Abstract
Ondanks de vooruitgang in het begrijpen van het hoofd en de nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) progressie, de vijf-jaarsoverleving blijft laag als gevolg van lokaal recidief en metastasen op afstand. Eén hypothese om dit te verklaren herhaling is de aanwezigheid van kanker-achtige cellen stamcellen (CSC) die inherent chemo- en radio-weerstandsvermogen. Om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is het noodzakelijk experimentele modellen die de effectiviteit van gerichte behandelingen te valideren en derhalve betrouwbare methoden voor de identificatie en isolatie van CSCs hebben. Hiervoor presenteren we een protocol voor de isolatie van CSCs uit humane HNSCC cellijnen die is gebaseerd op de combinatie van twee opeenvolgende cellen sorteringen uitgevoerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). De eerste is gebaseerd op de eigenschap van CSCs tot overexpressie ATP-bindende cassette (ABC) transporter eiwitten en dus uitgesloten, onder andere vitale DNA kleurstoffen zoals Hoechst 33342. De cellen gesorteerd met thmethode wordt aangeduid als een "side population" (SP). Aangezien de SP cellen vormen een klein percentage (<5%) van de ouderlijke cellen, een groeifase is noodzakelijk om het aantal te verhogen voordat de tweede celsortering. Vervolgens maakt de selectie mogelijk van cellen die bezitten twee HNSCC stamcellen kenmerken namelijk hoog expressieniveau van het celoppervlak marker CD44 (CD44 hoog) en de overexpressie van aldehyde dehydrogenase (ALDH hoog). Aangezien het gebruik van een enkele marker talrijke beperkingen en valkuilen voor de isolatie van CSCs de combinatie van SP, zal CD44 en ALDH markers een nuttig instrument CSCs verdere analytische en functionele assays die levensvatbare cellen te isoleren verschaffen. De steel-achtige kenmerken van CSCs werd uiteindelijk bevestigd in vitro door de vorming van tumorispheres en de expressie van β-catenine.
Introduction
Hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) is een veel voorkomende maligniteit wereldwijd en ondanks de vooruitgang in de huidige behandelingen, patiënten met een gevorderde ziekte hebben een slechte prognose. De overall 5 jaars overleving van de patiënt is ongeveer 30%, ondanks de combinatie van therapeutische benaderingen met inbegrip van de operatie, chemo-radiotherapie en doelgerichte therapieën. Recente studies attribuut lokaal recidief en metastasen op afstand voor het overleven van kanker stamcellen-achtige cellen (CSC) na therapieën tegen kanker 1. Er is een groeiend bewijs dat er cellen presenterende eigenschappen stamcellen (ongedifferentieerde status zelfvernieuwing en differentiatie capaciteiten en telomerase-activiteit) in verschillende vaste tumoren zoals borst-, hersenen, prostaat, long, colon, pancreas, lever en huid 2- 10. Echter, de oorsprong van CSCs blijft onduidelijk 11,12. Zij kunnen het gevolg zijn van de kwaadaardige transformatie van normale stamcellen 3,13 of dedifferentiatie van tumorcellen die CSCs-achtige functies 14,15 verwerven. Daarom is het begrijpen van onderscheidende trajecten met betrekking tot CSCs zal inzicht geven in de vroege diagnose en behandeling van resistente HNSCC.
Het is voorgesteld dat CSCs ook resistente fenotypen die standaard chemotherapie en radiotherapie ontwijken, waardoor tumorrecidief bezitten in vergelijking met het grootste deel van tumorcellen 16-19 en zijn gelokaliseerd in hypoxische niches 20. Talrijke factoren zijn voorgesteld om deze resistenties van CSCs, zoals neiging tot rust, versterkt DNA herstel, opwaarts gereguleerd celcyclus controlemechanismen en vrije radicalen 21 uitleggen. Bovendien hebben verschillende oncogene moleculaire pathways kan worden bepaald in CSCs 17 geactiveerd. Om kennis CSCs verdere doelgerichte therapie verbeteren moeten we betrouwbare methoden voor de identificatie en isolatie van CSCs, vanwege de heterogeniteit van stamcellen gerelateerde merkers inverschillende vormen van kanker 22.
In HNSCC, stam-achtige tumor-initiërende cellen zijn geïsoleerd uit primaire tumoren van patiënten door het sorteren cellen die verschillende CSC biomarkers (zoals drugs transporters 23 expressie, CD44 hoog, laag CD133 CD24 hoog, c-Met + fenotype 10,24, 25, of ALDH hoge activiteit 26) of het kweken van de primaire tumor patiënt te squamospheres dat CSC eigenschappen te vormen. Toch is het aantal squamospheres dramatisch af na twee passages, waardoor een kleine steekproef voor verdere karakterisering bestudeert 27. Daarom is in vitro testen uitgaande van gevestigde cellijnen is een eenvoudiger oplossing voor experimenten te ontwerpen met het oog op de kennis van CSCs verbeteren.
Het doel van dit artikel is een werkwijze te CSCs van HNSCC cellijnen te isoleren middels Multiparametrische flowcytometrische analyse een voorstelnd celsortering. De expressie van CD44 gecorreleerd met verschillende eigenschappen, waaronder CSCs ALDH activiteit side population (SP) fenotype, sferoïde vorming vermogen en tumorigeniciteit worden gebruikt voor het isoleren en karakteriseren onderpopulatie CSCs. CD44, een celoppervlak glycoproteïne is betrokken bij celadhesie en migratie. CD44 is sterk uitgedrukt in vele solide tumoren CSCs 28, met inbegrip van hoofd- en halskanker modellen 29-31. Bovendien kan CD44 hoge cellen te genereren in vivo een heterogene tumor terwijl CD44 laag cellen kunnen niet 10. De SP test is gebaseerd op de differentiële potentie van cellen aan de Hoechst kleurstof 22 uitstromen via de ATP-bindende cassette (ABC) transporter familie van eiwitten tot overexpressie in de CSC membraan. Deze test omvat het gebruik van ABC transporter remmers zoals verapamil in controlemonsters. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) is een intracellulair enzym dat betrokken is bij het omzetten van retinol RETinoic zuur tijdens de vroege stamcel differentiatie 25,26. Cellen die hoge ALDH activiteit vertonen stamcellen-achtige cel gedrag in HNSCC 26 en een zeer klein aantal van ALDH hoge cellen vertonen in staat zijn om tumoren te genereren in vivo 26,32.
De combinatie van deze merkers en eigenschappen werd met succes gebruikt door Bertrand e t al. De-resistentie in vitro en in vivo van deze CSCs Photon en koolstof ionenstraling 19. De resultaten toonden duidelijk aan dat de combinatie van verschillende celmerkers en eigenschappen zijn selectiever voor nuttige studies op HNSCC CSC populaties dan één marker benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de plaatselijke richtlijnen voor de verzorging van dieren. Alle details van deze studie werden goedgekeurd door de CECCAPP, een Franse ethische commissie.
1. Selectie van een side population (SP) door de Hoechst Dye Efflux Assay
- Kleuring 50.000.000 cellen met Hoechst 33342 kleurstof.
- Bereid twee 15 ml steriele buizen met een conische bodem: één buis met het label "Hoechst" en één label "Hoechst en Verapamil". Bereid 10 ml van 5 mM Verapamilhydrochloride oplossing in steriel water. Bereid het kweekmedium (CM) voor stamcellen.
- CM CSC (CM-CSC) te bereiden, combineren de volgende: Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM): F12 (1: 3, v: v), 5% foetaal kalfsserum (FCS), 0,04 mg / l hydrocortison , 100 U / ml penicilline, 0,1 g / l streptomycine en 20 ug / l epidermale groeifactor (EGFR).
- Onder een laminaire stroming kap, trypsinize cellen. Verwijder media, wassen met sterile fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg 1 ml trypsine-EDTA (0,5 g / l) gedurende een 75 cm² kolf. Incubeer 3 min bij 37 ° C. Stop de reactie door het toevoegen van kweekmedium gebruikt voor de ouderlijke cellijn. Tel het aantal cellen met een celteller.
- Om CM ouderlijke cellijn (CM-P) bereiden, DMEM met 10% FCS, 0,4 mg / l hydrocortison, 100 U / ml penicilline en 0,1 g / l streptomycine).
- Verdun de celsuspensie verkregen in stap 1.1.2 10 7 cellen / ml in CM-P te verkrijgen. Splitsing van de celsuspensie in de buizen 2 bereid: put 100 pl (10 6 cellen) in de tube "Hoechst en Verapamil" en 4 ml (4 x 10 7 cellen) in de tube "Hoechst".
- In het monster "Hoechst en Verapamil", voeg 10 ul van 5 mM Verapamilhydrochloride oplossing (eindconcentratie: 0,5 mM) en meng voorzichtig. Voeg 5 ul van 1 g / l Hoechst-oplossing (eindconcentratie: 0,1 g / l). In het monster # &34; Hoechst ", voeg 5 ul van 1 g / l Hoechst oplossing per 10 6 cellen (200 pi totaal) voortaan houden samples beschermd tegen directe blootstelling aan licht met behulp van aluminiumfolie..
- Incubeer alle buizen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur 30 min. Meng voorzichtig om de 15 min om cellen te voorkomen vestigen.
- Centrifugebuizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer elke pellet met 2 ml 1x PBS.
- Centrifugebuizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant. Resuspendeer "Hoechst en Verapamil" pellet in 500 ui 5 mg / L propidium jodide (PI) verdund in PBS-buffer en "Hoechst" pellet in 4 ml van 5 mg / l PI verdund in PBS-buffer.
- Transfer sample oplossingen door een 70 um cel zeef om aggregaten cytometer te verwijderen en het verzamelen van enkele cellen in buizen voor sample opname op de stroom. Houd de monsters op ijs en te beschermen tegen de directe blootstelling aan licht met behulp van aluminiumfolie.
- Bereid twee 15 ml steriele buizen met een conische bodem: één buis met het label "Hoechst" en één label "Hoechst en Verapamil". Bereid 10 ml van 5 mM Verapamilhydrochloride oplossing in steriel water. Bereid het kweekmedium (CM) voor stamcellen.
- ikvertroosting van de Side Bevolking Exclusief Hoechst kleurstof door Cell Sorting.
- Voer Hoechst negatieve celscheiding op een flowcytometrie sorter met de volgende parameters: UV laser (355 nm), 2 detectors op de UV laser pad met blauwe Hoechst (BP 450/50) en rode Hoechst (BP 610/20) filters, en 2 verzamelaars.
- Ten eerste analysemonster "Hoechst" die dient als een positieve controle voor kleuring en flow cytometer opstelling.
- Met behulp van de cytometer software, op het raam "Global werkblad", klik op "Dot Plot" (vijfde boven foto rechts) en maak een grafiek op de mondiale werkblad. Op coördineren, met een klik met de rechtermuisknop, selecteer FSC-A (forward scatter) en abscis, SSC-A (zijwaartse verstrooiing) (Figuur 1A). Op dezelfde manier, het creëren van een SSC-W versus SCC-H dot plot. Op deze tweede dot plot, een P1 regio te creëren, klikt u op 'Polygon gate "(veertiende boven foto rechts) (Figuur 1B) 33.
Opmerking: De regio P1omvatten enkele cellen en discrimineren doubletten. - Optioneel: Uitsluiten PI positieve cellen door het creëren van een FSC-A versus PI gated op P1. Op deze puntdiagram selecteert u de PI negatieve populatie (P2) naar PI positieve dode cellen te sluiten.
- Met behulp van de cytometer software, op het raam "Global werkblad", klik op "Dot Plot" en maak een grafiek op de mondiale werkblad. Op coördineren, met een klik met de rechtermuisknop, selecteer blue Hoechst-A en X-as, rode Hoechst-A. Met een klik met de rechtermuisknop op de bevolking, selecteer "Show bevolking" en P1. Op deze puntendiagram Maak een gebied (P2) aan de negatieve Hoechst kleurstof side population (SP) cellen die verschijnt als een zijarm aan de linkerkant van de populatie van cellen (figuur 1C) te selecteren.
- Analyseer het monster "Hoechst" en het verzamelen van 10.000 gebeurtenissen. Opdat de poort P2, waarbij de SP bevolking vertegenwoordigt, goed gepositioneerd, analyseren monster "Hoechst en Verapamil" (10.000 events)het verdwijnen van SP populatie (figuur 1D) waarnemen.
- Verzamel de SP Hoechst kleurstof negatieve cellen in een 15 ml buis met 1 ml CM-CSC bereid 1.1.1.1.
- Aan het einde van de celsortering Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 ml CM-CSC. Tel het aantal cellen gesorteerd onder toepassing van een celteller passend aantal cellen dragen aan een kweekfles (zie tabel 1). Add CM-CSC en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 atmosfeer.
- Handhaven in kweek onder dezelfde omstandigheden maximaal 2 passages tot er een minimum van 5 x 10 7 cellen (zie stap 3, "Cell kweekmethode").
- Voer Hoechst negatieve celscheiding op een flowcytometrie sorter met de volgende parameters: UV laser (355 nm), 2 detectors op de UV laser pad met blauwe Hoechst (BP 450/50) en rode Hoechst (BP 610/20) filters, en 2 verzamelaars.
2. Selectie van de CD44 hoog / ALDH hoge Sub-bevolking in de side population Gesorteerd
- Kleuring 50 miljoen van de SP Cellen met de ALDH Detection Kit en CD44 Antibody.
- Bereid zeven 15 ml steriele buizen moeten als volgt: "Ongekleurde" (tube), "CD44-APC" (Tube b), "IgG1-APC" (buis c), "ALDH" (Tube d), "ALDH en DEAB "(Tube e)" ALDH en CD44-APC "(Tube f)" ALDH, DEAB en CD44-APC "(Tube g). Houd alle buizen en reagens bij 4 ° C gedurende de kleuring.
- Bereid buffer A met 4,5 ml van de buffer 1 (in de kit) en 45 gl van CD44-APC (allofycocyanine) antilichaam (verdunning 1: 100). Bereid buffer B met 100 ui buffer 1 en 1 pl IgG1-APC antilichamen (verdunning 1: 100). Bereid buffer C met 4 ml buffer 1 en 20 ui van het reagens van de kit.
- Bereid een celsuspensie van de eerder gesorteerde cellen (stap 1.2.5) en 10 7 cellen / ml. Voeg 100 ul (10 6 cellen) van de celsuspensie a, b en c, en 4 ml (4 x 10 7 cellen) aan de buis f buizen. Op dit moment niet cellen zetten in buizen d, e en g.
- Centrifugeer de buisjes die de cellen bij 250 g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellets in buizen a, b en c in 100 pl buffer 1. Voeg 5 ui diethylaminobenzaldehyde (DEAB), een ALDH inhibitor buizen e en g.
- Resuspendeer cellen in buis f met 4 ml reagens C en onmiddellijk over 100 ul in buizen d, e en g. Incubeer alle buizen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 30 min en beschermen tegen direct licht blootstelling door aluminiumfolie. Meng de celsuspensie voorzichtig door vortexen na 15 min te voorkomen cellen bezinken.
- Vanaf dit moment, houden de buizen op ijs en beschermd tegen directe blootstelling aan licht met behulp van aluminiumfolie. Centrifugeer alle buizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer buis f in 4 ml en pijpen b en g met 100 ui buffer A. resuspendeer buis C met 100 gl buffer B. Om de andere buisjes, voeg 100 pl buffer 1. Incubeer 10 min bij 4 °; C.
- Centrifugeer alle buizen bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. Spoel eenmaal met 1 ml buffer 1 (4 ml van buizen f) en gecentrifugeerd opnieuw bij 250 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. Resuspendeer buis f pellet in 4 ml en alle andere buizen in 1 ml buffer 1.
- Breng het monster oplossingen door middel van 70 micrometer cel zeven aggregaten cytometer te verwijderen en het verzamelen van enkele cellen in geschikte buizen voor sample opname op flow.
- Isolatie van de CD44 hoog / ALDH hoge Cell Bevolking naar fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting.
- Voer CD44 hoog / ALDH hoge celsortering op flowcytometrie sorter met de volgende parameters: De blauwe laser (488 nm) en rode laser (633 nm), 1 detector op de blauwe laser pad met een FITC filter (530/30), 1 detector op de rode laser pad met een APC filter (660/20) en 2 verzamelaars.
- Met behulp van de cytometer software, klik op "Dot Plot '(de vijfde bovenste foto rechts) naar een FSC-A versus SSC-A dot plot te creëren zoals beschreven in paragraaf 1.2.1.2, naar cel morfologie te controleren en selecteer een populatie bestaat uit enkele cellen met een SSC-W versus SSC-H dot plot.
- Met behulp van de cytometer software, op het raam "Global werkblad", klik op "Dot Plot" en maak een grafiek op de mondiale werkblad. Op coördineren, met een klik met de rechtermuisknop, selecteer APC-A en X-as, FITC-A om de dubbele gebrandschilderde bevolking te selecteren. Een poort gebruikmakend van buizen d en e ALDH hoog cellen (Figuur 2A) selecteren. Opmerking: Positieve cellen verdwijnen buis e behandeld met DEAB (figuur 2B).
- Op dezelfde chart, het creëren van een tweede poort met behulp van buizen b en c om CD44 hoge cellen (figuur 2C en 2D) te selecteren. Positieve cellen verdwijnen in de buis met IgG1-APC. Analyseer tubes f en g en een derde poort die CD44 high / ALDH <omvatsup> hoog cellen (figuur 2E en 2F).
Opmerking: Als positieve cellen aanwezig in de buis met IgG1-APC (figuur 2D) zijn, de interactie tussen cellen en APC-gekleurde antilichaam niet specifiek.
- Op dezelfde chart, het creëren van een tweede poort met behulp van buizen b en c om CD44 hoge cellen (figuur 2C en 2D) te selecteren. Positieve cellen verdwijnen in de buis met IgG1-APC. Analyseer tubes f en g en een derde poort die CD44 high / ALDH <omvatsup> hoog cellen (figuur 2E en 2F).
- Verzamel CD44 hoog / ALDH hoge cellen in een 15 ml buis met 1 ml CM-CSC. Verzamel ook CD44 low / ALDH laag in een 15 ml buis met 1 ml van CM 19. Let op: Bereid CM-CSC, zoals beschreven in stap 1.1.1.1.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 250 xg gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet met 1 ml CM-CSC. Tel het aantal cellen gesorteerd.
3. Cel Cultuur Methode
- Na de dubbele sorteren van cellen zoals hierboven beschreven, plaat gesorteerde cellen in een geschikte kolf (tabel 1) met CM-CSC bij 37 ° C met 5% CO2. Na 18-24 uur,controleren of de cellen hebben gehandeld en verander het kweekmedium. Verander het kweekmedium om de 3 dagen tot de groeiende kolonies groter dan 50% confluent.
- Met de juiste hoeveelheid trypsine 0,5 g / L - EDTA (tabel 1) om cellen trypsinize van de kolf. Incubeer cellen 3-5 minuten bij 37 ° C. Voeg de juiste hoeveelheid CM-CSC (tabel 1) de werking van trypsine te stoppen.
- Tel het aantal cellen verkregen en plaat 4 x 10 5 cellen in een 175 cm² kolf met CM-CSC. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2. Bij deze concentratie wordt cellen met een verdubbelingstijd van 24 uur 70% confluent in 7 dagen.
- Gebruik CSCs in vitro of in vivo experimenten voordat ze 3 passages ondergaan.
4. Bevestiging van de Tumor Potentiële en CSC Kenmerken
- Tumor Sphere Vorming aan de tumor potentieel van de CD44 hoog / ALDH Bevestigenhoog Cells.
- Trypsinize cellen zoals beschreven in 3.2. Voeg 1 x 10 6 cellen om een 15 ml buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in een DMEM: F12 (3: 1) medium FCS vrij, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparine en 1 x B27. Incubeer cellen in een 6 goed laag verankering platen kolf bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Gebruik DMEM: F12 (3: 1) medium dat 5% FCS, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparine en 1 x B27 als cellen niet groeien zonder FCS. - Neem de tumorvorming bol met een optische microscoop van 4 tot 10 dagen na zaaien (Figuur 3A).
Opmerking: Tumor boldiameter moet meer zijn dan 35 urn. CD44 high / ALDH hoge cellen zal een snellere en meer uitgebreide tumor bol formatie in termen van het aantal en de omvang ten opzichte van CD44 low / ALDH lage tonen.
- Trypsinize cellen zoals beschreven in 3.2. Voeg 1 x 10 6 cellen om een 15 ml buis en centrifugeer bij 250 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in een DMEM: F12 (3: 1) medium FCS vrij, 20 ng / ml rhEGF, 4 mg / l heparine en 1 x B27. Incubeer cellen in een 6 goed laag verankering platen kolf bij 37 ° C en 5% CO2.
- Evaluatie van de In Vivo tumorigeniciteit NaSubcutane injectie van CD44 hoog / ALDH hoge Cellen in NOD-SCID muizen.
- Na het sorteren resuspendeer cellen in PBS bij drie verschillende concentraties (10 4 cellen / ml, 10 5 cellen / ml, en 10 6 cellen / ml). Injecteer subcutaan 100 gl 10 4 cellen / ml (10 3 cellen) in de rechter flank regio 6 muizen. Doe hetzelfde voor 10 5 cellen / ml (10 4 cellen), en 10 6 cellen / ml (10 5 cellen).
Opmerking: Lager dan 10 verdunning 3 cellen kunnen worden getest. - Injecteren dezelfde concentratie van CD44 low / ALDH laag cellen in de linker flank regio. Monitor geïnjecteerde muizen gedurende maximaal 10 weken tot tumorprogressie 19 zien.
- Na het sorteren resuspendeer cellen in PBS bij drie verschillende concentraties (10 4 cellen / ml, 10 5 cellen / ml, en 10 6 cellen / ml). Injecteer subcutaan 100 gl 10 4 cellen / ml (10 3 cellen) in de rechter flank regio 6 muizen. Doe hetzelfde voor 10 5 cellen / ml (10 4 cellen), en 10 6 cellen / ml (10 5 cellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De isolatie van CSCs van HNSCC cellijnen vereist twee opeenvolgende sortering vanwege het lage percentage CSCs in de ouderlijke cellijn. De eerste sortering is gebaseerd op het vermogen van CSCs de Hoechst kleurstof door middel transporters sluiten. Dit resulteerde in de verwerving van 1-5% van de totale celpopulatie gesorteerd (figuur 1). Tijdens de Hoechst kleurstof negatieve cel sortering, controleer dan de grootte en de granulatie van gesorteerde cellen door te kijken naar het FSC-A versus SSC-A puntdiagram (Figuur 1A). Dan, discrimineren doubletten en cellen fragmenten met behulp van de SSC-W versus SSC-H dot plot en het selecteren van de bevolking P1 (Figuur 1B). Op deze P1 bevolking, het creëren van een Hoechst Red-A versus Hoechst Blue-A dot plot. Met de buis met het label "Hoechst", wordt de SP als een zijarm aan de linkerkant van de belangrijkste populatie cellen (Figuur 1C). Deze populatie moet verdwijnen wanneer ze are behandeld met Verapamil (figuur 1D), een remmer van ABC transporters. De PI-kleuring laat de uitsluiting van PI-positieve dode cellen, omdat deze populatie onder-schaal op de Hoechst Red-A-schaal (figuur 1C en 1D, blauwe ellipsen).
De tweede celsortering werd gebaseerd op hoge expressie van de CD44 receptor en hoge ALDH enzymactiviteit die de verwerving van 0,5-2% van de SP cellen vooraf gesorteerd (figuur 2) toegestaan. Vóór het sorteren werden diverse controles gebruikt. De eerste daarvan zijn de "ALDH" en de "ALDH + DEAB" buizen nodig om de eerste poort te plaatsen op FITC hoog cellen (Figuren 2A en 2B): ALDH hoge cellen werden gated op de FITC-A versus APC-A dot plot met behulp van de "ALDH" tube (Figuur 2A). De goede positie van de poort werd gecontroleerd met behulp van de "ALDH + DEAB "tube:.. Als DEAB remt ALDH, moet positieve cellen verdwijnen uit de poort (Figuur 2B) Als ze dat niet doen, verandert de reactie omstandigheden (door het verhogen van de hoeveelheid DEAB bijvoorbeeld) De tweede controle is de" CD44-APC "en" IgG1-APC "buizen waardoor de tweede poort aan APC hoog cellen (figuren 2C en 2D) met de cellen gekleurd met CD44-APC antilichamen (Figuur 2C) zetten. Deze populatie moet verdwijnen de controlebuis die IgG1-APC cellen (Figuur 2D) bevatte. Zo niet, de band met het antilichaam is niet specifiek en BSA 0,5% worden toegevoegd in buffer 1 van ALDH detectiekit tijdens de antilichaamreactie. het derde controle heeft betrekking op de "ALDH en CD44-APC" tube en "ALDH, DEAB en CD44-APC" buizen (figuren 2E, 2F, 2G en 2H). de dubbele staining ALDH / CD44 buis wordt gebruikt om de laatste poort te positioneren op de dubbele positieve cellen (figuur 2E) en dezelfde buis behandeld met DEAB is een controle om na te gaan of ALDH hoge cellen verdwijnen (figuur 2F).
Dit protocol wordt gebruikt om CSCs van SQ20B en FaDu cellijnen sorteren. Bij het sorteren voor de eerste keer wordt uitgevoerd op een nieuwe cellijn, teneinde te waarborgen dat gesorteerde cellen stamcellen-achtige cellen eigenschappen, is het noodzakelijk om hun tumor potentieel bevestigen. Een van de steel-achtige cellen eigenschap is de mogelijkheid om tumorspheres in vitro vormen in een FSC medium. Onder deze voorwaarde, kan alleen kanker stamcellen-achtige cellen overleven en vermenigvuldigen (figuur 3A). Bovendien qPCR experimenten tonen een hoge expressie van β-catenine (marker van steelachtige kenmerk) in CD44 hoog / ALDH hoog cellen (Figuur 3B), en BMI 1 en Notch 19 </ Sup>. Tot slot, CD44 hoog / ALDH hoge cellen zijn ook in staat om tumoren te vormen wanneer geïnjecteerd in kleine hoeveelheden ten opzichte van CD44 low / ALDH laag cellen 19.
Figuur 1: Isolatie van een side population exclusief de Hoechst kleurstof (A) FSC-A versus SSC-A puntdiagram.. (B) SSC-W versus SSC-H dot plot. (C, D) Hoechst Rood-A versus Hoechst Blue-A puntdiagram met behulp van de "Hoechst" tube (C) of met de "Hoechst en Verapamil" buis (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: So rting van CD44 hoog / ALDH hoge cellen van Hoechst kleurstof negatieve cellen. FITC-A versus APC-A puntdiagram met behulp van de "ALDH" buis (A), de "ALDH + DEAB" buis (B), de "CD44-APC" buis (C), de "IgG1-APC" tube (D), de "ALDH en CD44-APC" (E en G) of "ALDH, DEAB en CD44-APC" tube (F en H). Figuren A, B, C, D, E en F werden verkregen met SQ20B cellijn. Figuren G en H verkregen met behulp van FaDu cellijn. Groen geeft CD44 low / ALDH laag cellen (Q3); donker blauw geeft CD44 laag / hoog ALDH cellen (Q1); paars geeft CD44 hoog / ALDH laag cellen (Q4); lichtblauw geeft aan CD44 hoog / ALDH hoge cellen (Q2)._upload / 53958 / 53958fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Bevestiging tumor potentieel van CD44 hoog / ALDH hoge gesorteerde cellen CD44 hoog / ALDH hoge cellen kunnen vormen tumorspheres in vitro (A) in een slechte FCS media. Schaal bar, 25 pm. Bovendien, CD44 hoog / ALDH hoge vertonen een overexpressie van β-catenine, een marker van tumorigeniciteit (B). Deze kwantificering is uitgevoerd door qPCR and error bars vertegenwoordigen SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Aantal cellennaargelang | Kolf soort | Trypsine Volume (ml) | Culture Medium Volume (ml) |
| 10,000-200,000 | 1 putje van een 6-well plaat of een 3,5 cm petrischaal | 0.5 | 2 |
| 200,000-1,000,000 | 1 T25 kolf | 1 | 4 |
| > 1000000 | 1 T75 kolf | 2 | 10 |
Tabel 1: kolf soort te gebruiken volgens het aantal cellen gesorteerd Details van de kweekfles maat voor geschatte aantal cellen gesorteerd gegeven.. De hoeveelheid trypsine en volume medium vereist voor de kweekfles type zijn ook aanwezig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een betrouwbare werkwijze voor de succesvolle isolatie van CSCs van een bepaalde cellijn die voor andere HNSCC cellijnen. Geïsoleerde hoofd en nek CSCs zijn dan geschikt voor verdere moleculaire karakterisering in vitro en functionele validatie door transplantatie in immunodeficiënte muizen 19. Toch kunnen enkele wijzigingen worden getest, afhankelijk van de kant bevolking of het CD44 hoog / ALDH hoge percentages in de ouderlijke cellijn. Bijvoorbeeld, indien het percentage van cellen in de zijkant populatie te laag in een bepaalde cellijn, de CD44 hoge / ALDH hoge sortering direct worden uitgevoerd. De merkers die in deze studie kan worden vervangen door andere geschikte merkers voor de cellijn bestudeerd zoals CD133 hoog 34 of CD10 hoge 35.
Dit protocol is gebaseerd op twee mobiele sorteringen. Drie kleuren sorteren met SP + CD44 + ALDH was niet mogele de geteste cellijnen. Ten eerste, de oudercellijnen hier getest onderhavige minder dan 5% van de SP en minder dan 10% CD44 high / ALDH hoog cellen in de SP. Daarom SP / CD44 hoog / ALDH hoge vertegenwoordigen minder dan 0,5% van de ouderlijke cellijn. Vandaar dat een eerste sortering SP is nodig om de populatie te verrijken in CD44 hoog en / of hoge ALDH cellen. Ten tweede, sorteren 1% van de parentale cellijn, duurt 5 uur tot ongeveer 300.000 cellen te verkrijgen. Daarom, als een 3 kleuren celsortering wordt uitgevoerd, de hoeveelheid verzamelde cellen zal zeer laag zijn. Verder langer sorteren wordt afgeraden omdat dit cellevensvatbaarheid beïnvloeden.
Door de selectiviteit van deze isolatieprotocol, de belangrijkste beperking is het kleine aantal CSCs verkregen. Dit kan problematisch verdere experimenten uit te voeren, aangezien het niet wordt aanbevolen om te gebruiken na 3 passages door de snelle verlies van CD44 en ALDH markers. Bovendien voorafgaand aan elk experiment werd het percentage CD44 hoog / ALDH hoge cellen nog in de celsuspensie worden onderworpen om het aantal CSCs die gedifferentieerd controleren.
Het is noodzakelijk om Verapamil hydrochloride oplossing en kweekmedium dat EGF juist voor gebruik als deze moleculen zeer onstabiel te bereiden. Een voorraadoplossing van EGF bij 20 mg / l is ongeveer drie maanden bij -20 ° C. Variaties van het protocol Hoechst bestaan, maar de uiteindelijke concentratie kleurstof gebruikte is 5 ug / ml. Bovendien wordt tijdens de eerste sortering, verschillende kweekmedia samenstellingen moet worden getest volgens de gebruikte cellijn. Zodra de sorteervoorwaarden gevalideerd, is het noodzakelijk om de eigenschappen van de gesorteerde celpopulatie met de verschillende methoden (hoofdstuk 4) controleren.
Celoppervlaktemerkers, ALDH activiteit en de mogelijkheid om vitale kleurstoffen uitstromen zijn reeds individually in de literatuur CSCs isoleren van HNSCC. De hier beschreven protocol heeft het unieke voordeel van het gebruik van combinaties van merkers om een hoge specificiteit in CSCs los van HNSCC cellijnen bereiken. Bovendien is de CD44 sortering kan worden gerealiseerd met een antilichaam tegen CD44 geconjugeerd met magnetische microkorrels en gesorteerd met een magnetische kolom 36, maar deze methode is alleen toepasbaar op celoppervlak markers en kan niet worden gebruikt voor ALDH sortering, door dubbele sorteren . Een andere methode gebruikt om CSC te verkrijgen is het tumorsphere cultuur van primaire tumoren 37 of 38 xenotransplantaten. Echter, de aankoop van deze primaire tumoren of xenotransplantaten worden geassocieerd met ethische beperkingen.
Aangezien deze methode isoleert levensvatbaar HNSCC CSCs, kunnen ze worden gebruikt (na controle hun tumorvorming) in een aantal experimenten die de fysiologische functie van deze cellen te meten. Daarom staat het beoordelen van het gedragvan CSCs volgende verschillende therapeutische benaderingen (radiotherapie, chemotherapie). Ook kan de studie van de verschillende biologische parameters zoals migratie / invasie, DNA-reparatie, cell signaling, etc. Vandaar verkrijgen CSCs uit verschillende cellijnen een aantrekkelijke keuze voor het onderzoeken CSCs eigenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
| EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
| Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
| ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
| CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
| IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
| Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
| Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
| SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | - | |
| FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
| Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
| BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | - |
References
- Baumann, M., Krause, M., Hill, R. Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer. 8 (7), 545-554 (2008).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65 (23), 10946-10951 (2005).
- Eramo, A., et al. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15 (3), 504-514 (2008).
- Dalerba, P., et al. Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (24), 10158-10163 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90 cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13 (2), 153-166 (2008).
- Fang, D., et al. A tumorigenic subpopulation with stem cell properties in melanomas. Cancer Res. 65 (20), 9328-9337 (2005).
- Prince, M. E., et al. Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (3), 973-978 (2007).
- Clarke, M. F., et al. Cancer stem cells -- Perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells. Cancer Res. 66 (19), 9339-9344 (2006).
- Soltanian, S., Matin, M. M. Cancer stem cells and cancer therapy. Tumor Biol. 32 (3), 425-440 (2011).
- Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
- Vermeulen, L., et al. Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).
- Ratajczak, M. Z. Cancer stem cells -- Normal stem cells 'Jedi' that went over to the 'dark side.'. Folia Histochem Cytobiol. 43 (4), 175-181 (2005).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Liu, G., et al. Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem cells in glioblastoma. Mol Cancer. 5, 67 (2006).
- Moncharmont, C., et al. Targeting a cornerstone of radiation resistance: Cancer stem cell. Cancer Lett. 322 (2), 139-147 (2012).
- Bertrand, G., et al. Targeting Head and Neck Cancer Stem Cells to Overcome Resistance to Photon and Carbon Ion Radiation. Stem Cell Rev. 10 (1), 114-126 (2013).
- Das, B., Tsuchida, R., Malkin, D., Koren, G., Baruchel, S., Yeger, H. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem Cells. 26 (7), 1818-1830 (2008).
- Diehn, M., et al. Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells. Nature. 458 (7239), 780-783 (2009).
- Chen, Z. G. The cancer stem cell concept in progression of head and neck cancer. J Oncol. 2009, 894064 (2009).
- Zhang, P., Zhang, Y., Mao, L., Zhang, Z., Chen, W. Side population in oral squamous cell carcinoma possesses tumor stem cell phenotypes. Cancer Lett. 277 (2), 227-234 (2009).
- Zhang, Q., et al. A subpopulation of CD133(+) cancer stem-like cells characterized in human oral squamous cell carcinoma confer resistance to chemotherapy. Cancer Lett. 289 (2), 151-160 (2010).
- Sun, S., Wang, Z. Head neck squamous cell carcinoma c-Met⁺ cells display cancer stem cell properties and are responsible for cisplatin-resistance and metastasis. Int J Cancer. 129 (10), 2337-2348 (2011).
- Chen, Y. C., et al. Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer. Biochem Biophys Res Commun. 385 (3), 307-313 (2009).
- Lim, Y. C., et al. Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas. Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).
- Yu, Q., Stamenkovic, I. Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis. Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).
- Krishnamurthy, S., et al. Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells. Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).
- Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).
- Chen, Y. W., et al. Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells. Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).
- Clay, M. R., et al. Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase. Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).
- Meinelt, E., et al. Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , BD Biosciences. (2012).
- Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line. Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).
- Fukusumi, T., et al. CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).
- Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer. Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).
- Kanojia, D., et al. Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice. Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).
- Higgins, D. M., et al. Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts. Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).
