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Biology

संवर्धित चिकनी मांसपेशियों का उपयोग कोशिकाओं की sarcoplasmic जालिका के भीतर कैल्शियम उतार चढ़ाव का मापन झल्लाहट आधारित Confocal इमेजिंग

Published: June 20, 2016 doi: 10.3791/53912
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Anaesthesiology, Pharmacology, and Therapeutics, University of British Columbia, 2Department of Biomedical Sciences, Midwestern University

Introduction

सीए 2 एक बहुत ही महत्वपूर्ण आयन शरीर में हर एक कोशिका के भीतर बहुतायत में पाया जाता है। यह विकास, प्रसार, प्रवास, और apoptosis 1-4 सहित कई अलग अलग सेलुलर कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि सीए 2 प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष कार्यों के माध्यम से इन प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, और इसलिए, इस आयन के सामान्य intracellular सांद्रता में परिवर्तन आसानी से प्रभावित कोशिकाओं के लिए नकारात्मक परिणामों में परिणाम कर सकते हैं। एसआर सबसे बड़ा intracellular सीए 2 + 5 सेल के भीतर दुकान के रूप में माना जाता है। दोनों एसआर और कोशिका द्रव्य में सीए 2 स्थिर राज्य स्तर सामान्य रूप में और इस organelle के सीए 2 -transporting चैनलों के बाहर निरंतर प्रवाह के माध्यम से रखा जाता है। चोट या बीमारी के किसी भी रूप के कारण कोशिकाओं पर लगाया तनावपूर्ण स्थितियों सामान्यतः एसआर सीए में महत्वपूर्ण परिवर्तन 2+ उस पर लंबे समय से स्थायी प्रभाव है वह पर जाने के साथ जुड़े रहे हैंसेल के alth। अधिकांश मामलों में गंभीर में, एक जोर दिया सेल की अक्षमता की वसूली और स्थिर अवस्था एसआर सीए 2 + बनाए रखने का स्तर भी apoptosis 6-8 से मौत में culminate सकता है।

सेलुलर सीए 2 गतिशीलता में वर्तमान अनुसंधान तथ्य यह है कि कुछ अध्ययनों परीक्षण organelle सीए 2 दुकान सामग्री सीधे 9-11 द्वारा सीमित है। सबसे आम अभ्यास के बजाय एसआर सीए 2 सामग्री 12-14 में परिवर्तन का अप्रत्यक्ष माप के रूप में cytoplasmic सीए 2 के स्तर की माप शामिल है। इन प्रयोगों में, सीए 2 सामान्यतः organelle की कमी के कारण औषधीय एजेंटों (जैसे thapsigargin) के उपयोग के माध्यम से एसआर रिलीज होने के लिए प्रेरित किया है। निष्कर्ष तो एसआर सीए 2 में परिवर्तन cytoplasmic सीए 2 सांद्रता में उतार-चढ़ाव के आधार पर करने के संबंध में तैयार कर रहे हैं। एक राउंडअबाउट एमए में इस तरह के निष्कर्ष आकर्षित करने की क्षमता जांचकर्ताओं के लिए शेष होने के बावजूदnner, एसआर सीए 2 माप की इस पद्धति स्पष्ट रूप से इस तरह की जानकारी, एकत्र डेटा की व्याख्या के विषय में कई सीमाओं के साथ बटोरने के लिए एक अप्रत्यक्ष तरीका है। आदेश में यह स्पष्ट प्रतिबंध बाईपास के लिए, यह एसआर ल्यूमिनल नेटवर्क के भीतर सीधे पाया सीए 2 की मात्रा को मापने के लिए आवश्यक है।

सीधे intraluminal एसआर सीए 2 स्तरों को रिकॉर्ड करने में सक्षम होने के अंतिम परिणाम के लिए महत्वपूर्ण सेल संस्कृति उपकरण और इस्तेमाल किया सीए 2 + सूचक हैं। डेटा वर्तमान पांडुलिपि में संदर्भित के लिए, यह ध्यान दें कि इस्तेमाल किया VSMCs एक जमे हुए सेल लाइन से आया है महत्वपूर्ण है। प्रकोष्ठों Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% नवजात बछड़ा सीरम (NCS) उल्लिखित प्रयोगों के लिए मार्ग के 22-26 वर्षों में, 5% सीओ 2 की आपूर्ति के साथ एक निरंतर 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated में सुसंस्कृत थे। वर्तमान पद्धति का प्रयोग, उदाहरण के लिए, कोशिकाओं की गई बहुत सफलतापूर्वक एक प्रोटीन मिश्रण है कि बाह्य simulates पर बड़े हो गए हैंऊतक 15 के कई अलग अलग प्रकार का माहौल है। एसआर सीए की नस-साथ सफलता के लिए महत्वपूर्ण 2+ अनुसंधान में इस्तेमाल किया प्रोटीन मिश्रण के प्रकार है; इस मामले में, एक कम वृद्धि कारक किस्म नियमित रूप से सीए 2 सिगनल को प्रभावित करने और आंदोलनों को लगातार परीक्षण किया कोशिकाओं के भीतर से होने वाली इस उपकरण के घटकों से बचने के लिए जरूरी हो गया था। परीक्षण कोशिकाओं के सफल विकास के बाद, सीए 2 + सूचक भी प्रभावी ढंग से इन संवर्धित कोशिकाओं के लिए पेश किया जाना चाहिए। यह एक adenoviral वेक्टर एसआर रहने वाले सीए 2 + सूचक D1SR किया जाता है कि का उपयोग करके संभव हो गया है। एक उच्च अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं इमेजिंग के लिए पहले कम से कम 36-48 घंटे के लिए वायरल वैक्टर के साथ incubated किया जाना चाहिए। यह तैयारी सीए को मापने के लिए उच्च सटीकता और reproducibility के साथ एसआर लुमेन के भीतर 2 + यात्रियों एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है।

D1SR इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सूचक D1ER सीए का एक संशोधित संस्करण है 2+ मैंndicator कि मूल रूप से कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ रोजर वाई Tsien की प्रयोगशाला, सैन डिएगो, अमेरिका 9,16 द्वारा बनाया गया था। मूल D1ER पिछले सीए 2 संकेतक 9,16 की तुलना में है कि एक बहुत व्यापक रेंज (0.5-160 माइक्रोन) के पर प्रदर्शित सीए 2 संवेदनशीलता आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 संकेतक cameleons कहा जाता है की एक दूसरी पीढ़ी के अंतर्गत आता है। नए संस्करण D1SR, डॉ वेन चेन (अल्बर्टा, कनाडा के विश्वविद्यालय) से एक तरह का उपहार है, तथापि, एक उत्परिवर्ती calsequestrin अनुक्रम (के बजाय मूल D1ER में के रूप में एक calreticulin अनुक्रम) किया जाता है। उत्परिवर्ती calsequestrin एक सीए 2 है कि 11 लुमेन एसआर भीतर सीए 2 के लिए बाध्य में अंतर्जात calsequestrin के साथ प्रतिस्पर्धा के मुद्दे को समाप्त करने के लिए बाध्य कम हो गया है। D1SR सूचक एक छोटा बढ़ाया सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) संशोधित calmodulin (सीएएम) और M13 युक्त एक लिंकर प्रोटीन से है कि बाँध (टी किया जाता हैवह मायोसिन प्रकाश श्रृंखला काइनेज कि सीएएम) दृश्यों को बांध के 26 अवशेषों पेप्टाइड। अभियान M13 अनुक्रम अंतर्जात calmodulin के लिए बाध्य से M13 को रोकने के लिए संशोधित किया गया है। इसके अलावा, एसआर प्रतिधारण सुनिश्चित करने के लिए, एक calsequestrin अनुक्रम सीएफपी 11 की 5'अंत पर जोड़ा गया है। जब सीए 2 के लिए बाध्य, कैमरा-M13 डोमेन गठनात्मक परिवर्तन है कि flanking सीएफपी और YFP, जो झल्लाहट संकेत तीव्रता में वृद्धि के रूप में दर्ज की गई है के बीच ऊर्जा हस्तांतरण में वृद्धि में परिणाम के माध्यम से चला जाता है। दूसरी ओर, जब एसआर ल्यूमिनल सीए के 2 + एकाग्रता आ जाता है, अभियान-M13 डोमेन रिवर्स गठनात्मक परिवर्तन के माध्यम से, flanking सीएफपी और YFP, और झल्लाहट संकेत तीव्रता में उल्लेखनीय गिरावट के बीच ऊर्जा हस्तांतरण में कमी के परिणामस्वरूप चला जाता है ।

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Protocol

आचार कथन: सभी प्रयोगों और प्रक्रियाओं ब्रिटिश कोलंबिया, वैंकूवर, कनाडा के विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला जैव सुरक्षा के दिशा निर्देशों के साथ समझौते में आयोजित की गई।

झल्लाहट आधारित confocal माइक्रोस्कोपी के लिए 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन की 1. तैयारी

  1. निम्नलिखित प्रक्रिया 36-48 प्रयोगों के लिए पहले मानव संसाधन का उपयोग कर प्लेटें तैयार करें।
  2. डिग्री सेल्सियस भंडारण -20 से चुना पतला प्रोटीन मिश्रण और 0.25% trypsin EDTA निकालते हैं और उपयोग करें जब तक मोबाइल बर्फ स्नान में उन्हें रखने के लिए।
    ध्यान दें: कोटिंग प्रोटीन मिश्रण केवल उपयोग करने से पहले solidifying से मिश्रण को रोकने के लिए समय की एक संक्षिप्त अवधि के लिए आरटी से अवगत कराया जाना चाहिए। Trypsin समाधान भी ठंडा जब तक की जरूरत रख किया जाना चाहिए; वैकल्पिक रूप से, trypsin 1.5 कदम के पूरा होने के बाद -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से लिया जा सकता है।
  3. DMEM (कोई जोड़ा सीरम, ठंडा): प्रोटीन मिश्रण का एक 1:25 कमजोर पड़ने को तैयार है। एक थाली तैयार किया जा रहा करने के लिए प्रोटीन मिश्रण / DMEM की उचित मात्रा स्थानांतरण। 35 मिमी गिलास तली प्लेटों के लिए, पूरी तरह से थाली के तल पर आंतरिक कांच चक्र को कवर करने के लिए लगभग 200 μl जोड़ें।
  4. प्लेटों छोड़ दो सुरक्षा कैबिनेट के अंदर और आरटी पर कम से कम 30 मिनट के लिए बैठने के लिए। गर्म इस समय अवधि के दौरान पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक 10% एनसीएस के साथ DMEM।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी के स्नान में गर्म trypsin अगले कदम के लिए तुरंत पहले।
  6. DMEM संस्कृति फ्लास्क में वर्तमान में है कि एक गिलास पिपेट और शोषण का उपयोग कर निकालें। गर्म बाँझ पीबीएस के साथ कुप्पी का धो मंजिल शेष DMEM अवशेषों को हटाने के लिए।
  7. कुप्पी नीचे से पहले सुसंस्कृत चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं को बेदखल:
    नोट: फ्लास्क दिनों इस कदम के लिए स्थापित किया गया था कोशिकाओं प्लेट तैयार करने से पहले वांछित confluency (लगभग 80%) तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं। प्रकोष्ठों मूल रूप से 10% एनसीएस के साथ DMEM के 20 मिलीलीटर में कुप्पी में निलंबित कर दिया और 24 घंटा, जिसके बाद DMEM आपूर्ति ताजा था और कोशिकाओं इनक्यूबेटर को लौट रहे थे के लिए 5% सीओ 2 की आपूर्ति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे। DMEM पूर्व संध्या ताज़ा किया गया थाRY 48 घंटा इन प्रारंभिक चरणों का पालन जब तक कोशिकाओं confluency पर पहुंच गया।
    1. धो trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ जल्दी से फ्लास्क और फिर सक्शन का उपयोग कर 1 मिलीलीटर trypsin को हटा दें।
    2. trypsin के एक और 1 मिलीलीटर में जोड़ें और लंबी अवधि (लगभग 30-60 सेकंड) के लिए छोड़ देते हैं, फ्लास्क swishing सुनिश्चित करने के लिए एंजाइम कुप्पी की पूरी तह से संपर्क करता है।
    3. निरीक्षण कितना कोशिकाओं एक खुर्दबीन के नीचे अलग है जब तक कुप्पी से जुदाई के साथ संतुष्ट। वैकल्पिक swishing trypsin समाधान और कुप्पी से अलग कोशिकाओं के अनुपात से संतुष्ट हैं जब तक जाँच सेल टुकड़ी।
      नोट: कुप्पी 37 डिग्री सेल्सियस पर इस प्रक्रिया को तेज करने के लिए लगभग 30-60 सेकंड के लिए इनक्यूबेटर लौटा जा सकता है।
    4. एक बार कोशिकाओं trypsin का उपयोग उखाड़ फेंकना किया गया है, फ्लास्क को 10% एनसीएस के साथ ताजा DMEM जोड़ने trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के (पर्याप्त मात्रा इतनी है कि trypsin रूपों फ्लास्क में कुल मात्रा का 1/8 वें)।
      नोट: उदाहरण के लिए, जब एक 250 मिलीलीटर संस्कृति कुप्पी का उपयोग कर, यह होगा7 मिलीलीटर DMEM trypsin के 1 मिलीलीटर के लिए जोड़ा सेल के समाधान के 8 मिलीलीटर में परिणाम हो सकता है।
  8. स्थानांतरण के लिए एक साफ (लेबल) 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कुप्पी से सेल समाधान हो जाती है।
  9. प्रत्येक थाली करने के लिए 1 मिलीलीटर ताजा DMEM प्लस 10% एनसीएस जोड़े तैयार किया जा रहा (पर्याप्त मध्यम 24 घंटा पिछले करने के लिए)।
  10. धीरे ट्यूब सेल समाधान के लिए कई बार युक्त किसी भी गोली कि गठन हो सकता है को तोड़ने के लिए पलटना।
  11. पिपेट प्रत्येक थाली में धीरे मिश्रित सेल समाधान की मात्रा में वांछित।
    नोट: अनुशंसित एसएमसी संख्या इस प्रोटोकॉल के लिए चढ़ाया 0.5-0.8 x 10 6 प्रति 35 मिमी संस्कृति व्यंजन है। इन नंबरों को सेल प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और परीक्षण किया और संशोधित किया जाना चाहिए प्रत्येक प्रयोगशाला द्वारा।
  12. एक थाली भंवर अच्छी तरह से दक्षिणावर्त / वामावर्त कांच नीचे भर में कोशिकाओं के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए।

2. adenoviral वेक्टर साथ क्षणिक अभिकर्मक उठाते D1SR सीए 2 + सूचक

  1. मुझे के अलावा के बादdium और प्रत्येक थाली करने के लिए सेल समाधान, कम से कम 1 घंटे के लिए 5% सीओ 2 की आपूर्ति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते कोशिकाओं बर्तन के तल पर कांच को ठीक से संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए प्लेटों छोड़ दें। 15 मिनट के अंतराल पर एक खुर्दबीन के नीचे प्लेटों की जाँच करें जब तक कोशिकाओं स्पष्ट रूप से जुड़े होते हैं।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से एडीनोवायरस-D1SR विभाज्य निकालें और जैविक सुरक्षा कैबिनेट करने के लिए परिवहन करने के लिए मोबाइल बर्फ स्नान में रहते हैं।
  3. पिपेट वांछित खुराक प्रत्येक थाली करने के लिए ठंडा D1SR की (100 में संक्रमण की बहुलता)।
    नोट: प्रति प्लेट की जरूरत adenoviral समाधान की मात्रा के लिए गणना मूल स्टॉक समाधान है, जो पट्टिका गठन इकाई (pfu) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है में वायरस अनुमापांक पर निर्भर करता है। हमारे अनुभव के आधार पर, हम संक्रमण 100 के (MOI) है, जो संस्कृति की थाली में एक चिकनी पेशी सेल (एसएमसी) को संक्रमित करने के लिए जरूरी संख्या या वायरस कणों के रूप में व्याख्या की है की बहुलता सलाह देते हैं।
  4. 5% सीओ 2 आपूर्ति हे / एन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित कोशिकाओं को सेते हैं।
  5. अगले दिन, ताजा DMEM के 1 मिलीलीटर प्लस 10% एनसीएस के साथ कोशिकाओं की भरपाई होगी।
  6. 5% सीओ 2 हे / एन में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं।

3. एसआर Luminal सीए के मापन 2 + झल्लाहट आधारित Confocal इमेजिंग का उपयोग

  1. हे / एन ऊष्मायन के बाद, थाली से संस्कृति के माध्यम से हटा दें।
  2. 1 मिलीलीटर गर्म शारीरिक HEPES-PSS युक्त बफर के साथ संस्कृति की थाली धो (mmol·L में - 1) सोडियम क्लोराइड 140, ग्लूकोज 10, KCl 5, HEPES 5, 2 CaCl 1.5 और 2 MgCl 1 (7.4 पीएच) में तीन बार।
  3. रिकॉर्डिंग की दीक्षा के लिए तुरंत पहले 1 मिलीलीटर ताजा गर्म HEPES-पीएसएस बफर जोड़ें।
  4. झल्लाहट एसई (अवगत उत्सर्जन) आवेदन (या इसी तरह की सुविधा) confocal खुर्दबीन के जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पर प्रारंभिक इमेजिंग प्रदर्शन।
    1. एक बार आवेदन खुला है, वांछित प्रयोगात्मक शर्तों को प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करने के लिए "सेटअप" टैब में क्लिक करें।
      2. <li> मैन्युअल चैनल सेटिंग बदलें ताकि कोशिकाओं 440 एनएम पर अनुक्रम में उत्साहित कर रहे हैं (दाता के लिए और चैनलों झल्लाहट) और 513 एनएम (स्वीकर्ता चैनल के लिए)। 488 एनएम (दाता के लिए) और 535 एनएम (झल्लाहट और स्वीकर्ता के लिए) पर उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य लीजिए।
    2. कोशिकाओं और जोखिम के बीच 10 सेकंड के अंतराल (तीन अनुक्रमिक सीएफपी दाता, झल्लाहट, और YFP स्वीकर्ता चैनलों के लिए समय रिकॉर्डिंग) के 150 एमएस उत्तेजना जोखिम समय के साथ 15% संचरण पर प्रकाश की तीव्रता सेट।
  5. खुर्दबीन मंच पर प्लेट स्थिर।
  6. छवि संकल्प जाँच करने के लिए "लाइव" बटन का प्रयोग करें। सेटिंग्स आगे Tweak जब तक वांछित संकल्प पर पहुंच गया है।
  7. फिर भी "सेटअप" टैब के अंतर्गत, नमूना "कब्जा छवि" बटन का उपयोग करने का एक छवि ले।
  8. "मूल्यांकन" टैब पर चल रहा है, गणना करने के प्रयोगों के लिए झल्लाहट क्षमता किया जा रहा उपयुक्त विधि का चयन करें। विधि 3, ratiometric गणना [ई ए (मैं) = बी / ए का उपयोग कर], इस तरह के संकेत के रूप में D1SR cameleons से जुड़े प्रयोगों के लिए सिफारिश की है।
  9. "ग्राफ" टैब पर स्विच निरीक्षण करने के लिए तीव्रता मूल्यों प्रयोग के दौरान ग्राफ के रूप में दर्ज की जा रही सक्षम हो।
  10. छवि दर्शक में एक रॉय ड्रा प्रयोग के रूप में आय ग्राफ पर ब्याज की इस क्षेत्र की इसी औसत तीव्रता निरीक्षण करने के लिए।
    नोट: अन्वेषक भी कई ROIs आकर्षित और इसी तीव्रता दर्ज की गई और ग्राफ पर एक साथ प्रदर्शित किया है चुन सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, जांचकर्ताओं प्रारंभिक रिकॉर्डिंग के लिए एक एकल रॉय रूपरेखा, और सॉफ्टवेयर के एक डेटा विश्लेषण उन्मुख संस्करण पर प्रयोग फ़ाइल खोलने के द्वारा एक बाद में समय में कई ROIs की रूपरेखा तैयार करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं।
    नोट: झल्लाहट आधारित प्रयोगों की स्थापना के लिए आवश्यक कदम पर आगे विस्तार झल्लाहट आवेदन जादूगर मैनुअल में पाया जा सकता है। माइक्रोस्कोप झल्लाहट जादूगर के साथ सुसज्जित नहीं है, तो निम्न प्रोटोकॉल के लिए मानकों को स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामैन्युअल रिकॉर्डिंग।
  11. रिकॉर्डिंग शुरू करें और ब्याज के एजेंट को शुरू करने से पहले संकेत की एक सतत बेसल रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 3 मिनट के लिए डेटा संग्रह अनुमति देते हैं।
  12. सीए 2 -moving एजेंट का परिचय (जैसे 2 माइक्रोन thapsigargin, 100 एनएम endothelin-1), एसआर सीए 2 घट मैन्युअल पूर्व निर्धारित खुराक सीधे थाली में एक जगह के रूप में किया जा रहा है के पास ब्याज के क्षेत्र के लिए pipetting द्वारा लिए एक उपकरण के रूप में संभव के रूप में दर्ज की गई। एक वांछित समय के बाद उपचार के लिए रिकॉर्डिंग जारी रखें।
  13. कैद ratiometric confocal उलटा माइक्रोस्कोप झल्लाहट एसई आवेदन का उपयोग करने का एक 63X उद्देश्य तेल विसर्जन के साथ धारावाहिक छवियों (512 x 512 पिक्सल) झल्लाहट।
  14. ब्याज (आरओआई) के प्रत्येक क्षेत्र में 5-10 एसएमसी के एक समूह से इमेजिंग से उत्पन्न डेटा इकट्ठा करने और बाद में प्रारूप और आँकड़ों के आधार पर सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण।
    1. बाद में उपयोग के लिए डेटा को बचाने के लिए, दर्ज की गई ट्रेस ओवर राइट क्लिक करें और बचत करने के लिए "निर्यात" विकल्प का चयनई अन्वेषक के चुने ड्राइव पर दर्ज मतलब संकेत तीव्रता के साथ स्प्रेडशीट।
    2. समय बिंदु 0 सेकंड में मनाया शुरू तीव्रता मूल्य द्वारा प्रत्येक डेटा बिंदु विभाजित करके प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग से डेटा मानक के अनुसार।
    3. मैन्युअल कॉपी करने और उनके मूल स्प्रेडशीट / सेकंड से प्रासंगिक डेटा पंक्तियों चिपकाने से एक सांख्यिकीय कार्यक्रम परियोजना की फाइल में स्प्रेडशीट से आयात सामान्यीकृत डेटा।
    4. स्वचालित रूप से कार्यक्रम में चिपकाया डेटा सेट करने के लिए इसी रेखांकन उत्पन्न करते हैं।
      नोट: कार्यक्रम की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स आयात किए गए डेटा से लाइन रेखांकन उत्पन्न करते हैं। प्रदर्शित किया ग्राफ प्रकार "परिवर्तन" मुख्य उपकरण पट्टी के भीतर पाया शीर्षक के अंतर्गत "ग्राफ के एक अलग प्रकार का चयन करें" बटन पर क्लिक करके संशोधित किया जा सकता है।
    5. एक भी डाटा शीट में समान प्रयोगों के एक बड़े समूह के भीतर कई स्वतंत्र परीक्षणों का प्रतिनिधित्व करने के पूल डेटा प्रदर्शन विशेष परीक्षा के लिए एक औसत का पता लगाने का उत्पादन।
    15. 4. Cytoplasmic सीए की तैयारी 2 + सूचक

    1. एक काले रंग की microcentrifuge ट्यूब में डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 1 मिलीलीटर में 0.0125 जी Pluronic एसिड (पीए) भंग (मोबाइल पानी में स्नान ट्यूब गर्म करने के लिए पीए भंग करने में मदद करने के लिए हो सकता है)।
    2. -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से cytoplasmic सीए 2 + सूचक डाई (Fluo 4 बजे) की एक ट्यूब (50 ग्राम) निकालते हैं।
    3. पन्नी में डाई की ट्यूब लपेटें प्रकाश के साथ संपर्क में आने से जितना संभव हो इसे बचाने के लिए।
    4. पिपेट डाई युक्त ट्यूब में DMSO + पीए समाधान के 45 μl। आरटी पर पन्नी और दुकान में DMSO + पीए समाधान लपेटें।
    5. अच्छी तरह से समाधान ऊपर और नीचे कई बार pipetting द्वारा ट्यूब की सामग्री मिक्स। वैकल्पिक रूप से, 10 मिनट के लिए डाई ट्यूब sonicate।
      नोट: अच्छी तरह से DMSO + पीए समाधान के लिए पर्याप्त होगा भर डाई बांटने का या तो विधि; यह बस अन्वेषक की प्राथमिकता का मामला है। अन्वेषक समाधान sonicate के लिए चुनता है यह,एक अलग क्षेत्र / कमरे में जहां दूसरों शोर से अप्रभावित हो जाएगा में किया जाना चाहिए। अन्वेषक भी भारी मफलर का उपयोग कान की रक्षा करने के लिए करना चाहिए।
      1. तो समाधान sonicating, एक फोम ट्यूब धारक और 2/3 पूर्ण (साथ DH 2 हे) sonicator स्नान के अंदर जगह के अंदर डाई युक्त डालने पन्नी लिपटे ट्यूब।
      2. अलग क्षेत्र / कमरे और सत्ता पर मशीन में रखें sonicator स्नान (सुरक्षात्मक headwear सुनिश्चित sonication प्रक्रिया की शुरुआत करने से पहले स्थान पर है)। कमरे में छोड़ दें और मशीन को बंद करने और ट्यूब (पन्नी में लपेटा के रूप में लंबे समय के लिए प्रकाश से बचाने के लिए रखने के लिए) पुन: प्राप्त करने से पहले 10 मिनट के लिए चल छोड़ दें।
    6. अंधेरे microcentrifuge ट्यूबों में अब अच्छी तरह से मिश्रित समाधान विभाज्य (ट्यूब प्रति 5 μl, 10 ट्यूबों कुल करने के लिए सक्षम होना चाहिए)।
    7. पन्नी में प्रत्येक विभाज्य ट्यूब लपेटें। -20 उपयोग करें जब तक डिग्री सेल्सियस शर्तों पर लेबल ट्यूब और अवशोषक में स्टोर।

    5. Cytoplasmic सीए के मापन 2+

    1. चूहे महाधमनी एसएमसी की संस्कृति प्लेटें तैयार करने के लिए 1.1-1.12 में चरणों का पालन करें।
    2. 48 घंटा के बाद संस्कृति पर थाली से संस्कृति के माध्यम से निकालें।
    3. Cytoplasmic सीए 2 + सूचक (5 μl) -20 डिग्री सेल्सियस भंडारण से पहले से तैयार की विभाज्य निकालें और उपयोग करें जब तक मोबाइल बर्फ स्नान में बनाए रखें।
    4. 1 मिलीलीटर गर्म शारीरिक HEPES-PSS युक्त बफर के साथ संस्कृति की थाली धो (mmol·L में - 1) सोडियम क्लोराइड 140, ग्लूकोज 10, KCl 5, HEPES 5, 2 CaCl 1.5 और 2 MgCl 1 (7.4 पीएच) में तीन बार।
    5. गर्म HEPES-पीएसएस के 1 मिलीलीटर के साथ सूचक मिक्स और संस्कृति की थाली पर इसे लोड।
    6. आरटी पर 1 घंटे के लिए सूचक (24 डिग्री सेल्सियस) के साथ एसएमसी सेते हैं।
    7. संस्कृति की थाली से सूचक निकालें और 1 मिलीलीटर गर्म शारीरिक HEPES-पीएसएस बफर तीन बार से धो लें।
    8. रिकॉर्डिंग की दीक्षा के लिए तुरंत पहले 1 मिलीलीटर ताजा गर्म HEPES-पीएसएस बफर जोड़ें।
    9. सीरियल छवियों (512 x 512 पिक्सल) एक 63X ओ के साथ कब्जाconfocal उलटा माइक्रोस्कोप के आईएल विसर्जन उद्देश्य।
      1. मैन्युअल सेटिंग बदलें ताकि कोशिकाओं 488 एनएम पर उत्साहित हैं, और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य 700 हर्ट्ज की एक स्कैनिंग गति के साथ 555 एनएम पर एकत्र कर रहे हैं।
      2. कोशिकाओं के 150 मिसे उत्तेजना जोखिम समय (समय की राशि है कि कोशिकाओं रिकॉर्डिंग के दौरान निर्दिष्ट समय अंतराल पर प्रकाश के संपर्क में रहे हैं) और जोखिम के बीच 5 सेकंड के अंतराल के साथ 15% संचरण पर प्रकाश की तीव्रता सेट।
    10. खुर्दबीन मंच पर प्लेट स्थिर और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
    11. कम से कम 3 मिनट के लिए रिकार्ड हित के एजेंट को शुरू करने से पहले संकेत की एक सतत बेसल रिकॉर्डिंग सुनिश्चित करने के लिए।
    12. एसआर सीए घट 2 + (कदम 3.16 में वर्णित के रूप में) और समय के बाद उपचार के वांछित राशि के लिए रिकॉर्डिंग जारी रखने के लिए एक उपकरण के रूप में सीए 2 -moving एजेंट (जैसे 2μM thapsigargin) का परिचय।
    13. रिकार्ड संकेत तीव्रता प्रतिदीप्ति सी के औसत से माइक्रोस्कोप विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोगgnals (एफ / एफ 0) ब्याज (आरओआई) के प्रत्येक क्षेत्र में 5-10 एसएमसी के एक समूह से। लीजिए, प्रारूप, और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग इमेजिंग से उत्पन्न डेटा का विश्लेषण। डेटा संग्रह का विवरण और विश्लेषण के लिए कदम 3.18.1-3.18.5 इस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर देखें।

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Representative Results

इस खंड में परोक्ष रूप से cytoplasmic सीए में उतार-चढ़ाव देख द्वारा सीए 2 दुकान सांद्रता organelle में परिवर्तन को मापने का आमतौर पर कार्यरत तरीके की तुलना में, परिणाम है कि वर्णित विधि का उपयोग एसआर ल्यूमिनल सीए 2 एकाग्रता डेटा पर कब्जा करने के लिए प्राप्त किया जा सकता का उदाहरण प्रदान करता है 2+ ।

चित्रा 1 ए एसएमसी संस्कृति YFP चैनल (514 एनएम उत्तेजना / 535 एनएम उत्सर्जन) में D1SR adenovirus साथ ट्रांसफ़ेक्ट के हित (आरओआई) के एक क्षेत्र के एक स्नैपशॉट पता चलता है। के रूप में दिखाया जाता है, हालांकि सभी एसएमसी D1SR अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक रहे हैं, यह स्पष्ट है कि D1SR सूचक के लिए अभिव्यक्ति के स्तर में एक ही रॉय के भीतर विभिन्न कोशिकाओं के बीच अलग अलग है। चित्रा 1 बी एक एसएमसी की एक प्रतिदीप्ति छवि का एक 2-डी प्रोजेक्शन D1SR साथ ट्रांसफ़ेक्ट चलता एडीनोवायरस (YFP चैनल) है, जो सीए 2 वितरण की एक स्पष्ट तस्वीर प्रस्तुत करता हैविशाल एसआर ल्यूमिनल नेटवर्क के भीतर। चित्रा 1C सीएफपी (440/488 एनएम), झल्लाहट (440/535 एनएम), और YFP (514/535) एनएम बैंड पास फिल्टर का उपयोग एसएमसी में D1SR सूचक वितरण प्रस्तुत करता है।

हम यह भी सीए 2 संकेत एसआर में इस लक्षित आयन की आवाजाही की निगरानी से प्राप्त निशान के उदाहरण हैं, thapsigargin (2 माइक्रोन) (चित्रा 2) एक एसआर खाली एजेंट के लिए कोशिकाओं की भारी जोखिम का स्पष्ट परीक्षण का उपयोग कर दिखा। जैसा कि चित्र 2A और 2 बी में दिखाया गया है, thapsigargin एसआर सीए 2 सामग्री ([सीए 2 +] एसआर) में एक बूंद लाती है।

चित्रा 3 ए में, हम cytoplasmic सीए 2 एसआर खाली एजेंट thapsigargin (2 माइक्रोन) के साथ इलाज सूचक के साथ भरी हुई सुसंस्कृत एसएमसी के प्रतिनिधि छवियों से पता चला है। दर्ज की गई सीए 2 संकेत में मनाया क्षणिक शिखर ( 2 रिलीज का एक संकेत है, भले ही सीए 2 + यात्रियों के स्रोत को स्पष्ट रूप से पहचान नहीं की जा सकती है।

चित्रा -4 ए एस आर कैल्शियम सूचक D1SR व्यक्त करने और endothelin -1 के 100 एनएम के साथ इलाज किया सुसंस्कृत एसएमसी के प्रतिनिधि स्नैपशॉट पता चलता है। दोनों के रूप में आंकड़े -4 ए और 4 बी में दिखाया गया है, endothelin-1 एसआर कैल्शियम की मात्रा में एक धीमी, लेकिन स्थिर बूंद के रूप में D1SR संकेत झल्लाहट में एक बूंद से मापा लाती है। जैसा कि स्पष्ट, ratiometric झल्लाहट प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण बात सीए के अध्ययन की अनुमति देता 2+ आंदोलनों सीधे एजेंट की कार्रवाई की विधा से संबंधित प्रयोग किया जाता है। सीधे इस तरीके से सेल में सबसे बड़ा सीए 2 की दुकान से / में इस आयन के आंदोलन को मापने के सीए के परिणामों के प्रतिनिधि 2 + गतिशीलता सीधे उपलब्ध कराने के परिवर्तन के लिए एसआर की कार्रवाई से संबंधित या नियत करने में मददगार है एसआर लुमेन माहौल में है।

आकृति 1
चित्रा 1. चूहे महाधमनी एसएमसी में एसआर सीए 2 + सूचक D1SR का वितरण। (ए) प्रतिनिधि छवि चित्रण एसएमसी संस्कृति 48 घंटा के बाद संक्रमण पर D1SR andenoviral वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट। (बी) के एक सुसंस्कृत एसएमसी में D1SR वितरण की एक प्रतिदीप्ति छवि YFP चैनल (514 एनएम उत्तेजना / 535 एनएम उत्सर्जन) का उपयोग कर के 2-डी प्रोजेक्शन। (सी) एक एसएमसी के प्रतिनिधि स्नैपशॉट सीएफपी (440/488 एनएम), झल्लाहट (440/535 एनएम), और YFP (514/535) एनएम बैंड पास फिल्टर का उपयोग D1SR सूचक के साथ ट्रांसफ़ेक्ट। स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2. thapsigargin में उल्लेखनीय गिरावट का कारण बनता है [सीए 2 +] एसआर। (ए) वास्तविक समय pseudocolor स्नैपशॉट (झल्लाहट चैनल) सुसंस्कृत चूहे महाधमनी एसएमसी D1SR साथ ट्रांसफ़ेक्ट और यह दर्शाता संकेत तीव्रता में कमी दिखा thapsigargin के 2 माइक्रोन के साथ इलाज की thapsigargin प्रेरित सीए 2 रिलीज होने के कारण एसआर सीए 2 सामग्री में उल्लेखनीय गिरावट। (बी) के लिए [सीए 2 +] एसआर में उल्लेखनीय गिरावट की पुष्टि thapsigargin 2 माइक्रोन के साथ इलाज किया सुसंस्कृत एसएमसी में एफ / एफ 0 मूल्य प्रतिनिधि ट्रेस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
फाईआंकड़ा 3. thapsigargin cytoplasmic सीए में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनता है 2 + ([सीए 2 +] मैं)। (ए) सुसंस्कृत चूहे महाधमनी cytoplasmic सीए 2 सूचक के साथ भरी हुई है, और thapsigargin के 2 माइक्रोन के साथ इलाज किया एसएमसी के प्रतिनिधि स्नैपशॉट। दिखाया गया है, thapsigargin सीए की रिहाई के लिए 2 + एसआर से होने के कारण कोशिका द्रव्य के भीतर संकेत तीव्रता में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनता है। (बी) के लिए thapsigargin के 2 माइक्रोन के साथ इलाज किया सुसंस्कृत एसएमसी में एफ / एफ 0 मूल्य प्रतिनिधि ट्रेस। सीए 2 संकेत में दर्शाया वृद्धि सीए 2 की राशि एसआर से रिहा करने के लिए आनुपातिक माना जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 4. endothelin -1 में उल्लेखनीय गिरावट का कारण बनता है [सीए 2 +] एसआर। (ए) वास्तविक समय सुसंस्कृत चूहे महाधमनी एसएमसी D1SR साथ ट्रांसफ़ेक्ट और 100 एनएम के साथ इलाज के pseudocolor स्नैपशॉट (झल्लाहट चैनल) endothelin-1 एक धीमी दिखा लेकिन संकेत तीव्रता में लगातार कमी endothelin प्रेरित सीए 2 एसआर के लिए रिलीज के कारण एसआर सीए 2 सामग्री में उल्लेखनीय गिरावट का संकेत है। (बी) के लिए endothelin -1 के 100 एनएम के साथ इलाज किया सुसंस्कृत एसएमसी में एफ / एफ 0 मूल्य प्रतिनिधि ट्रेस। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल एसआर के लुमेन भीतर सीए 2 सांद्रता का अध्ययन करने के D1SR adenovirus साथ VSMCs के अभिकर्मक का वर्णन है। इस विधि इस organelle भीतर सीए 2 के प्रत्यक्ष माप के साथ ही विभिन्न कैल्शियम से बढ़ एजेंटों के आवेदन की एक परिणाम के रूप में अपने आंदोलन / SR से बाहर के लिए अनुमति देता है। इस विधि कैसे एसआर और cytoplasmic सीए 2 स्तरों में परिवर्तन समग्र सेलुलर स्वास्थ्य प्रभावित करते हैं और कैसे इन परिवर्तनों अंतर से संबंधित हैं की एक व्यापक समझ की दिशा में काम जांचकर्ताओं के लिए कई फायदे हैं। Intracellular सीए 2 आंदोलन के पारंपरिक अवलोकन केवल cytoplasmic सीए 2 स्तरों में परिवर्तन की ट्रैकिंग शामिल है। एक महत्वपूर्ण लाभ D1SR या इसी तरह के निर्माणों का उपयोग करने से प्राप्त होता है, इसलिए, बल्कि द्वारा एसआर पर एगोनिस्ट के प्रभाव पर अस्पष्ट निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए होने से ऐसे एसआर रूप में एक विशिष्ट organelle से जुड़े इस आयन की आवाजाही पर नजर रखने के लिए, की क्षमता हैपरोक्ष रूप से cytoplasmic सीए 2 तरह के हेरफेर से प्रेरित स्तरों में परिवर्तन देख। उसी नस-साथ, एजेंटों को प्रभावित करने के लिए सेवा एसआर सीए विशेष रूप से और अधिक कुशलता से दोनों organelle और सेल चौड़ा सेलुलर सीए 2 सांद्रता और समग्र स्वास्थ्य पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 2+। यह इन फायदों कि D1SR साथ संवर्धित कोशिकाओं के अभिकर्मक एक और अधिक प्रत्यक्ष है, साथ ही मानार्थ, intraluminal एसआर सीए 2 स्तरों में परिवर्तन को मापने का तरीका प्रदान करता है के कारण है। महत्व के अलावा तथ्य यह है कि इस मॉडल औषधीय या शारीरिक एजेंटों कि सेलुलर तनाव या विशिष्ट कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है के जवाब में एसआर नेटवर्क के भीतर सीए में परिवर्तन 2 + एकाग्रता को मापने के लिए एक उपकरण प्रदान करता है। यह ब्याज की किसी भी कोशिका में D1SR सूचक के लिए एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करके संभव हो जाएगा। ईआर / एसआर भीतर कैल्शियम एकाग्रता तो सामान्यीकृत D1SR अनुपात औजार (एफ / एफ 0 द्वारा गणना की जा सकती है) मानक अंशांकन वक्र के रूप में पहले 10, 11 में वर्णित के खिलाफ।

प्रोटोकॉल यहाँ रेखांकित की एक सीमा है अन्य प्रकार की कोशिकाओं में D1SR निर्माण के उपयोग पर उपलब्ध जानकारी का अभाव है। इस विधि को अब तक, हमारे अध्ययन के लिए कई बार 13-15 में चूहे एसएमसी के लिए सफल साबित हालांकि अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ इसके उपयोग तारीख को सीमित कर दिया गया है गया है। इस विधि की सफलता के लिए, यह है कि सभी सावधानियों सेल संस्कृति कदम के स्वस्थ प्रगति सुनिश्चित करने के लिए लिया जाता है महत्वपूर्ण है। यह एक उपयुक्त सामग्री इस तरह की खरीद के लिए उपलब्ध कई प्रोटीन आधारित पतला पदार्थ है कि गिलास तली माइक्रोस्कोपी प्लेटों पर चूहे महाधमनी एसएमसी की पर्याप्त विकास को बढ़ावा देने के रूप में साबित किया है प्लेटें, पर सेल के विकास के लिए अनुमति देता का उपयोग करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं उनके इष्टतम मार्ग दौरान और उच्च confluency पर तैयार नहीं कर रहे हैं, तो D1SR और बाद इमेजिंग के साथ अभिकर्मक की सफलता में परिवर्तनशीलता मनाया जा सकता है। पी के लिए परिवर्तनएक ही सेल लाइन का लंबे समय तक इस्तेमाल के लिए निहित सबऑप्टिमल अभिकर्मक और कमजोर संकेत इमेजिंग चरण के दौरान प्राप्त किया जा रहा में परिणाम हो सकते henotype। सीमाओं इस विधि के प्रयोग में फंसा इसलिए, मुख्य रूप से उन आवश्यक सेल संस्कृति काम से अपरिहार्य बना रहे हैं के रूप में D1SR निर्माण का उपयोग प्रयोगों उनके निष्पादन करने से पहले कम से कम 36-48 घंटे के लिए तैयार रहना चाहिए इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की confluency सुनिश्चित करने के लिए और adenovirus के साथ कोशिकाओं बढ़ रही है की ऊष्मायन के लिए पर्याप्त समय है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा से [एमओपी 1112666 CVB और मुझे] धन के द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate) Life technologies 11995-065 Warm in 37 °C water bath before use
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml Corning 356230 Keep at -20 °C until right before use
Newborn Calf Serum Sigma-Aldrich Keep at -20 °C until right before use
35 mm glass-bottomed plates MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM vented blue plug seal cap flask BD Falcon 353136
Trypsin/EDTA Solution Life technologies 25200056 Keep at -20 °C until right before use
50 ml Polypropylene Conical Tube BD Falcon 352070
D1SR N/A N/A Gift
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8779
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Fluo 4-AM Life technologies F-23917 Keep at -20 °C until right before use
1.5 ml Black Microcentrifuge Tubes Argos Technologies T7100BK
Leica TCS SP5 confocal microscope Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application) Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0 GraphPad Software, Inc.

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 112 sarcoplasmic जालिका कैल्शियम का संकेत है संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण Confocal माइक्रोस्कोपी कैल्शियम संकेतक
संवर्धित चिकनी मांसपेशियों का उपयोग कोशिकाओं की sarcoplasmic जालिका के भीतर कैल्शियम उतार चढ़ाव का मापन झल्लाहट आधारित Confocal इमेजिंग
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Ziomek, G., van Breemen, C.,… More

Ziomek, G., van Breemen, C., Esfandiarei, M. Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging. J. Vis. Exp. (112), e53912, doi:10.3791/53912 (2016).

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