Protocol
सभी प्रयोगों संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे। Thy1-YFP, पीएलपी-EGFP और पीवी-tdTomato चूहों इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया, लेकिन किसी भी चूहों फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त सफलतापूर्वक को मंजूरी दे दी है और imaged किया जा सकता है।
1. ऊतक तैयार
सावधानी: paraformaldehyde (पीएफए) और एक्रिलामाइड विषैले और परेशानी है। एक धूआं हुड में और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और आंखों की सुरक्षा) के साथ इन अभिकर्मकों के उपयोग के प्रयोगों का प्रदर्शन।
- isoflurane की ~ 1 मिलीलीटर के साथ इच्छामृत्यु कक्ष में पशु बलि तक सांस लेने के लिए रहता है (~ 2 - 3 मिनट)।
- एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप ~ 5 मिलीलीटर करने के लिए सेट का उपयोग करें / मिनट intracardially 4 डिग्री सेल्सियस पर छिड़काव समाधान (तालिका 1) के साथ माउस छिड़कना जब तक रक्त ऊतकों से मंजूरी दे दी है (5 - 10 मिनट)।
- (तालिका 1) लगानेवाला समाधान करने के लिए perfusate बदलें(- 10 मिनट 5) 4 डिग्री सेल्सियस पर जब तक गर्दन और पूंछ काफी stiffened है।
- छिड़काव के अंत और पशु सिर काटना। ध्यान से पहले खोपड़ी आसपास संयोजी ऊतक को हटाने और फिर खोपड़ी के उदर सतह से हड्डी को दूर करने और मस्तिष्क 20 में वर्णित के रूप में, (चित्रा 1 ए) बाहर उठाने से खोपड़ी से बाहर मस्तिष्क काटना।
नोट: सेरिबैलम के flocculonodular पालियों और घ्राण बल्ब के आस-पास की हड्डी को हटाने के लिए विशेष ध्यान दे।- धीरे रीढ़ की हड्डी और कशेरुका स्तंभ के बीच एक अच्छा, तेज कैंची की नोक डालने और 21 में वर्णित है, दूर व्यक्तिगत कशेरुका स्तंभ खंडों में कटौती करके कशेरुका स्तंभ से रीढ़ की हड्डी काटना।
- एक प्लास्टिक माउस मस्तिष्क मैट्रिक्स में रखकर और एक मैट्रिक्स ब्लेड के साथ midline के साथ काटने से मस्तिष्क Hemisect।
- प्रत्येक गोलार्द्ध और रीढ़ की हड्डी 50 मिलीलीटर अलग करने के लिए सेंट्रीफ्यूज टब जोड़ेसाथ es ~ हाइड्रोजेल समाधान (तालिका 1) के 40 मिलीलीटर। इस बिंदु से आगे कवर से एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूब बाद के सभी चरणों के दौरान fluorophores की रक्षा के लिए।
- कोमल 7 दिनों के लिए झटकों (~ 30 rpm) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल में नमूना युक्त ट्यूब सेते हैं।
2. Polymerization
- त्यागें ~ हाइड्रोजेल के 25 मिलीलीटर, अपकेंद्रित्र ट्यूब में नमूना और हाइड्रोजेल के 25 मिलीलीटर संरक्षण ~।
- टोपी हटाने और desiccator जार में अपकेंद्रित्र ट्यूब रखने और एक निर्वात को जार जोड़ने के द्वारा नमूना Deoxygenate। कम से कम 10 मिनट के लिए वैक्यूम लागू भंग गैसों की अनुमति के लिए समाधान और फार्म बुलबुले के बाहर आने के लिए। धीरे बुलबुले को बेदखल करने के लिए हिला।
- 3 मिनट - पर 2 100% नाइट्रोजन गैस के साथ desiccator जार में वैक्यूम बदलें। एक बार जब दबाव equalizes (एक बार desiccator जार के शीर्ष खोला जा सकता है), जल्दी से ऑक्सीजन के reintroduction को रोकने के लिए ट्यूब टोपी।
- पॉलिमर3 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नमूने के साथ ट्यूब रखने के लिए जब तक polymerization पूरा हो गया है द्वारा हाइड्रोजेल ize। Polymerized हाइड्रोजेल एक जेल की तरह स्थिरता (चित्रा 1 बी) पर ले जाएगा। नोट: शीर्ष पर unpolymerized हाइड्रोजेल की एक छोटी राशि स्वीकार्य है।
- अपकेंद्रित्र ट्यूब से polymerized नमूना दूर करने के लिए, तो दूर नमूना से अतिरिक्त हाइड्रोजेल में कटौती के लिए एक रंग का प्रयोग करें।
- एक प्रकार का वृक्ष पर नमूना रखने मुक्त पोंछे और धीरे रगड़ और उस पर ऊतक रोलिंग, केवल नमूने पर polymerized हाइड्रोजेल की एक पतली परत के पीछे छोड़ कर शेष हाइड्रोजेल निकालें।
3. लिपिड निकालना
नोट: लिपिड को मंजूरी दे दी ऊतक कमजोर है, देखभाल के साथ संभाल। जब ट्यूब draining नमूना खोने से बचने के लिए एक सेल झरनी का प्रयोग करें। इसके अलावा, नमूना समाशोधन प्रक्रिया के दौरान प्रफुल्लित होगा, हालांकि, सूजन अपवर्तनांक मिलान की प्रक्रिया के दौरान उलट हो सकता है।
सावधानी: Sodiउम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) और बोरिक एसिड परेशानी है। उन्हें एक धूआं हुड में और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और आंखों की सुरक्षा) के साथ उपयोग प्रयोगों का प्रदर्शन।
- एक साफ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब polymerized नमूना स्थानांतरण और समाशोधन बफर (तालिका 1) के 45 मिलीलीटर जोड़ें। कोमल झटकों के साथ 45 डिग्री सेल्सियस (~ 30 rpm) में सेते हैं। रासायनिक कचरे में इस्तेमाल किया समाशोधन बफर डालने के लिये और ताजा समाशोधन बफर के ~ 45 मिलीलीटर जोड़कर एक प्रारंभिक 7 दिनों के लिए दैनिक बफर बदलें। नमूने एल्यूमीनियम पन्नी में कवर fluorophores की रक्षा के लिए युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
- प्रारंभिक 7 दिन बाद, 40 डिग्री सेल्सियस और एक्सचेंज क्लियरिंग बफर पर नमूना सेते हर 2 - 3 दिनों के लिए। समाशोधन जारी रखें जब तक सभी लिपिड solubilized हैं और ऊतक पारदर्शिता (चित्रा -1 सी) तक पहुँचता है। एक माउस मस्तिष्क गोलार्द्ध के लिए 6 सप्ताह और 2 - - एक रीढ़ की हड्डी के लिए 4 सप्ताह यह 4 हो जाएगा।
- एक बार ऊतक को मंजूरी दे दी है, हस्तांतरणएक नया 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब नमूना और 4 बार PBST (तालिका 1) में 40 डिग्री सेल्सियस पर कोमल मिलाते (~ 30 rpm) के साथ 24 घंटा से अधिक अवशिष्ट एसडीएस दूर करने के लिए धो लें।
4. आण्विक धुंधला
सावधानी: 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) एक अड़चन है और किसी भी उपयोग के लिए यह एक धूआं हुड में और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और आंखों की सुरक्षा) के साथ किया जाना चाहिए प्रयोगों है।
- एक साफ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण और 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI 1x PBST में, पीएच 7.5 से भरना। 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर सेते हैं। नमूने एल्यूमीनियम पन्नी में कवर fluorophores की रक्षा के लिए युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें।
- आरटी पर कम से कम 6 मानव संसाधन / धोने के लिए PBST में 3 बार धोएं।
5. अपवर्तक सूचकांक मिलान
सावधानी: 2,2'-Thiodiethanol (TDE) एक अड़चन है और किसी भी प्रयोगों इसे उपयोग एसएचएक धूआं हुड में और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और आंखों की सुरक्षा) के साथ प्रदर्शन किया जा ould।
- एक साफ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण और 30% (वी / वी) 1x पीबीएस में TDE, पीएच 7.5 से भरना। 40 डिग्री 24 घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ सी (~ 30 rpm) में सेते हैं।
- एक्सचेंज के साथ 63% (वी / वी) 1x पीबीएस, 7.5 पीएच में TDE 30% TDE। कोमल 24 घंटे के लिए झटकों के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
नोट: नमूना लगभग मूल आकार में वापस हटना होगा। - एक फ्लैट, साफ सतह पर सिर्फ नमूना की मोटाई की तुलना में थोड़ा अधिक से अधिक वर्दी व्यास के साथ एक सिलेंडर में पुन: प्रयोज्य चिपकने का एक टुकड़ा रोल।
- एक ओपन एंडेड सर्कल में पुन: प्रयोज्य चिपकने वाला सिलेंडर निर्धारित करना (~ शीर्ष पर एक छोटे से खोलने के साथ 25 मिमी भीतरी व्यास) एक 40 मिमी गिलास नीचे पकवान पर। सुधार किए जाने की जरूरत है, कांच से सिलेंडर को हटाने और एक रेजर ब्लेड के साथ काटा।
- द्वारा पुन: प्रयोज्य चिपकने वाला और कांच के बीच एक मुहर बनाने के लिए एक P1000 विंदुक टिप का उपयोग करेंसिलेंडर के बाहरी रिम के आसपास यह रोलिंग।
- प्लेस ~ 100 μl गिलास पकवान पर 63% TDE और पुन: प्रयोज्य चिपकने के सर्कल के भीतर कांच की सतह को कवर करने के लिए चारों ओर फैल गया।
- एक रंग का प्रयोग, ध्यान चक्र के मध्य में नमूना जगह, देखभाल करने के बुलबुले के लिए फार्म न।
- सीधे नमूना पर 63% TDE की एक और 100 μl पिपेट, तो तुरंत पुन: प्रयोज्य चिपकने पर एक 40 मिमी परिपत्र कांच कवर जगह है।
- तर्जनी, मध्यमा, और दोनों हाथों की अनामिका का प्रयोग, ध्यान वृत्त की परिधि के आसपास प्रेस जब तक कवर कांच नमूना के साथ संपर्क किया गया है।
- धीरे धीरे, एक सतह के खिलाफ आराम एक ईमानदार स्थिति के लिए गिलास नीचे डिश लाने तब एक विंदुक के साथ 63% TDE जोड़ने जब तक समाधान शीर्ष पर छोटे से खोलने के लिए पहुंचता है। एक प्रकार का वृक्ष का प्रयोग मुक्त विंदुक टिप सूखे से इतना है कि समाधान के कांच पर ड्रिप नहीं करता पोंछ। चैम्बर में बुलबुले से बचने के लिए, पिपेट सभी तरह से खाली नहीं।
- सेवा मेरेछोटे से खोलने, चक्र लगा देना और एक बंद कक्ष बनाने के लिए सिलिकॉन elastomer जोड़ें। यह इमेजिंग से पहले सूखे के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
6. माइक्रोस्कोपी
सावधानी: लेजर confocal, एकल विमान रोशनी और प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी में इस्तेमाल बहुत शक्तिशाली हैं और अंधापन हो सकता है। लेसरों का उपयोग किसी भी प्रयोगों व्यापक प्रशिक्षण के बाद और बड़ी सावधानी और उचित आंखों की सुरक्षा के साथ किया जाना चाहिए।
- एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन के मंच पर नमूना के अंदर के साथ इमेजिंग चैम्बर रखें।
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिका देखें)। आर्गन उत्तेजना लेजर चालू करने के लिए, कार्यक्रम तो लेजर आइकन के शीर्ष पर विन्यास टैब पर क्लिक करें। बॉक्स आर्गन करने के लिए अगले चेक लेजर पावर और 30% करने के लिए स्लाइड पैमाने स्थानांतरित करने के लिए। निरीक्षण सूचक धीरे धीरे चयनित स्थिति को गर्म।
- शीर्ष पर अधिग्रहण टैब पर लौटें। बड़े बॉक्स में "किरण पथ सेटिंग &# 34; / लोड करने के लिए जाने की स्थापना बॉक्स बचाने और छवि YFP (527 एनएम) के लिए एक उपयुक्त तरंग दैर्ध्य चैनल का चयन करने के लिए ड्रॉप डाउन मेनू का चयन करें।
- चैनल सेटिंग्स बॉक्स के तहत: लाल हाइपरलिंक "वर्तमान वस्तु उद्देश्य" लेबल लगाने के द्वारा इमेजिंग के लिए उचित उद्देश्यों का चयन करें। टैब पर क्लिक करके सभी उपलब्ध उद्देश्यों को खोलता है और एक चयन स्वचालित रूप से बुर्ज बारी बारी से होगा।
- एक बड़े काम की दूरी के साथ प्रयोग उद्देश्यों (जैसे।, 10X) (ऊतक की मोटाई से अधिक, imaged किया जा उदाहरण के लिए, 11 मिमी) और एक बड़े संख्यात्मक एपर्चर (जैसे।, 0.3) में विमान छवि संकल्प को अधिकतम और न्यूनतम करने के लिए ऑप्टिकल अनुभाग मोटाई।
- अधिग्रहण मैट्रिक्स स्थापित करने के लिए खिड़की, "प्रारूप" कहा जाता है, 1024 x 1024 को या उद्देश्य के पार्श्व संकल्प सीमा के लिए उपयुक्त एक मूल्य: ड्रॉप डाउन मेनू, "संकल्प XY" खोलने के बाएँ स्तंभ पर। जितना संभव हो कम (जूम कारक सेट उदा।, 1.7)।
- एक ही विंडो में, उसके अनुसार अलग-अलग लेबल डाउन मेनू छोड़ने के द्वारा 8 लाइन औसत और 1 फ्रेम औसत मानकों सेट। एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात और तेजी से अधिग्रहण के लिए छोटे मूल्यों के लिए बड़ी मूल्यों का प्रयोग करें।
नोट: 8 रेखा औसत और 1 फ्रेम औसत लगभग 4 घंटे में एक चूहे के मस्तिष्क गोलार्द्ध के उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त होगा। - नमूना मंच नियंत्रण का उपयोग कर पता लगा। एक बार एक प्रतिनिधि के क्षेत्र में दिख रहा है, लाभ और ऑफसेट निर्धारित किया है।
नोट: लाभ और ऑफसेट ऊतक प्रकार, fluorophores के आधार पर काफी हद तक अलग अलग होंगे, और / या शारीरिक सुविधा imaged किया जा रहा। YFP के लिए, 760 से लाभ के लिए 780 और -1.0 से -1.5 के लिए ऑफसेट करने के लिए मूल्यों की स्थापना की। - "टाइल स्कैन" का चयन करें और ब्याज के क्षेत्र की सीमाओं का चयन करें। जेड ढेर के ऊपरी और निचले सीमा सेट का अधिग्रहण किया जाना है। ऑप्टिकल उद्देश्य के ऑप्टिकल अनुभाग संकल्प सीमा के आधार पर खंड की मोटाई निर्धारित करें।
नोट: एक उद्देश्य केऑप्टिकल अनुभाग संकल्प सीमा मुख्य रूप से अपने संख्यात्मक एपर्चर द्वारा परिभाषित किया गया है। अधिकांश माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से उद्देश्य के लिए एक मूल्य की गणना करेगा उचित इस्तेमाल किया जा रहा है। 0.3 की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 10X उद्देश्य के लिए है कि लगभग 11 माइक्रोन होगा। - अधिग्रहण शुरू करो।
नोट: यह कई घंटे लग सकते हैं। - हित के विशिष्ट क्षेत्रों से उच्च बढ़ाई उद्देश्यों का उपयोग उच्च संकल्प छवियों को ले लीजिए।
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Representative Results
मस्तिष्क के संरचनात्मक संगठन Visualizing समझ कैसे आकृति विज्ञान और कनेक्टिविटी स्वास्थ्य और रोग में मस्तिष्क समारोह को प्रभावित करने के लिए महत्वपूर्ण है। ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक यह संभव बनाने बरकरार ऊतकों में 3 डी में छवि सेल आबादी के लिए, हमें आकृति विज्ञान और कनेक्टिविटी एकजुट रखने का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है।
चूहे कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उप आबादी के लिए विशिष्ट प्रमोटरों द्वारा संचालित की कोशिकाओं को मस्तिष्क में तंत्रिका कनेक्टिविटी की जटिल पैटर्न के अलावा तंग करने के लिए एक परमिट। Thy1-YFP ट्रांसजेनिक चूहों ऑप्टिकल समाशोधन साहित्य में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है क्योंकि इन चूहों के मस्तिष्क (चित्रा 2A और बी) में प्रक्षेपण न्यूरॉन्स कि सेरेब्रल कॉर्टेक्स और हिप्पोकैम्पस में रहते हैं, साथ ही अन्य संरचनाओं के एक सबसेट में YFP व्यक्त करते हैं। इसके अलावा, YFP + cortical न्यूरॉन्स परत वी एस में corticospinal पथ के माध्यम से परियोजनापीनल कॉर्ड (चित्रा -2 सी एंड डी), उन्हें cortical न्यूरॉन्स 15 पर रीढ़ की हड्डी में axonal अपमान और / या चोट के प्रभाव का मूल्यांकन करने में बहुत उपयोगी बना रही है। confocal माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकली को मंजूरी दे दी ऊतकों की ऑप्टिकल सेक्शनिंग के उपयोग के माध्यम से एक बड़े आसानी से शारीरिक संरचनाओं भर में न्यूरोनल घनत्व में मतभेद मूल्यांकन कर सकते हैं।
Thy1-YFP ट्रांसजेनिक चूहों के अलावा, ट्रांसजेनिक चूहों के किसी भी संख्या imaged किया जा सकता है। पीएलपी-EGFP ट्रांसजेनिक चूहों के मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी (चित्रा 3 ए) के दौरान proteolipid प्रोटीन (पीएलपी) व्यक्त परिपक्व oligodendrocytes में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) बढ़ाया व्यक्त करते हैं। PV-tdTomato ट्रांसजेनिक चूहों parvalbumin (पीवी) के एक सबसेट में tdTomato व्यक्त करते सेरिबैलम, स्ट्रिएटम और हिप्पोकैम्पस (चित्रा 3 बी) में इन्तेर्नयूरोंस व्यक्त। यहाँ तक कि चूहों में इस तरह के विकास के रूप में फ्लोरोसेंट ट्रांसजीन, छोटे आणविक वजन फ्लोरोसेंट रंजक, व्यक्त नहीं करते किएपीआई, आसानी से हाइड्रोजेल एम्बेडेड ऊतकों में फैलाना और मस्तिष्क (चित्रा 4) में सेलुलर नाभिक के मूल्यांकन की अनुमति कर सकते हैं।
चित्रा 1:। Thy1-YFP + माउस मस्तिष्क के मस्तिष्क क्लियरिंग फोटोग्राफ के विभिन्न चरणों में है कि खोपड़ी से हटा दिया गया है (क)। हाइड्रोजेल एम्बेडेड Thy1-YFP + माउस मस्तिष्क गोलार्द्ध (ख) की तस्वीर। लिपिड हटाने (ग) के बाद Thy1-YFP + माउस मस्तिष्क गोलार्द्ध की तस्वीर। स्केल सलाखों प्रत्येक पैनल में 5 मिमी हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: मस्तिष्क एक में Thy1-YFP अभिव्यक्तिएन डी रीढ़ की हड्डी। Thy1-YFP + सेरेब्रल कॉर्टेक्स में न्यूरॉन्स और 5X बढ़ाई imaged और 3 डी में खंगाला हिप्पोकैम्पस (क)। सेरेब्रल कॉर्टेक्स cortical परत वी पिरामिड न्यूरॉन्स (ख) के वृक्ष के समान द्रुमायण प्रदर्शन का एक 10X छवि ढेर की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। एक अक्षुण्ण ग्रीवा और वक्ष रीढ़ की हड्डी में Thy1-YFP अभिव्यक्ति 5X बढ़ाई imaged और 3 डी (ग) में खंगाला। रीढ़ की हड्डी व्यक्ति एक्सोन (घ) के प्रदर्शन के एक 10X छवि ढेर की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। स्केल सलाखों में 1 मिमी हैं (एक), में 100 माइक्रोन (ख), (ग) में 2 मिमी, और (घ) 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: मस्तिष्क में पीएलपी-EGFP और पीवी-tdTomato अभिव्यक्ति। कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
चित्रा 4:। 5X बढ़ाई imaged एक अक्षुण्ण मस्तिष्क गोलार्द्ध के सेरिबैलम में ब्रेन DAPI अभिव्यक्ति में DAPI धुंधला। छवि की midsagittal विमान से लगभग 1 मिमी है। इनसेट 10X बढ़ाई इस इमेजिंग गहराई पर दिखाई विस्तार के स्तर से पता चलता। स्केल सलाखों एकपुन मुख्य पैनल में 250 माइक्रोन और 50 माइक्रोन इनसेट में। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| बफर | रासायनिक | अंतिम एकाग्रता |
| छिड़काव समाधान | ||
| 10x फॉस्फेट बफर खारा | 1x | |
| सोडियम नाइट्रेट | डब्ल्यू 0.5% / वी | |
| हेपरिन | 10 यू / मिलीलीटर | |
| लगानेवाला समाधान | ||
| 10x फॉस्फेट बफर खारा | 1x | |
| Paraformaldehyडे | 4% वी / वी | |
| हाइड्रोजेल समाधान | ||
| 10x फॉस्फेट बफर खारा | 1x | |
| paraformaldehyde | 4% वी / वी | |
| एक्रिलामाइड | 4% वी / वी | |
| बीआईएस acrylamide | 0.05% v / v | |
| VA-044 सर्जक | डब्ल्यू 0.25% / वी | |
| क्लियरिंग बफर | ||
| बोरिक अम्ल | 200 मिमी | |
| सोडियम डोडेसिल सल्फेट | डब्ल्यू 4% / वी | |
| PBST | ||
| 10x फॉस्फेट बफर खारा | 1x | |
| ट्राइटन X-100 | 0.1% v / v | |
| सोडियम एज़ाइड | डब्ल्यू 0.1% / वी |
तालिका 1: बफ़र और समाधान की सूची।
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Discussion
हाइड्रोजेल एम्बेडेड ऊतकों (निष्क्रिय स्पष्टता) के निष्क्रिय समाशोधन ऊतक के बड़े टुकड़े समाशोधन के लिए एक सरल और सस्ता तरीका है। यह दृष्टिकोण समर्पित उपकरण की आवश्यकता नहीं है और आसानी से एक तापमान नियंत्रित प्रकार के बरतन में किया जा सकता है। कुछ ही हफ्तों की अवधि के दौरान, यहां तक कि बड़े, इस तरह के एक पूरे मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के रूप में अत्यधिक मेलिनकृत ऊतकों, पारदर्शी और माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त हो जाएगा। हालांकि इस रिपोर्ट सीएनएस ऊतकों के समाशोधन पर ध्यान केंद्रित किया है, निष्क्रिय स्पष्टता किसी भी ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है।
रिश्तेदार ताकत और ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक की कमजोरियों साहित्य 13,17,22 में पहले से चर्चा की गई है, लेकिन सबसे स्पष्ट रूप से बाहर 23 में रखी हैं। निष्क्रिय स्पष्टता अच्छी तरह के प्रयोगों के लिए अनुकूल है, जहां नमूनों की बड़ी संख्या को एक साथ मंजूरी दे दी जा रही है और reproducibility बहुत महत्व का है। के लिए ऊतक मीटर की सुविधा एक हाइड्रोजेल के उपयोग के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिएultiple ऊतकों की जांच कर रही। इस रिपोर्ट में, एक छोटे से आणविक वजन डाई, DAPI, प्रदर्शन किया गया था, लेकिन एंटीबॉडी की जांच कर रही के कई दौर इस दृष्टिकोण के साथ भी हो सकता है।
दृष्टिकोण ऊपर वर्णित महत्वपूर्ण तरीके के एक जोड़े में हमारे पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 15 से भटक जाता है। सबसे पहले, वर्तमान दृष्टिकोण में, नमूनों intracardially हाइड्रोजेल साथ perfused नहीं थे। यह सच है कि समय से पहले ही हाइड्रोजेल ट्यूबिंग और छिड़काव उपकरण की सुइयों में भाजन कर सकते हैं, अपूर्ण और असंगत perfusions समाशोधन के लिए अग्रणी के कारण था। निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक (संधि) 17 में 3 मिमी मोटी ऊतक वर्गों - हालांकि एक 1 दिन ऊष्मायन 1 के लिए प्रयोग किया जाता है 7 दिनों के लिए हाइड्रोजेल में paraformaldehyde तय ऊतकों incubating, मूल स्पष्टता प्रोटोकॉल 14 के अनुरूप है। दूसरे, इस दृष्टिकोण एक से थोड़ा अधिक तापमान है कि पहले 15-17 सूचना पर लिपिड हटाने प्रदर्शन करती है। उच्चतर temperaturई लिपिड हटाने accelerates, लेकिन ऊतक अखंडता (पिघलने) की एक भयावह नुकसान की संभावना के खिलाफ संतुलित किया जाना चाहिए। 8 डिग्री सेल्सियस से ऊष्मायन तापमान (45 डिग्री सेल्सियस) लिपिड हटाने की प्रक्रिया के शेष के लिए (40 डिग्री सेल्सियस) 3 डिग्री सेल्सियस से 7 दिनों के लिए बढ़ रही है और तब तक, ऊतक समाशोधन त्वरित है, लेकिन की समवर्ती जोखिम के बिना ऊतक अखंडता का नुकसान। तापमान में यह वृद्धि मूल स्पष्टता प्रोटोकॉल में Electrophoretic ऊतक समाशोधन (ईटीसी) (50 डिग्री सेल्सियस) 14 के दौरान सूचना तापमान के साथ संगत है। इसके अलावा, transgenically व्यक्त fluorophores और न ही DAPI धुंधला में कमी की तीव्रता में कोई कमी पाई गई है।
Deoxygenation हाइड्रोजेल के निर्माण में एक महत्वपूर्ण कदम है। हाइड्रोजेल हाइड्रोजेल समाधान में घुलित ऑक्सीजन की उपस्थिति में भाजन सकता है, लेकिन हमारे हाथ में दर और polymerization की पूर्णता और अधिक चर deoxygenation बिना किया गया था। ज हैंydrogel भाजन नहीं है, सबसे आम कारण हाइड्रोजेल में ऑक्सीजन की उपस्थिति है।
ऑप्टिकल समाशोधन प्रक्रिया को लागू करने के लिए उल्लेखनीय आसान है, तथापि, माइक्रोस्कोपी है कि इस प्रकार काफी जटिल हो सकता है। महत्वपूर्ण महत्व के ऊतक छवि के लिए इस्तेमाल उद्देश्य हैं। एक उद्देश्य के काम दूरी एक ऊतक के नमूने में गहराई है कि यह कर सकते हैं छवि को परिभाषित करता है। 2 मिमी की दूरी काम के साथ एक उद्देश्य केवल छवि एक नमूना में 2 मिमी, इसलिए एक उद्देश्य के काम दूरी नमूना की मोटाई से अधिक क्रम में छवि के लिए यह पूरी तरह से होना चाहिए कर सकते हैं। इसी तरह, एक उद्देश्य के संख्यात्मक एपर्चर एक सीमा होती है कि यह दोनों में विमान और ऑप्टिकल वर्गों है कि यह सार्थक प्राप्त कर सकते हैं की मोटाई को हल कर सकते हैं सुविधाओं के आकार देता है। चयनात्मक विमान रोशनी माइक्रोस्कोपी (SPIM) और प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी (एल एस एम) रोशनी की प्रकृति द्वारा पर ऑप्टिकल अनुभाग मोटाई सीमा को पार कर सकते हैं, लेकिन इन माइक्रोcopes व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। उच्च संख्यात्मक एपर्चर, बड़े काम दूरी उद्देश्यों दुर्लभ और महंगे हैं, लेकिन बड़े ऑप्टिकली को मंजूरी दे दी वर्गों से उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए आवश्यक हैं।
एक बार जब छवियों का अधिग्रहण किया गया है, वे अक्सर बहुत बड़े हैं, एक कम संकल्प के लिए कई सौ एमबी से लेकर (दोनों और जेड दिशा-विमान में) एक एल एस एम पर एकत्र एक उच्च संकल्प छवि के लिए कुछ टीबी के लिए छवि। छवि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल कंप्यूटर न केवल भंडारण का एक बड़ा सौदा है, लेकिन छवि प्रसंस्करण के लिए रैंडम एक्सेस मेमोरी (रैम) की बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। बड़े ऑप्टिकली को मंजूरी दे दी छवि मात्रा का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर संकुल अमीरा, Imaris, और ImageJ 14-16 शामिल हैं।
इस दृष्टिकोण की सीमाओं के बीच, निष्क्रिय स्पष्टता अन्य ऑप्टिकल समाशोधन दृष्टिकोण से भी ऊतकों स्पष्ट करने के लिए और अधिक समय की आवश्यकता है। ऊतक की मात्रा घटाना यह छोटे टुकड़ों में trimming या यह सेक्शनिंग एसेल सकते द्वारा मंजूरी दे दी होerate लिपिड को हटाने की। इसके अलावा, हाइड्रोजेल में paraformaldehyde की एकाग्रता में कमी के बदले कमी crosslinking में और, हाइड्रोजेल में छेद के आकार में वृद्धि होगी, और अधिक तेजी से समाशोधन 17 के लिए अग्रणी है, हालांकि यह अधिक से अधिक ऊतक विस्तार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, अलग-अलग प्रयोगकर्ताओं पा सकते हैं कि यह समाशोधन में कमी के लायक है पहर। इसके अलावा, एक समाशोधन एजेंट के रूप में TDE के साथ संयुक्त, समग्र ऊतक विस्तार की मात्रा सीमित हो सकता है।
हालांकि इस रिपोर्ट के छोटे आणविक वजन रंगों के उपयोग का वर्णन करता है, एंटीबॉडी की जांच के लिए एक बहुत ही स्वाभाविक अगले कदम है। हाइड्रोजेल की उपस्थिति न केवल मंजूरी दे दी ऊतकों को भौतिक सहायता प्रदान करता है, लेकिन यह भी एंटीबॉडी के प्रवेश के ऊतकों में गहरी के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है। एक्रिलामाइड एकाग्रता घटाना या paraformaldehyde एकाग्रता हाइड्रोजेल में छेद के आकार में वृद्धि होगी, को सुविधाजनक बनाने (और इस प्रकार में तेजी) एंटीबॉडी प्रवेश 17 है, लेकिन इस Tiss पर एक हानिकारक प्रभाव पड़ता हैUE विस्तार। फिर भी, एंटीबॉडी के ऊतकों के ब्लॉक की जांच कर रही मूल रिपोर्ट 14 में वर्णित एक्रिलामाइड और paraformaldehyde सांद्रता का उपयोग कर कुछ हफ़्ते में दिन और पूरे दिमाग के एक मामले में पूरा किया जा सकता है।
ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक से एक मस्तिष्क में गहराई से देखने के लिए, इसकी संरचना और समारोह की समझ को आगे बढ़ाने की अनुमति है। इन नए उपकरणों के शोधकर्ताओं सेलुलर और आणविक प्रस्तावों पर मस्तिष्क कल्पना करने के लिए सक्षम, अंगों के इस सबसे जटिल के बारे में हमारी समझ बढ़ती जाएगी।
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Acknowledgments
इस काम के लिए उदारता से मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक (एनआईएच / NINDS) अनुदान 1R01NS086981 और कॉनरोड एन हिल्टन फाउंडेशन के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। हम confocal माइक्रोस्कोपी के साथ उनके अमूल्य सहायता के लिए डॉ लौरेंत Bentolila और डॉ मैथ्यू Schibler धन्यवाद। हम उन है कि स्पष्टता फोरम (http://forum.claritytechniques.org) के लिए योगदान दिया धन्यवाद। हम विशेष रूप से इस आकर्षक तकनीक सिखाने के लिए अपनी प्रयोगशाला को खोलने के लिए डॉ कार्ल Deisseroth धन्यवाद। लेखकों ब्रेन मैपिंग चिकित्सा अनुसंधान संगठन, ब्रेन मैपिंग समर्थन फाउंडेशन, पियर्सन-लोवेलास फाउंडेशन, Ahmanson फाउंडेशन, कैपिटल ग्रुप कंपनियों चैरिटेबल फाउंडेशन, विलियम एम और लिंडा आर Dietel परोपकारी कोष, और Northstar कोष से उदार सहायता के लिए आभारी हैं । अनुसंधान इस प्रकाशन की रिपोर्ट में भी आंशिक रूप से अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा और राष्ट्र के निदेशक के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गयाके तहत पुरस्कार संख्या C06RR012169, C06RR015431, और S10OD011939 स्वास्थ्य के अल संस्थानों। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | buffers |
| 32% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | perfusion and hydrogel |
| 2,2'-thiodiethanol (TDE) | Sigma-Aldrich | 166782-500G | refractive index matching solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | hydrogel |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | clearing buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | clearing buffer |
| Sodium hydroxide | Fisher | 55255-1 | buffers |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 52002-100G | preservative |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500G | buffers |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393-50KU | perfusion |
| Sodium nitrate | Fisher | BP360-500 | perfusion |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | nuclear stain |
| 99.9% isoflurane | Phoenix | 57319-559-06 | anesthetic |
| Hydrocholoric acid | Fisher | A1445-500 | buffers |
| Glass bottom dish | Willco | HBSB-5040 | Willco dishes |
| Reusable adhesive | Bostick | 371351 | Blu-Tack |
| Silicon elastomer | World Precision Instruments | KWIK-CAST | Kwik-Cast |
| Lint-free wipe | Kimberly-Clark | 34120 | KimWipe |
| Mouse brain matrix | Roboz | SA-2175 | sectioning tissue |
| Matrix blades | Roboz | RS-9887 | sectioning tissue |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-24 | pefusion |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 | microscopy |
| Imaging software | Leica | LAS AF | microscopy |
References
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
- Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
- MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
- Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
- Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808 (2015).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
- Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848 (2012).
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580 (2015).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).
