Introduction
Leveren sinuskurver indeholder talrige leukocytundertyper af forskellige immunaktiviteter kritiske for organismen. For eksempel er marginating hepatisk (MH) naturlige dræber (NK) celler, også kendt som pit celler, kendetegnet morfologisk som store granulære lymfocytter (LGLs) og funktionelt som leukocytter med spontan cytotoksisk kapacitet, der muliggør hepatisk-resistens imod optagelse af blod- bæres tumor metastaser. Målet med fremgangsmåden heri præsenterede er at muliggøre selektiv høst af MH leukocytter, for at studere dette vigtige og unikke cellepopulation (og immun rum), og at belyse virkningen af forskellige manipulationer (f.eks immunaktivering) på disse specifikke celler.
Trods den manglende immunitet at eliminere en udvikling af primær tumor, beviser hos cancerpatienter og dyremodeller viser, at immunsystemet kan styre cirkulerende tumorceller, mikrometastaser og tilbageværende sygdom through cellemedieret immunitet (CMI). Men der er en tilsyneladende uoverensstemmelse mellem disse in vivo kapaciteter og in vitro undersøgelser i mennesker og dyr, som viser, at de fleste autologe tumorceller er resistente over for cytotoksicitet ved at cirkulere eller milt leukocytter 1,2. Denne uoverensstemmelse kan tilskrives, i det mindste delvis, til in vivo foreligger en særskilt leukocyt subpopulation, nemlig marginating-hepatisk (sinusoids) leukocytter og deres subpopulation af aktiverede NK-celler, nemlig pit celler 3. Faktisk upublicerede data fra vort laboratorium viste, at syngene tumorceller (MADB106), som blev fundet resistent over for cirkulerende og milt leukocytter, i F344-rotter blev lyseret ved MH-NK-celler 4. Således kan tumorceller, der er angiveligt "NK-resistente" til cirkulerende leukocytter være kontrolleret af MH-NK-celler. Bemærkelsesværdigt, i mus den forøgede aktivitet af MH-NK er kun tydelig følgende in vivo immunestimulering (fx gennem anvendelse af Poly I: C eller CpG-C) 5.
Lever-specifik NK-celler (MH-NK) er placeret inde i sinusformede lumen, der tilslutter sig de endotelceller og Kupffer celler. MH-NK-celler udelukkende kendetegnet ved sfæriske tætte granuler og stang-kernehus vesikler 6, som indeholder sur phosphatase som lysosomale enzymer og perforin og granzymer som bioaktive stoffer 7,8. Sammenlignet med cirkulerende NK-celler, MH-NK-celler udviser et højere antal og størrelse af granuler og vesikler 9-11. Under inflammatoriske tilstande, blev MH-NK-celler vist at udvise højere ekspression af LFA-1 12, sammenlignet med cirkulerende NK-celler. Denne forøgede ekspression kan udgøre en mekanisme, hvorved MH-NK-celler er mere cytotoksisk over for visse tumorceller end cirkulerende NK-celler 13,14. nterestingly, efter in vitro inkubation med interleukin (IL) -2, MH-NK-celler bliver forstørret, ogderes antal og størrelse af granulater stige, som alle er i overensstemmelse med en fi l af lymfokin-aktiverede dræber (LAK) -celler 15.
Aktive MH leukocytter kan ikke udelukkende opnås gennem standard lever leukocyt høstmetoder, der er baseret på slibning og biologisk nedbrydning af vævet. Vores perfusion tilgang beskrevet heri har to store fordele sammenlignet med de standard fremgangsmåder. Først perfusionen tilgang selektivt høster MH leukocytter, forebygge kontaminering af andre leukocytter fra andre lever rum. For det andet perfusion teknik bedre bevarer integriteten, aktiviteten, og den fysiologiske miljø af MH leukocytter, i modsætning til vævsbehandling nærmer sig skader celler eller ændre deres morfologi, og på grund af vævsskade, inducere frigivelse af forskellige faktorer, der markant modulere immun aktivitet.
Leveren er et vigtigt målorgan for cancermetastase and for forskellige infektioner 16. Som MH-celler udviser unikke egenskaber er det vigtigt at studere denne specifik population under forskellige betingelser med hensyn til disse patologier. For eksempel er det værd at bemærke, at systemiske immunaktivering af forskellige BRMs (f.eks poly I: C eller CpG-C) er blevet vist at aktivere MH-leukocytter mere end cirkulerende leukocytter 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Tel-Aviv University.
1. Rotter Protokol
- Forberedelser
- Forbered hepariniseret PBS (30 enheder / ml) opløsning, som skal bruges ved stuetemperatur (RT) ved tilsætning 30 enheder af konserveringsmidler heparin pr ml phosphatbufret saltvand (PBS) 1x opløsning. Beregn 35 ml per dyr.
- Passere hepariniseret PBS gennem den peristaltiske pumpe linjer og sommerfugl nåle for at fjerne luftbobler.
- Sterilisere kirurgiske værktøjer - 2 par saks, stumpe-kantede pincet, 2 hemostats og tand-væv pincet (autoklave ved 121 ° C i mindst 30 min på tør indstilling (tyngdekraft)).
- Perfusion af leveren og Indsamling af MH-leukocytter
- Aflive dyret ved en overdosis af 8% isofluran. Som en sikkerhedsforanstaltning, placere en 50 ml rør indeholdende en isofluran-soaked pad omkring rotte hoved indtil åbne sin brysthulen.
- Åbn de peritoneale og bryst hulrum for at blotlægge leveren og hjerte-lunge-komplekset umiddelbart efter ophør af åndedræt. Undgå blødning gennem denne proces.
- Konkret starte snittet i den lavere abdominale midterlinjen punkt, uden at beskadige indre organer, og fremskridt på begge sider diagonalt mod ribben, skære igennem dem til øvre bryst-hulrum niveauer.
- Inden for ca. en min, indsamle så meget blod som muligt (~ 6 ml fra et 250 g dyr) fra højre hjertekammer i en sprøjte.
- Spænd caudale vena cava med en hæmostat så tæt som muligt til hjertet, for at muliggøre indsamling af perfusatet.
- Træk tarmene og sted uden for dyret til eksperimentatoren ret, at eksponere portåren.
- Indsæt en 25 G IV-kateter, forbundet til en peristaltisk pumpe, i portåren, som caudale som muligt,men rostralt for milten vene.
- Indsæt en 25 G butterfly nål, forbundet til en 5 ml sprøjte, ind i den nedre vena cava, kaudalt for hæmostat.
- Tænd den peristaltiske pumpe ved en hastighed på ca. 3 ml / min og forsigtigt indsamle de første ml perfusat, der er forurenet med blod ind i sprøjten. Fortsæt indtil perfusatet farve er drejninger bleg rød (ca. 3-5 ml). Bemærk, at farven af leveren ændrer retning af lysebrun.
- Uden at standse peristaltisk pumpe, udskift 5 ml høst sprøjte med en 20 ml sprøjte høst og indsamle mindst 20 ml liver perfusat anvender en højere hastighed på perfusion (op til 4 ml / min). Løbende overvåge perfusatet flow ind i indsamling sprøjten, og undgå tomrum, der er for stærk (som kan tilstoppe nålen gennem kollapse vena cava vægge).
- Afslut perfusion når farven af leveren bliver til lysebrun.
- leukocytter Extraction
- Aspirere supernatanten
- Tilsæt 10 ml PBS, centrifugeres ved 400 xg i 10 min, og aspireres supernatanten. Baseret på undersøgelsen mål, bruge præparat som er, eller foretage yderligere oprensninger (f.eks tæthed-gradient separation).
- Specifikt lag 4 ml perfusat over 4 ml densitetsgradient separation masse i en 50 cc polypropylen centrifugerør. Spin rørene ved 754 xg, RT, i 30 min med pause fra.
- Opnå de mononukleære lag på densitetsgradient separation-supernatant grænseflade ved manuel pipettering, vask i PBS, og indsætte i en 5 ml rør.
2. Mouse-protokollen
- Forberedelser
- Forbered hepariniseret PBS (30 enheder / ml) opløsning, som skal bruges ved stuetemperatur (RT) ved tilsætning 30 enheder af konserveringsmidler heparin pr ml phosphatbufret saltvand (PBS) 1x opklaringn. Beregn 20 ml per dyr.
- Passere hepariniseret PBS gennem den peristaltiske pumpe linjer og sommerfugl nåle for at fjerne luftbobler.
- Sterilisere kirurgiske værktøjer - 2 par saks, stumpe-kantede pincet, 2 hemostats og tand-væv pincet (autoklave ved 121 ° C i mindst 30 min på tør indstilling (tyngdekraft)).
- Perfusion af leveren og Indsamling af MH-Leukocytter
- Aflive dyret ved en overdosis af 8% isofluran. Som en sikkerhedsforanstaltning, placere en 15 ml rør indeholdende en isofluran-gennemblødt pad omkring musen hoved indtil åbne sin brysthulen.
- Fastgør lemmer musen til en seng.
- Åbn de peritoneale og bryst hulrum for at blotlægge leveren og hjerte-lunge-komplekset umiddelbart efter ophør af respiration, holder den nedre del af membranen intakt (for at skabe en dræning brysthulen pool). Undgå blødning gennem denne proces.
- Specifikt starte snittet ved den nedreabdominal midterlinjen punkt, uden at beskadige indre organer, og fremskridt på begge sider diagonalt mod ribbenene, skære igennem dem til øvre bryst-hulrum niveauer.
- Tilbagetrækning tarmene og sted uden for dyret til eksperimentatoren ret, at eksponere portåren.
- Indsæt en 30 g nål, forbundet til en peristaltisk pumpe i portåren rostralt for milten vene.
- Skær nedre vena cava over mellemgulvet at muliggøre afvanding og opsamling af perfusatet fra brysthulen.
- Tænd den peristaltiske pumpe ved en hastighed på ca. 3 ml / min og forsigtigt indsamle de første 3 ml perfusat, der er forurenet med blod fra brysthulen pool.
- Kassér denne perfusatet. Gentag sådan vask igen, hvis det er nødvendigt, ved at bruge saltvand, og først derefter begynde at indsamle lever perfusat.
- Re-indlede perfusion ved en hastighed på op til 4 ml / min, og indsamle 10 ml perfusat fra brysthulen under anvendelseen sommerfugl forbundet til en sprøjte.
- Afslut perfusion når farven af leveren bliver til lysebrun.
- leukocytter Extraction
- Centrifuger perfusatet i 10 minutter ved 400 x g.
- Aspirere supernatanten.
- Tilsæt 10 ml PBS, centrifugeres ved 400 xg i 10 min, og aspireres supernatanten Baseret på undersøgelsen mål, bruge forberedelse som den er, eller foretage yderligere oprensninger (f.eks tæthed-gradient separation).
- Specifikt lag hver 4 ml perfusat over 4 ml densitetsgradient separation masse i en 50 cc polypropylen centrifugerør. Spin rørene ved 754 xg, RT, i 30 min med pause fra.
- Opnå de mononukleære lag på densitetsgradient separation-supernatant grænseflade ved manuel pipettering, vask i PBS, og indsætte i en 5 ml rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I F344-rotter sammenlignet vi cytotoksiciteten af MH-NK-celler (opsamlet fra leveren sinuskurver ved tvungen liver perfusion) til cytotoksicitet hele leveren cellepopulationen efter mekanisk formaling af levervæv, og til cytotoksiciteten af cirkulerende leukocytter. Alle cellepræparater blev vasket mindst 3 gange, som rutine i immunologiske assays, og som målcellelinjer vi anvendes allogene YAC-1 eller de syngene MADB106 målcellelinier. Som angivet i figur 1 - 4, hvorimod MH-NK-celler udviste dyb cytotoksicitet mod MADB106 og YAC-1 target cellelinier (~ 80% og op til 100%), både hele leveren cellepopulationen (figur 1) og cirkulerende leukocytter (figur 2 og 3), der vises dybt lavere niveauer af cytotoksicitet og næsten ingen drab mod syngene MADB106 målcellelinie. Den samme relative lavere niveauer af cytotoksicitet var indlysende, når mekanisk forarbejdede lever også undergik vask og densitetsgradient separation (figur 4), niveauer, der er typiske i litteraturen. Således MH-NK-celler udviser enestående høj cytotoksicitet i F344-rotter. FACS-analyse blev gennemført og afslørede dybe forskelle i sammensætningen af følgende celle subpopulationer: monocytter (CD161dim), NK-celler (CD161 lyse), T-celler (CD3), B-celler (CD45), og NKT (CD161 og CD3) celler. Større forskelle i modning profil (CD11b / CD27) var også tydelig mellem de forskellige rum (figur 5).
Figur 1: En sammenligning af cytotoksiciteten af MH-NK-celler, til cytotoksicitet hele leveren cellepopulation (YAC-1 målcellelinie) MH-NK-celler (høstet fra MH-rum throu.gh de heri beskrevne metode) udviste dyb cytotoksisk aktivitet mod YAC-1 target-cellelinjen, mens hele leveren cellepopulationen, høstet ved mekanisk bearbejdning af leveren, viste minimale niveauer (p <0,05). X-aksen repræsenterer effektor-til-mål-celler ratio. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En sammenligning af cytotoksiciteten af MH-NK-celler, til cytotoksicitet af cirkulerende leukocytter (YAC-1 målcellelinie). MH-NK-celler (høstet fra MH-rum gennem de heri beskrevne metode) udstillet dyb cytotoksicitet mod YAC-1 target cellelinje, mens cirkulerende leukocytter viste minimale niveauer af cytotoksicitet(P <0,05). X-aksen repræsenterer effektor-til-mål-celler ratio. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. En sammenligning af cytotoksicitet MH-NK-celler, til cytotoksicitet af cirkulerende leukocytter (MADB106 målcellelinie) MH-NK-celler (høstet fra MH-rum gennem de heri beskrevne metode) udviste dyb cytotoksicitet mod syngene MADB106 målcellelinie, mens cirkulerende leukocytter vist minimale niveauer af cytotoksicitet (p <0,05). X-aksen repræsenterer effektor-til-mål-celler ratio. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Klik her to se en større version af dette tal.
Figur 4: En sammenligning af cytotoksiciteten af MH-NK-celler, til cytotoksicitet hele leveren Lymfocytter, der blev vasket og beriget af densitetsgradient separation (YAC-1 target-cellelinjen) MH-NK-celler (høstet fra MH-. rum gennem de heri beskrevne metode) udviste dyb cytotoksicitet mod YAC-1 target-cellelinjen, mens hele leveren lymfocytter (følgende mekanisk bearbejdning, som blev vasket og beriget af densitet-gradient separation), vises signifikant lavere niveauer af cytotoksicitet (op til 30%) (p <0,05), der er typiske i litteraturen. X-aksen repræsenterer effektor-til-mål-celler ratio. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM. Zoomklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. En sammenligning af mononukleære celle-undergrupper og NK celle-undergrupper Fra cirkulerende mononukleære, MH-mononukleære, og hele leveren mononukleære celler FACS-analyse viser tydelige forskelle i sammensætningen af følgende celle subpopulationer: monocytter (CD161dim), NK-celler (CD161 lyst), T-celler (CD3), B-celler (CD45), og NKT (CD161 og CD3) celler samt forskelle i modning profil (CD11b / CD27) mellem forskellige rum. klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leveren perfusionsmetode præsenteret heri muliggør en selektiv høst og læsning af den unikke population af marginating hepatiske leukocytter. Nedsat NK-celler, også kaldet pit celler 3, udgør en karakteristisk NK-celle population, bor i de hepatiske sinuskurver. De findes i rotter, mus 17 og i mennesker 18,19. Sammenlignet med isolerede perifere NK-celler, pit celler demonstrerede højere cytotoksicitet mod YAC-1 og CC531s målcellelinjer 20, viste sig at have et højere antal mindre cytoplasmatiske granula 20, og en højere ekspression af overfladeantigener, såsom LFA-1 12 . Derudover, i modsætning til isolerede blod NK-celler, kan pit celler lysere NK-resistente P815-celler. Svarende til rotte pit celler, humane hepatiske NK-celler har en højere cytotoksicitet mod NK-sensitive K562 målceller sammenlignet med cirkulerende NK-celler 18,19, og blev vist at lysere NK-resistente målceller 18. overall, da leveren er specifikt og unikt involveret i forskellige sygdomme, immunitet bør undersøges inden dette organ, og celler i MH rum bør skelnes fra parenkymatisk, Kupffer, og stjerneformige celler.
Som uddybet i indledningen, vores perfusion metode er fordelagtig i de fælles mekaniske slibe / biologisk nedbrydning procedurer selektivt høst MH leukocytter, og i bedre bevare integritet, aktiviteten, og den fysiologiske miljø af MH leukocytter. Faktisk vurderer NK cytotoksicitet, MH leukocytter høstet gennem vores tilgang udstillet en markant højere NK cytotoksicitet end leukocytter høstet gennem den mekaniske slibning procedure, trods tilsvarende antal NK-celler.
Den hepatiske perfusion teknik er kun betjenes i dyreforsøg. Men specifikke indsigter opnået fra denne tilgang til markante forskelle mellem immun rum kan spørgsmålstegn ved biologiskeal og kliniske betydning af observationer baseret udelukkende på cirkulerende leukocytter. Dyreforsøg, der måler immune indekser i forskellige immune rum kan foreslå hvilken grad hver immunologisk indeks i kredsløbet afspejler eller korrelerer med dets niveauer i MH rum. En interessant observation vedrører anvendelsen af denne teknik i mus, hvor de perfunderede MH-NK-celler kun vil demonstrere signifikant cytotoksisk aktivitet mod målceller efter en a-priori immunstimulering af dyret 21.
Kun få kritiske aspekter af teknikken skal angives. I både rotter og mus, bør brysthulen åbnes bredt umiddelbart efter fuldstændigt ophør af åndedræt, og med minimal blødning. Hos rotter, anbefales det, at maksimal mængde kardial blod trækkes tilbage, inden perfusion. Hos mus, er det ikke anbefales til udtages blod fra hjertet, da det reducerer blodtrykket i portåren oggør det sværere at indsætte nålen gennem det at fortsætte processen. Denne nåleindføring bør gøres tilstødende men rostralt for milten vene, som man ønsker at sikre, at afstanden fra indsættelse til indgangen af portåren ind i leveren er tilstrækkelig til nålen for at være i en stabil stilling og tillader alle lapper at få perfunderet. Nålen bør indsættes i portåren mens parallelt med dens overflade, så risikoen for brud karvæggen, minimeres. Hos rotter, mens du indsætter en nål til den caudale vena cava til indsamling af perfusatet, er det afgørende at fastholde indgangen punktet så smal som muligt for at undgå en potentiel lækage af perfusat. Hos mus er det vigtigt at precociously skære vena cava inde i brysthulen uden at briste andre blodkar eller lungerne, for at undgå kontaminering unødvendig blod. Den største fordel ved anvendelse af en peristaltisk pumpe er en stabil kontrol over perfusionshastigheden, i og mellemdyr. Det er vigtigt at opretholde en strømningshastighed lav under hele proceduren for at undgå brud på portåren. Som de første milliliter lever perfusat er forurenet med blod, skal de kasseres som vist. For at opnå standardisering mellem dyr, er kriteriet for at begynde at indsamle MH perfusatet baseret på farve overgang fra mørkebrun til lysebrun (snarere end samling af en specifik volumen).
Langs gennemføre proceduren, kan der opstå flere fejl, men de fleste er reversible. Hvis nålen hvorigennem PBS transfunderet ind i leveren glider ud, anbefales det at stoppe peristaltikpumpen, sættetid det omkringliggende område af tarmen (for at opnå bedre synlighed), re-indsætte nålen i en lidt mere rostralt position, og re-starte pumpen.
Leveren perfusion her beskrevne teknik muliggør en selektiv udtagning af MH leukocytpopulationen i en temmelig enkel proces. Givetat denne population viser karakteristiske træk i forhold til leukocytter fra andre immun rum, og kan have biologisk og klinisk betydning for organismen, anbefaler vi brug af denne metode, når muligt, som leukocytter fra andre rum kan afvige profil MH befolkning. Derudover, som denne teknik er ikke gennemførligt i mennesker, vi yderligere foreslå de anvendes i dyr for at præcisere bestemte cirkulerende biomarkører, der korrelerer med de MH egenskaber, især når studerer hepatiske-relaterede processer og sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G.
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
