Summary
Este protocolo describe un método para la transfección eficiente siRNA en recién aisladas citotrofoblastos vellosos humanos usando formación de microporos y la identificación de complejos de ADN-proteína en estas células. Las células transfectadas pueden ser monitoreados por Western blot y análisis EMSA durante el tiempo de cultivo de 4 días.
Protocol
El comité de ética de la UQAM ha aprobado estos protocolos, que están en conformidad con las directrices del Comité de Ética del Hospital de St-Luc del Centro Hospitalario Universitario de Montreal (Montreal, Canadá). Los participantes firmaron un consentimiento informado.
1. Medio Preparación y aislamiento de citotrofoblastos primarios vellosos
- Preparar medio de cultivo para citotrofoblastos vellosos primarios humanos complementando medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) con HEPES 25 mM, 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Se filtra el medio preparado a través de filtro de 0,22 micras estéril y guardar en un congelador a -20ºC en alícuotas de 50 ml.
- Aislar citrofoblastos vellosidades primarias de placentas frescas siguientes protocolos estándar 3.
- Con unas pinzas, retirar la membrana fetal del tejido mediante rascado con cuidado si fuera poco, con cuidado de no remover el tejido de las vellosidades. Corta elrestante vellosidades placentarias en cubos de aproximadamente 3 x 3 cm utilizando escalpelo y tijeras. Es necesario lavar con agua que contiene 0,9% de NaCl para eliminar la sangre materna.
- La celebración de cada cubo con pinzas, retirar con cuidado el tejido de las vellosidades del resto de los vasos y tejidos fibrosos con unas tijeras.
- De 15 a 30 mg de tejido de las vellosidades, digerir cuatro veces en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) que contiene tripsina (de 9,6 x 10 5 a 1,8 x 10 6 U; concentración final 1,2 mg / ml) y desoxirribonucleasa I (ADNasa I) ( concentración final 200 g / ml) durante 30 min a 37 ° C en un baño de agua con agitación continua.
Nota: Use 150 ml de volumen total para la primera digestión, 100 ml para la segunda digestión y 75 ml para los dos restantes digestiones.
- Recoger el sobrenadante que contiene células dispersas y centrifugar a 1250 xg durante 15 min sin freno. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender las células en 1 ml de DMEM precalentado que contiene1% de penicilina / estreptomicina.
- La capa de células dispersas en la parte superior de un discontinua 5% - 70% de gradiente de sílice recubiertas de polivinilpirrolidona (véase la Tabla 1 para la preparación de gradiente) y se centrifuga durante 23 min a 507 xg y sin freno. Eliminar la capa de densidad entre 1,017 a 1,033 por aspiración y recoger las capas entre 40% y 50% en el gradiente con una nueva pipeta. Lavar las células extensamente con 10 ml de DMEM precalentado que contienen 1% de penicilina / estreptomicina.
Nota: La fracción recogida se corresponde con densidades de entre 1.048 y 1.062, que alberga los trofoblastos. - Contar las células utilizando un hemocitómetro. Brevemente, las células mezclar y añadir 10 l en un nuevo tubo de centrífuga. Añadir 10 l de azul de tripano y mezclar suavemente de nuevo. Elaborar la suspensión de células y llenar las cámaras de hemocitómetro. Contar las células bajo el objetivo de 10X.
- Colocar 1 x 10 6 y 4,5 x 10 6 células en tubos separados para su uso en las secciones 1.3 y 2, respectivaLy. Sembrar las células restantes a una densidad de 1,5 x 10 6 células / pocillo en medio DMEM suplementado y la cultura a 37 ° C y 5% de CO2 durante un máximo de 4 días para otros experimentos.
- Con unas pinzas, retirar la membrana fetal del tejido mediante rascado con cuidado si fuera poco, con cuidado de no remover el tejido de las vellosidades. Corta elrestante vellosidades placentarias en cubos de aproximadamente 3 x 3 cm utilizando escalpelo y tijeras. Es necesario lavar con agua que contiene 0,9% de NaCl para eliminar la sangre materna.
- Evaluación de la pureza de aislados primarios citotrofoblastos vellosos
- Tirada 1 x 10 6 de los citotrofoblastos aislados recientemente en tubos de microcentrífuga a 300 x g. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato precalentado (PBS). centrifugar las células a 300 xg y eliminar PBS mediante aspiración.
- Añadir 1 ml de metanol frío a las células y se incuba a -20 ° C durante 20 min. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min y eliminar el metanol por aspiración.
Precaución: Use máscara bote, gafas de seguridad y guantes de goma durante la manipulación de metanol. - Añadir 1 ml de PBS a temperatura ambiente para rehidratar las células, se centrifuga a 300 xg y eliminar PBS por aspiración.
- Se incuban las células en PBS que contenía FBS (1:50 [v / v] de dilución) y un FcRreactivo de bloqueo (1:10) durante 45 min a temperatura ambiente para eliminar la unión no específica.
- Lavar dos veces con 500 l de temperatura ambiente PBS, centrifugar las células a 300 xg durante 5 min y retirar PBS por aspiración. Resuspender las células en 100 l de PBS temperatura ambiente.
- Se incuban las células con un isotiocianato de fluoresceína monoclonal de ratón (FITC) conjugado con LP5K anti-humano clon citoqueratina-7 de anticuerpos (1: 200) o un anticuerpo emparejado de isotipo de control no específico en PBS que contenía 0,2% de BSA durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Lavar las células en PBS.
- Analizar las células mediante citometría de flujo 3. Utilice preparaciones de células, que demuestran un mínimo de 96% de células CK-7-positivos por citometría de flujo para experimentos adicionales.
2. La transfección de siRNA primarios humanos vellosos citotrofoblastos
- La transfección de las vellosidades primarias citotrofoblastos humanas usando un dispositivo de formación de microporos
- Preparar placas de 6 pocillos que contienen2 ml de medio DMEM complementado para la incubación de células microporos.
- Después del aislamiento de citotrofoblastos primarios (ver sección 1.2), tomar una alícuota de células en suspensión y determinar el número de células utilizando un hemocitómetro.
- Transferir 1,5 x 10 6 células a un tubo de microcentrífuga y las células de pellets por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Lavar las células con 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2 +, Ca 2 + libre) y sedimentar las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células suavemente en 100 l de tampón de resuspensión.
Nota: No mantener la suspensión de células durante más de 15 a 30 min a temperatura ambiente, para maximizar la viabilidad de las células y la eficiencia de la transfección. - Añadir 300 ng de sincitina-2 siRNA (o revueltos de control-siRNA) en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y aspirar la mezcla de células utilizando un ARNsi 100 l transfección pipeta. Insertarla pipeta en la estación (ver Lista de Materiales) y someter las células a un solo pulso de 1300 V de 30 mseg.
- Inmediatamente transferir las células a placas de 6 pocillos (preparados en la etapa 2.1.1) que contienen medio suplementado 37 ° C pre-calentado para evitar el daño celular.
- Repita los pasos 2.1.5 y 2.1.6 para las muestras restantes.
- Agite suavemente la placa durante 30 segundos para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar la placa a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado durante 24 a 48 h. Refrescar medio de cultivo 24 horas después de la transfección.
- Evaluar la eficiencia de la transfección mediante análisis de transferencia Western (consulte los pasos 3 a 6).
- Lipofección de siRNA en citotrofoblastos humanas primarias
- Después del aislamiento de citotrofoblastos vellosos, sembrar las células a una densidad de 1,5 x 10 6 células por pocillo en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de cultivo y se incuba durante 18 horas.
- Diluir 300 ng de sincitina-2-siRNA (o revueltos controlsiRNA) y 5 l de reactivo de transfección basado en lípidos en distintos tubos de 1,5 ml en un volumen total de 10 l de medio antibiótico y libre de suero. Incubar durante 5 min.
- Mezcle los reactivos diluidos y se incuba durante 20 min adicionales a temperatura ambiente para formar el complejo de transfección. Añadir 90 l de medio antibiótico y libre de suero a la mezcla a un volumen final de 100 l.
- Retire el medio de cultivo de las placas de 6 pocillos (paso 2.2.1). Añadir 2 ml de medio fresco y la mezcla de transfección de 100 l a cada pocillo. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 24 a 48 hr. Refrescar medio de cultivo 24 horas después de la transfección.
- Evaluar la eficiencia de la transfección mediante análisis de transferencia Western (consulte los pasos 3 a 6).
3. Preparación de lisados de células completas Cultura
- Retire los medios de comunicación y enjuagar cada pocillo (de los pasos 2.1.8 y 2.2.4) utilizando DPBS precalentado (Mg2 +, Ca2 + libre). Aspirar el DPBS y añadir 500 l de ácido 0,25% de tripsina / etilendiaminotetraacético (EDTA). Incubar durante 1-3 minutos a 37 ° C en una incubadora de CO 2. Deja de tratamiento con tripsina mediante la adición de 500 l de suero que contiene medio de crecimiento.
Nota: Utilizar el volumen de medios apropiados de acuerdo con el tipo de frasco / placa: 1 ml por 10 7 células / placa de 100 mm / matraz de 150 cm2; 0,5 ml por cada 5 x 10 6 células / mm / 60 plato de 75 cm 2 frasco. - La transferencia de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, células precipitado mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Lavar las células con DPBS (Mg 2 +, Ca 2 + libre) y las células de pellets por centrifugación a 300 xg durante 2 min a temperatura ambiente.
- Retirar con cuidado el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Se coloca el tubo en hielo. Resuspender el precipitado en un tampón de 50-200 l helado de radio-inmunoprecipitación de ensayo (RIPA) (véase la Tabla 2 para la composición del tampón) que contiene recién añadirproteasa ed y inhibidores de la fosfatasa a una concentración final de 1x. En pocas palabras, el tubo de vórtice y dejar en hielo durante 30 min.
- Centrifugado a 16.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Con cuidado, coloque el tubo en hielo. Con una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de pre-enfriado fresco conservado en hielo. Se desecha el precipitado.
4. Preparación de extractos nucleares de células cultivadas
- Para cada pocillo (paso 1.2.5), se lava dos veces citrofoblastos cultivadas con 1 ml de DPBS pre-calentado (Mg2 +, Ca2 + libre). Aspirar DPBS y añadir 500 l de 0,25% de tripsina / EDTA. Incubar durante 1 a 3 min a 37 ° C en una incubadora de CO 2 y detener el tratamiento con tripsina mediante la adición de 500 l de suero que contiene medio de crecimiento.
- La transferencia de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, células precipitado mediante centrifugación a 300 xg durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se lavan las células con DPBS (Mg 2+, Ca 2 + libre) y las células de pellet por centrifugacióna 300 xg durante 2 min a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente todo el sobrenadante sin perturbar el sedimento y colocar el tubo en hielo.
- Extracto de proteína nuclear de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar la concentración de proteínas de cada muestra usando un ensayo de cuantificación de proteínas (Bradford o ensayo del ácido bicinconínico (BCA)).
5. Preparación de muestras y Electroforesis
- Determinar la concentración de proteínas para cada extracto de células usando un ensayo de cuantificación de proteínas (por ejemplo, Bradford 8 o 9 BCA).
- De acuerdo con las instrucciones del fabricante (si los anticuerpos podrían utilizarse en condiciones de reducción y desnaturalización), añadir un volumen igual de 2x tampón de muestra Laemmli (Tabla 2) para 20 a 30 g de proteína total.
- lisados celulares hierven a 100 ° C durante 5 min. Alícuota de 50-100 l de lisado para evitar ciclos repetidos de congelación / descongelación y almacenar los tubos restantes a -20 ° C para su uso futuro. Mientras que las muestras se están calentando, preparar 1 l de 1x tampón de funcionamiento (Tabla 2).
- Girar las muestras a 16.000 xg durante unos segundos y colocarlos en hielo.
- Carga igual cantidad de proteína en cada pocillo de un gel de SDS-PAGE 12% (véase la Tabla 2 para la composición de gel), junto con un marcador de peso molecular. Ejecutar el gel durante 1 a 2 horas a 100 V.
6. La transferencia de la proteína desde el gel a la membrana
- Activar membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) con metanol durante 1 min y enjuague con solución tampón / 10% de metanol transferencia 1x. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la transferencia de 30 min a 1 hr, dependiendo del tamaño de la proteína.
Nota: Eficacia de transferencia puede evaluarse usando tinción con Ponceau Red antes de la etapa de bloqueo.
7. tinción de anticuerpos
- Bloquear la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C usando solución de bloqueo 5%.
- Incubar la membrana con anticuerpos anti-sincitina-2 (4 mg / ml; 1: 5000) 6 o con anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; 0,4 mg / ml; 1: 500) en solución de bloqueo 5% durante la noche a 4 ° C (anti-sincitina-2) o durante 45 min a temperatura ambiente. Lavar la membrana tres veces en solución salina tamponada con Tris Tween (TBST; véase la Tabla 2 para la composición del tampón) durante 5 min.
- Incubar la membrana con peroxidasa de rábano picante apropiada (HRP) conjugado con anti-conejo o anticuerpo anti-ratón (1: 10.000) en 5% tampón de bloqueo en TBST a temperatura ambiente durante 1 hr. Se lava la membrana tres veces en TBST durante 5 min y luego enjuague en TBS. Detectar señales utilizando el sustrato de transferencia basado en quimioluminiscencia.
8. El radiomarcado del oligonucleótido de cadena simple
- reacción de fosforilación
- En un tubo de microcentrífuga, añadir 50 ng de un oligonucleótido hacia adelante a lo largo con tampón de polinucleótido quinasa T4 1x, 1 UT4 polinucleótido quinasa y 20 Ci (γ- 32P) ATP y compensar el volumen de reacción de 20 l con agua libre de nucleasa.
- Incubar a 37 ° C durante 30 min. Detener la reacción mediante la adición de 5 l de 0,5 M EDTA. Completar el volumen de 50 l con agua libre de nucleasa.
- La eliminación de los nucleótidos no incorporados de oligonucleótidos
- Preparar una columna G-25 equilibrada con tampón TE (Tabla 2) siguiendo las instrucciones del fabricante. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml DNasa libre fresco.
- Añadir lentamente 50 l de sonda (de la etapa 8.1.2) sobre la resina, teniendo cuidado de no perturbar el lecho de resina. Centrifugado durante 2 minutos a 350 xg para recoger la muestra purificada en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lavar la columna G-25 con 36 l de agua libre de nucleasa y centrifugado durante 2 minutos a 350 xg para recuperar la muestra en el tubo de microcentrífuga.
- La hibridación con la cadena complementaria oligonucleotide
- La transferencia de la sonda radiomarcada (86 l) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 200 ng del oligonucleótido inverso y 1x de tampón de hibridación (Tabla 2). Heat 5 min a 95 ° C y dejar toda la noche a temperatura ambiente para la refrigeración.
- Preparar oligonucleótidos de doble hebra no radiactivos mediante la adición de 50 ng de no marcado adelante y atrás oligonucleótidos y 1x de tampón de hibridación en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Completar el volumen a 100 l con agua libre de nucleasa. El calor y mantener a temperatura ambiente como se describe en el paso 8.3.1.
9. Preparación de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante para EMSA
- Preparar un gel nativo 4% (10 x 12 cm) con un espacio de 1,5 mm-peine (véase la Tabla 2 para composición de gel). Limpiar todas las placas de vidrio con agua destilada.
Nota: Es muy importante que las placas sean completamente libre de detergente iónico, como SDS. - inmediatamente pnuestra la solución de acrilamida entre las placas y permitir que la polimerización proceda (aproximadamente 30 min).
- Montar el aparato de electroforesis y llenar el tanque con TBE 0,5x. Pre-ejecutar el gel durante 30 min a 1 hora a 150 V antes de la carga de la muestra.
10. ADN reacción de unión
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 10 g de extracto nuclear (paso 4.3) en tampón 1x Gel Shift Encuadernación (Tabla 2) y completar hasta el volumen final a 10 l con agua libre de nucleasa. Como control, prepare un tubo sin extracto nuclear. Para la reacción de competencia, añadir 1 l de oligonucleótido frío no específica o específica de doble hebra (etapa 8.3.2).
- Añadir 1 l de sonda radiactiva procedente de la etapa 8.3.1 a cada reacción. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 20 min. Añadir 1 l de tampón de carga 10x gel por reacción y cargar cada muestra en el gel preparado en el apartado 9.
- Ejecutar el gel durante 1 1/2 a 2 horas a 150 V. Después de la migración, envolver el gel y el vidrio en una envoltura de plástico y la posición en un casete de exposición por debajo de una pantalla de fósforo. Deja casete a 4 ° C durante 24 horas.
- Retire la pantalla del casete de exposición e insertar en el dispositivo de imágenes de fósforo para la exploración.
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Representative Results
placentas frescos de embarazos a término fueron utilizados para aislar citrofoblastos vellosidades primarias humanos para llevar a cabo el conjunto de experimentos presentados en la sección Protocolo. Tras su aislamiento, se analizaron primero la pureza de citotrofoblastos mediante el uso del marcador de citoqueratina-7 (Figura 1). Preparaciones de células se tiñeron por lo tanto el uso de un anticuerpo monoclonal anti-citoqueratina-7. La figura 1 representa los resultados de un experimento típico después de la purificación de citotrofoblastos vellosos primarios, se analizan mediante citometría de flujo estándar. Después de la etapa de gradiente de densidad, las células> 97% (en este caso, 99%) se tiñeron positivamente para citoqueratina-7 en experimentos estándar, lo que demuestra un alto grado de eficiencia en la purificación de este tipo de células.
Después de su aislamiento, citotrofoblastos humanas primarias se pueden utilizar directamente para transfection. Se evaluaron dos protocolos diferentes, es decir, formación de microporos y la transfección a base de lípidos. Ambos protocolos fueron probados con siRNA específico para sincitina 2-mRNA y se compararon con un siRNA revueltos (control negativo). La eficacia de transfección fue evaluada junto través de Western blot. Los resultados confirmaron que sincitina-2 expresión fue silenciado de manera significativa en los extractos derivados de citotrofoblasto sobre la formación de microporos (Figura 2). Por otra parte, no silenciamiento significativa se observó cuando siRNAs fueron transfectadas por el reactivo de transfección a base de lípidos.
También llevamos a cabo experimentos EMSA en citrofoblastos recién aisladas. Una sonda radiomarcada que se originó a partir de una región promotora sincitina-2 fue sintetizado. La sonda sintetizada (denominado WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') se ha demostrado previamente para unirse relacionados CREB-7 factores de transcripción. En presencia de extr nuclear actos de 24 y 48 hr citotrofoblastos vellosos cultivadas, la sonda derivada de sincitina-2-promotor mostraron la presencia de dos complejos de ADN-proteína. La adición de 100x oligonucleótido WT frío compitió por la formación del complejo, mientras que no hay competencia similar con exceso de un oligonucleótido no relacionado frío (ratón Neural Crest reforzador 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') se observó, lo que confirma la especificidad de ambas señales ( la Figura 3).
Figura 1. Evaluación de la pureza de las vellosidades primarias citrofoblastos través de citometría de flujo. Recién aisladas preparaciones de citotrofoblastos de las vellosidades se permeabilizaron primero y luego marcaron con anticuerpo de control de isotipo (línea roja) o anticuerpo monoclonal específico para citoqueratina-7 (línea de color negro). Las células se analizaron por citometría de flujo. Les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Comparación de las eficacias de transfección de ARNsi entre la transfección y de microporos a base de lípidos. Recién aislados citotrofoblastos vellosos se transfectaron con 300 ng de sincitina-2-siRNA vs. un siRNA control mezclado usando el reactivo o de microporos a base de lípidos. (A) análisis de transferencia de Western se realizaron en extractos celulares de cada condición de transfección utilizando anticuerpos anti-anti-GAPDH sincitina-2 y. (B) los niveles de proteína sincitina-2 de Western blot análisis se cuantifica en términos de intensidad de las bandas siguientes señales de normalización con GAPDH correspondiente (barras de error se definen como SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. complejos de ADN-proteína identificadas por análisis EMSA. Extractos nucleares de citotrofoblastos vellosos primarias cultivadas durante 24 o 48 hr se incubaron con una sonda de WT correspondiente a una región promotora de sincitina-2 con o sin exceso de (100x) de específica o no específica oligonucleótidos fríos. los complejos ADN-proteína se separaron sobre la migración en un gel nativo. señales específicas y las sondas libres se indican en el lado derecho del gel. sonda de WT se incubaron en ausencia de extracto nuclear también se utilizó como control negativo. CT NE = extractos nucleares citotrofoblasto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| % De la final de Percoll | Volumen de Percoll (90%) (ml) | Volumen de HBSS (ml) |
| 70 | 2.33 | 0.67 |
| sesenta y cinco | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1.67 | 1.33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1.33 | 1.67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0.67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0.33 | 2.67 |
| 5 | 0.17 | 2.83 |
Tabla 1. 5% ajuste polivinilpirrolidona recubierto de sílice gradiente -70%.
| Buffer | Composición | Comentarios / Descripción |
| PBS 1x | CaCl 2 0,9 mM, KCl 2,7 mM, 1,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM de MgCl2, NaCl 136,9 mM y 0,8 mM Na 2 HPO 4 | |
| RIPA Buffer | NaCl 150 mM, 1,0% NP-40 o 0,1% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sodio), 50 mM Tris-HCl pH 8,0 | |
| Tampón de muestras de Laemmli | 4% de SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% de glicerol, 0,004% de azul de bromofenol, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8 | |
| 10x tampón de ejecución | 25 mM Tris base, glicina 190 mM, 0,1% de SDS | |
| tampón de transferencia 10 veces | 25 Tris base mM, glicina 192 mM | |
| tampón TBST 1x | 10 mM Tris-HCl, NaCl 15 mM, 0,05% de Tween 20 a pH 7 | Mezclar bien y filtrar. La falta de filtro puede dar lugar a "manchas" de la membrana. |
| tampón de bloqueo | 5% de leche o BSA (albúmina de suero bovino) añaden a TBST tampón 1x | |
| TE Buffer | 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), EDTA 1 mM | |
| tampón de reasociación | 1 M NaCl, mM Tris-HCl 50 pH 7,5, 100 mM MgCl 2, EDTA 0,2 mM, DTT 1 mM | |
| Shift 5x Gel Binding Buffer | 20% glicerol, 5 mM MgCl 2, EDTA 2,5 mM, DTT 2,5 mM, NaCl 250 mM, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) y 0,25 mg / ml de poli (dI-dC). | |
| tampón de carga | 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% de azul de bromofenol y 40% de glicerol | |
| TBE 5x | Disolver 54 g de Tris Base y 27,5 g de ácido bórico en 1 L de agua desionizada, que incluye 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8 | |
| 4% en gel nativo | 5x tampón TBE | 6,0 ml |
| 29: 1 de acrilamida / bisacrilamida (30% w / v) | 10 ml | |
| 40% de acrilamida (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% de glicerol | 1,5 ml | |
| Agua destilada | 41,5 ml | |
| persulfato de amonio 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacrey Gel (6 ml) para SDS-PAGE | ddH2O | 4,1 ml |
| 30% de acrilamida | 1,0 ml | |
| 1,0 M Tris | 0,75 ml | |
| 10% SDS | 60 l | |
| 10% APS | 60 l | |
| TEMED | 6 l | |
| 12% de separación de gel (10 ml) para SDS-PAGE | ddH2O | 3,3 ml |
| 30% de acrilamida | 4,0 ml | |
| 1,5 M Tris | 2,5 ml | |
| 10% SDS | 100 l | |
| 10% APS | 100l | |
| TEMED | 4 l |
Tabla 2. Composición de tampones.
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Discussion
Los estudios sobre la función de la placenta humana y el desarrollo se han mejorado en gran medida por los protocolos orientados a optimizar el aislamiento de varias poblaciones de células placentarias. Uno de los mejores población de células de la placenta permanece estudiado los citotrofoblastos vellosos, cuyo estudio se ha beneficiado enormemente de los protocolos optimizados que permiten el aislamiento eficiente y fiable. Esto ha permitido, además, un número de experimentos, tales como estudios de transfección y de promotor. El uso de un protocolo descrito previamente 3, poblaciones puras de citotrofoblastos vellosos primarias se pueden obtener. CK-7 es una proteína de filamentos intermedios, que se expresa en citotrofoblastos. Los anticuerpos monoclonales contra esta proteína se utilizan para determinar la pureza de esta población trofoblasto después de su aislamiento de la placenta 10. Las preparaciones se definen para ser puro cuando 96% de las células son positivas para CK-7. Las células posteriormente se pueden utilizar directamente para la transfección. protocolos de transfecciónla participación de los enfoques basados en lípidos se utilizan ampliamente para transferir ácidos nucleicos en células primarias 11,12. Sin embargo, la toxicidad de la formulación de lípidos en algunas células se convierte en una desventaja. De microporos es una tecnología de electroporación utilizando una punta de pipeta como un espacio de la electroporación, que genera un calor mínimo, la disolución de iones metálicos, la variación del pH y la formación de óxido; todos los cuales pueden ser perjudiciales para las células. Sobre la base de los datos presentados en el presente documento, formación de microporos representa un enfoque más eficiente para la entrega siRNA que el protocolo de transfección basado en lípidos, a juzgar por los análisis de transferencia de Western. Utilizando un enfoque de EMSA, una sonda diseñada en contra de una región seleccionada del promotor sincitina-2 que se sabe que se unen factores importantes para su actividad 7 fue probado. La sonda se incubó con extracto nuclear de citotrofoblastos aisladas. Tal como se presenta en la Figura 3, se obtuvieron señales específicas.
Los diferentes protocolos descritos en el presente documento have sido optimizada en los últimos años. Sin embargo, todos ellos se basan en preparaciones citotrofoblastos de alta calidad, que dependen de un cierto número de pasos críticos. Primero y ante todo, después del nacimiento, placentas necesita ser mantenido en una solución tampón y las células deben estar aislados de ellos no más de 5 horas después de haber sido sumergido en la solución. tratamientos de tripsina y DNasa también son de gran importancia y deben llevarse a cabo cuidadosamente para maximizar la calidad de la preparación citotrofoblasto. Amplia lavado de las vellosidades placenta y la reducción del tiempo necesario para su aislamiento son ambas mejoras adicionales, que pueden mejorar fuertemente la eficiencia de aislamiento número de células. El rendimiento de este protocolo depende además de la centrifugación óptima durante la etapa de gradiente de densidad, los cuales deben ser estrechamente monitorizados. Debido balance entre los tubos también dará lugar a una distorsión de la pendiente y reducir severamente el número de células.
El protocolo de transfección describird en el presente documento ha sido probado por más de varios años. Aunque las condiciones necesarias para la formación de microporos son generalmente inmediata, se requiere, sin embargo optimización de la transfección de las diferentes células primarias. Esto también implica la optimización de la cantidad de ácido nucleico transfectadas (siRNA o ADN plásmido). Así, para el protocolo descrito aquí, se recomienda la optimización de diversas concentraciones siRNAs para identificar un siRNA reprimir de manera eficiente. La adición de un volumen de suspensión adecuada para el sedimento de células antes de la formación de microporos y la suspensión completa de las células son factores adicionales, que afectan a la eficiencia de transfección.
EMSA experimentos también han hecho necesario la optimización. Dada la heterogeneidad asociada con los donantes de la placenta y las diferentes eficacias de aislamiento de citotrofoblastos y purezas, EMSA experimentos deben repetirse hasta 5 veces para confirmar los resultados. Además, el número de células que tienen altas es importante para asegurar la suficiente protección de bien los niveles en preparaciones de extractos nucleares y la posterior detección de los complejos proteína / ADN. Por otra parte, las sondas de oligonucleótidos altamente radiactivos deben estar preparados, y deben prepararse de nuevo a partir de ATP radiactivo recientemente adquirido.
Una serie de limitaciones debe ser subrayado en el protocolo presentado. En primer lugar, hay que subrayar que los análisis de citometría de flujo no pueden evaluar la posible presencia de fragmentos de sincitiotrofoblasto en preparaciones de células. Se han propuesto otros protocolos de resolver este problema, tales como la clasificación usando citometría de flujo o el uso de perlas magnéticas de anticuerpos unida a 13,14. Debe mencionarse sin embargo que estos fragmentos normalmente no se adhieren a pocillos de cultivo de células y, a menudo se eliminan después de la etapa de lavado de células. Otra limitación en el protocolo presentado es que citotrofoblastos vellosos primarias tienen un tiempo de supervivencia muy limitada en cultivo celular. Por lo tanto, independientemente del método seleccionado, la transfección estable de vilcitrofoblastos Lous seguirá siendo inalcanzable. análisis EMSA, como se describe en este protocolo, también tienen ciertas limitaciones. Aunque la especificidad de las señales puede ser fácilmente evaluada por experimentos de competición con exceso de oligonucleótidos no marcados, los factores sometidos sólo se pueden identificar usando anticuerpos contra los factores de transcripción específicos resultantes en señales supershifted. EMSA experimentos, además, siguen siendo limitados, ya que estudia en las interacciones proteína-ADN in vitro. Se necesitan experimentos con ajustes más representativos, como el chip de ensayo, y más recientemente en los protocolos in vivo para confirmar aún más el resultado de la EMSA.
Los protocolos descritos en el presente documento para el aislamiento del citotrofoblasto y transfección tienen aplicaciones importantes para los estudios en los que hace falta silenciamiento transitorio o sobreexpresión de los genes específicos para comprender su papel en la función, la proliferación o la diferenciación de un tipo celular específico trofoblasto. Además, después de la transfección, tversiones agged de proteínas expresadas serán adecuados para el seguimiento intracelular y análisis por técnicas estándar, tales como la microscopía confocal y citometría de flujo. El protocolo EMSA puede ser utilizado para estudiar los detalles intrincados relativas a la regulación del promotor y los factores de transcripción implicados. Por otra parte, este enfoque experimental permitirá a los investigadores a identificar los factores que intervienen en el desarrollo de ciertas enfermedades relacionadas con la deficiencia placentación y la alteración en la regulación de los genes expresados en citrofoblastos vellosos.
En conclusión, citotrofoblastos humanas primarias se puede aislar fácilmente a partir de placentas y son susceptibles de protocolos estándar, tales como siRNA transfección y EMSA. Aunque diferentes procedimientos de transfección, tales como la lipofección 15 y nucleofection 16 están disponibles, de microporos parece un método muy eficiente para siRNA transfección de citotrofoblastos aisladas vellosos, que ofrece un enfoque con limitada de células death y un costo relativamente bajo. En el contexto de citotrofoblastos vellosos, este enfoque debe permitir el silenciamiento de genes diferentes y la evaluación de su implicación en diversas funciones o características del tipo de células. Además, la transfección de vectores de expresión también es factible el uso de este protocolo y cederá los datos complementarios para el enfoque basado en siRNA. Con respecto a EMSA, esta técnica proporciona un método más rápido y más simple de evaluación de proteínas de ADN en comparación con enfoques alternativos, tales como DNasa I footprinting, ensayo de interferencia de metilación, la inmunoprecipitación de la cromatina y la conformación de la cromatina análisis. Por lo tanto, esta técnica sigue siendo valioso en los análisis o pruebas de cualquier otra región de ADN que contiene potenciador / promotor-supresores estándar. Nuestra demostración de su uso fiable para citrofoblastos vellosidades es importante, ya que añade información sobre la regulación de los genes, con implicaciones potenciales en el plano funcional. A pesar de sutiempo limitado en la cultura, citrofoblastos vellosidades primarias son adecuados para estudios estándar y debe ser adaptable a más reciente, así como los métodos informativos.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca del Consejo Nacional de Ciencias y la Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT fue apoyado por una beca de la FARE institucional. AV fue apoyada por un doctorado CRSNG Graham Bell beca. BB llevó a cabo una Cátedra de Investigación en Derechos Humanos Retrovirology (Nivel 2). Gracias a Beatriz Beisner en busca de ayuda en la revisión del texto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
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