutura capsídeo compacto. Vírus evoluíram para explorar vários mecanismos celulares para controlar o ciclo de revestimento-desencapsulamento, incluindo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, forças físicas proporcionadas pelas proteínas do motor ou helicases, bem como o pH e interruptores iónicos 26,27. Aqui, descrevemos uma abordagem in vitro com base em uma centrifugação em gradiente de glicerol para testar especificamente, o efeito de factores que promovem a desmontagem do núcleo IAV. A técnica pode ser potencialmente adaptado para dissecar os processos não revestidos de outros vírus com envelope.
Através da utilização de Coomassie coloidal, as principais proteínas estruturais IAV M1, NP, HA e podem ser claramente detectados em SDS-PAGE, mesmo com um relativamente pequeno partic vírusnúmero le. No entanto, uma caracterização mais aprofundada da estrutura do capsídeo sedimentado e sua composição exigiria acompanhamento análises, tais como microscopia eletrônica (como apresentado anteriormente 28), Western blot, espalhamento dinâmico de luz ou espectrometria de massa. Além disso extensão do protocolo pode incluir fraccionamento da (25%) fase de glicerol inferior e análise dos componentes principais específicos.
Ajustamento da camada de glicerol inferior para o pH óptimo de fusão de 5,0 (para X31) levou a uma dissociação quase completa da camada de matriz (Figura 2) 16. No entanto, cerca de 30% do sinal de entrada NP pode ainda ser detectada a este pH. É possível que, devido à ausência de factores celulares não revestidos Nesta configuração, como a recentemente identificada desacetilase de histona 6 (HDAC6) 18, a desmontagem incompleta ocorre. Dentro da célula, a acidificação lenta do núcleo virai e exposição a um comutador a partir de Na + para a K + 16. Não se pode excluir que, em nossa configuração, o detergente não-iônico interrompe parcialmente o núcleo exposto de ácido e desestabilizado. No entanto, nenhum efeito sobre o núcleo sedimentando a pH neutro, é observado indicados pelas intensidades da banda de proteína semelhante, em comparação com amostras não solubilizadas (Figura 2A, comparar as pistas 1 e 2). Embora, o ensaio aqui apresentado provou ser altamente reprodutível e (tal como é) suficientemente robusto para a quantificação da faixa, pode ser observado um certo grau de variação.
O uso de glicerol neste protocolo é crítico para os resultados da experiência. Como relatado anteriormente 17, através de uma ultracentrifugação em gradiente de sacarose desestabiliza o núcleo IAV, o que é provavelmente devido a uma elevada força osmótica criada por sacarose. A purificação através de gradientes de sacarose IAV pode exercer efeitos semelhantes. Portanto, em comparação ovo-X31 cultivadas derivadas de cl líquido alantóico arified e os estoques purificado com sacarose. Sem grande diferença pode ser observada no que diz respeito à influência do pH sobre a estabilidade ácida núcleo (dados não mostrados). No entanto, a fim de excluir potenciais efeitos colaterais da sacarose osmoticamente activo, recomendamos a realização do ensaio in vitro perda do revestimento com esclarecidas alant�co sobrenadantes de cultura de células de fluidos ou concentrados.
Além da escolha do material de gradiente, é importante para manter a integridade do gradiente para não influenciar o comportamento de sedimentação dos núcleos virais lisadas e assegurar a reprodutibilidade dos resultados. Além disso, a ressuspensão incompleta da fracção de pelete após ultracentrifugação provavelmente conduz a resultados diferentes. Finalmente, é altamente recomendável o ajustamento do pH das soluções tampão contendo detergente idealmente no mesmo dia da experiência de pequenas alterações na concentração iónica pode ter um efeito drástico sobre a estabilidade do núcleo virai.
conteúdo "> É importante notar que, dependendo da estirpe IAV particular, diferentes eficiências de desmontagem pode ocorrer baseados nas propriedades da respectiva M1 e NP variantes. Isto também pode aplicar para vírus mutantes. Assim, os limiares de pH para a camada da matriz e vRNP dissociação têm que ser determinados para a respectiva estirpe IAV antes de testar influências adicionais. para a análise das condições específicas a estabilidade do núcleo virai sugerimos ajustar a camada de glicerol inferior a um valor de pH de modo que é conseguida a desmontagem de metade do máximo de M1. é possível para investigar a influência de iões específicos, ou agentes redutores, modificando a camada contendo detergente em conformidade. factores não revestidos celulares putativos podem ser adicionados directamente ao gradiente de glicerol. no caso dos factores citoplásmicos, uma terceira camada de glicerol na parte inferior do gradiente pode ser introduzido, que é ajustado para pH neutro, contém o factor celular de interesse, e é livre de detergente. desta forma, the gradiente de três camadas seria ainda mais estreitamente imitar a passagem do vírus através do sistema de endocitose e libertação de segmentos de genes para o citoplasma neutro.Tomados em conjunto, apresentamos um ensaio robusta, mas simples in vitro para estudar IAV priming e uncoating, que tem o potencial para modificações versáteis, a fim de abordar diversas questões no contexto de entrada IAV. Além disso, ele pode ser aplicado para investigar processos de entrada de outros vírus com envelope com mecanismos relacionados não revestidos.
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Acknowledgments
Agradecemos Yohei Yamauchi e Roberta Mancini por nos fornecer reagentes. O laboratório AH foi apoiada pelas redes de formação inicial Marie Curie (ITN), o Conselho Europeu de Investigação (ERC), e pela Swiss National Science Foundation (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
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