Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af multifoton mikroskopi til at udføre længere tid-lapse billeddannelse af multicellulære interaktioner i realtid, in vivo ved enkelt celle opløsning.
Introduction
Udbredelse af tumorceller fra primære brysttumor har vist sig at inddrage ikke kun tumorceller, men vært stromale celler, herunder makrofager og endotelceller. Endvidere tumorvaskulatur er unormal med forøget permeabilitet 1. Således bestemme, hvor tumorceller, makrofager og endotelceller interagerer at mediere vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation i den primære tumor mikromiljø er vigtig for forståelsen metastase. Forståelse kinetikken af vaskulær permeabilitet, tumor celle intravasation og den underliggende signalering mekanisme flercellede interaktioner i tumoren mikromiljø kan give afgørende oplysninger i udvikling og administration af anti-behandlinger mod kræft.
Det primære middel til at studere tumor vaskulær permeabilitet in vivo har været målingen af ekstravaskulære farvestoffer, såsom Evans blue 2, højmolekylære dextraner (155 kDa)3 og fluorophor eller radiotracer-konjugerede proteiner (herunder albumin) 4 ved faste tidspunkter efter injektion af farvestoffet. Forbedringer i mikroskopi, har dyremodeller og fluorescerende farvestoffer aktiveret visualisering af cellulære processer og vaskulær permeabilitet i levende dyr ved intravital mikroskopi 5.
Levende dyr billeddannelse med købet af statiske billeder eller kort tid-lapse-sekvenser over flere tidspunkter ikke giver mulighed for det fuldstændig forståelse af dynamiske begivenheder i tumoren mikromiljø 6,7. Faktisk statisk billede erhvervelse i løbet af 24 timer viste, at tumorvaskulatur er utæt, men dynamikken i vaskulær permeabilitet blev ikke observeret 6. Således extended kontinuert tid-lapse billeddannelse op til 12 timer indfanger kinetikken for dynamiske begivenheder i tumormikromiljøet.
Denne protokol beskriver anvendelsen af extended time-lapse multiphotpå intravital mikroskopi for at studere dynamiske flercellede begivenheder i tumormikromiljøet. Flere celletyper i tumormikromiljøet er mærket med injicerbare farvestoffer eller ved at anvende transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner. Ved hjælp af en halevene kateter kan injiceres vaskulære farvestoffer eller proteiner efter begyndelsen af billeddannelse til at erhverve kinetiske data af multicellulære begivenheder i tumormikromiljøet. For levende celler den brysttumor er eksponeret gennem den kirurgiske forberedelse af en hudlap. Billeder er erhvervet i op til 12 timer ved hjælp af en multifoton mikroskop udstyret med flere fotomultiplikatorrør (PMT) detektorer 8. Ved hjælp af passende filtre, en subtraktion algoritme giver 4 PMT-detektorer til at erhverve 5 fluorescerende signaler i tumor mikromiljø samtidigt 9. Høj opløsning multifoton intravital mikroskopi indfanger enkelt celle opløsning billeddannelse af tumor-stroma interaktioner i tumormikromiljøet, hvilket fører til en bedre understanding af vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation 10-13. Specifikt udvidede intravital imaging afslørede stærkt lokaliseret, forbigående vaskulær permeabilitet hændelser, der forekommer selektivt ved steder for interaktion mellem en tumorcelle, en makrofag og en endotelcelle (defineret som tumormikromiljøet af metastase, TMEM 14) 13. Endvidere tumorcelle intravasation forekommer kun på TMEM og er rumligt og tidsligt korreleret med vaskulær permeabilitet 13. Enkelt celle opløsning af dynamikken i disse begivenheder blev muliggjort gennem anvendelse af længere tid-lapse multifoton mikroskopi af fluorescens-mærkede celler i tumor mikromiljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne procedurer skal udføres i overensstemmelse med retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse fra Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Generering fluorescensmærkede Tumorer og tumor-associerede makrofager
- Generere fluorescensmærkede tumorceller ved at krydse den spontane, autokton, gensplejset mus brystcancer model, hvor musebrysttumorvirus lange terminale gentagelse driver polyoma middle T-antigen (MMTV-PyMT) med transgene mus med fluorescerende reportere [dvs forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP), forstærket cyan fluorescerende protein (ECFP) eller Dendra2] 8,9.
- Fluorescens label makrofager i PyMT dyr med fluorescensmærket tumorceller ved at krydse genmanipulerede musemodeller med myeloid- og macrophage- specifikke fluorescerende reportere [dvs MacGreen 15 eller MacBlue mus Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- Alternativt generere fluorescensmærkede tumorer gennem ortotopisk transplantation af fluorescensmærkede PyMT tumorceller (syngene), humane brystcancercellelinier eller primære human patient afledte tumorer (xenografter) 11,17.
- Implantatet fluorescensmærket PyMT tumorceller i syngene mus med fluorescerende protein-mærkede myeloide celler for at generere dyr med fluorescensmærkede tumorceller og myeloide celler 13.
- Injicer 100 pi 10 mg / kg fluorescerende 70 kDa dextran ved intravenøs (iv) halevene i svær kombineret immundefekt (SCID) mus med xenotransplantattumorer af humane cellelinier eller patient-afledt primære tumorer til fluorescens label makrofager 2 timer før starten af intravital billeddannelse.
2. Mikroskop Opsætning og Imaging Forberedelse
Bemærk: Denne procedure beskriver opsætningenfor intravital billeddannelse på en multifoton mikroskop 8.
- Tænd alle mikroskop og laser komponenter, herunder to-foton lasere og detektorer.
- Slå opvarmning boks til 30 ° C forvarmningen scenen. Dette trin er kritisk for at opretholde fysiologisk temperatur af dyret.
- Til brug på et omvendt mikroskop sted den specialfremstillet fase indsats på mikroskopet scenen. Den specielle indsats er et ark 1/8 "tyk aluminium bearbejdes til at passe i den fase insert plads og med en 1" diameter gennemgående hul i midten til billeddannelse.
- Tør mikroskopbordet og scene insert med 70% ethanol og lufttør.
- Placer en stor dråbe vand på 20X, 1,05 NA mikroskop mål at bevare optisk kontakt med dækglasset.
- Placer dækglas (# 1.5 tykkelse) over imaging-porten på mikroskopet scenen indsatsen. Fastgør på plads med lab tape.
- Brug en hulning til punch et 2 cm x 2 cm hulpå en fleksibel gummipude og placer gummipude på mikroskopbordet med hullet i puden på linie med hullet i den tilpassede fase insert.
3. Udarbejdelse af Tail Vein kateter og reagenser til injektion under Imaging
- Skær en 30 cm længde af polyethylen (PE) rør.
- Med pincet, flytte metal nål af en 31 G nål frem og tilbage, indtil det brækker af plasten montering.
- Med pincet, indsætte den stumpe ende af den fritliggende nål i PE rør.
- Sæt en 31 G nål ind i den anden ende af PE rør.
- Fyld en 1 ml sprøjte med sterilt phosphatpufret saltvand (PBS) og indsætte det i 31 G nål og skylle al luft ud af slangen og nål med PBS. PBS anvendes til opretholdelse hydratisering og blod osmolaritet 9,18, kan dog isotonisk saltvand også anvendes.
- Fyld en 1 ml sprøjte med 200 pi 3 mg / kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamin (TMR) Eller kvantepunkter for vaskulær mærkning.
- Forberede andre injicerbare proteiner, såsom en 165 aminosyre isoform af vaskulær endotel vækstfaktor A (VEGFA 165) i en 1 ml sprøjte og anbring på is. Injicer 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 ved en koncentration på 0,05 mg / ml.
4. Indsættelse af den indlagte Tail venekateter
- Sende dyret under anæstesi ved anvendelse af en induktion kammer med 5% isofluran med O 2 som bæregas.
- Overfør musen til det kirurgiske platform, når den er fuldt bedøvet, og reagerer ikke på en tå knivspids.
- Åben isofluran anæstesi linje til den kirurgiske platform, lukke anæstesi linje til induktion kammeret og placere næsekeglen over dyrets snude. Reducer isofluran fra 5% til 2,5%.
- Anvend oftalmologiske salve til øjnene af musen til at forebygge tørhed under anæstesi.
- Opvarm dyret under varmelampeni yderligere 2 min til øge omsætning i halen som cirkulation bremser med dyb anæstesi.
- Steriliser muse halevene med 70% ethanol.
- Spidsen af den 31 G nål fra kateteret konstrueret i afsnit 3 i den laterale halevene af dyret og skubbe nålen i 2-3 mm.
- Træk tilbage i sprøjten for at se blod, sikre kateteret placeres i halevenen.
- Brug en 1 cm længde lab tape placeret over nålen til at holde nålen på plads parallelt med venen langs længden af halen.
5. Hud Flap Kirurgisk Procedure til Expose den brysttumor
- Med dyret på den kirurgiske platform svaber tumoren og den ventrale overflade med 70% ethanol. Bemærk: Som beskrevet, er denne procedure ikke udføres helt aseptisk. For lange imaging sessioner, hvor infektion kan blive en forstyrrende faktor, anbefales det at bruge en ordentlig aseptisk teknik.
- Brug Sterile pincet, løfte den ventrale huden og med sterile sakse gøre en subkutan incision langs den ventrale midterlinjen ca. 1 cm i længde. Undgå at punktere peritoneum under indsnittet.
- skåret forsigtigt bindevæv fastgørelse mælkekirtlen og tumor væk fra peritoneum for at blotlægge brysttumor.
- Med saks og pincet, forsigtigt fjerne og skære væk fascia og fedt fra den eksponerede overflade af tumoren og samtidig bevare integriteten af tumorvaskulaturen og minimere blødning. Dette trin er kritisk for opretholdelsen tumoren arkitektur og vaskulaturen forsyning af tumoren.
6. Animal Forberedelse til Microscopy
- Overfør dyret for forvarmet billeddannelse fase med den udsatte tumor placeret på dækglasset på scenen afdækning over mikroskopobjektivet til billeddannelse. Sørge for at overføre halevenen kateteret forsigtigt med dyret for ikke at løsne nålen.
- Place the anæstesi næsekegle over dyrets snude at opretholde anæstesi sæt til 3% isofluran.
- Placer dyret så tumoren hviler i hullet af gummipladen og får kontakt med dækglas.
- Brug to gummipuder til hold forsigtigt tumor på plads og fastgør dem til mikroskopet scenen med lab tape for at reducere bevægelse under erhvervelse billede.
- Fylde kammeret fra gummipuden med PBS for at holde vævet hydreret og opretholde optisk kontakt med dækglas.
- Start overvågning dyrets vitale tegn med et pulsoximeter sonde. Vedhæfte et klip sensor til låret af dyret. Alternativt kan en krave, der er udformet til at passe omkring halsen kan anvendes.
- Placer varmekammer over dyret for at opretholde 30 ° C 20.
- reducere langsomt niveauet af isofluran til 0,5-1% for at opretholde anæstesi og vedligeholde blodstrøm.
7. Image Acquisition og Injektion af fluorescerskellige Farvestoffer og injicerbare Proteiner
- Brug af mikroskop okular fokus på de fluorescerende tumorceller på overfladen af tumoren den.
- Vælg et interesseområde ved at finde områder med strømmende blodkar. Udvælgelsen af et område af interesse med strømmende blodkar er kritisk for vurdering tumorvaskulatur.
- Når der er valgt en region af interesse skifte mikroskop i multifoton billedtilstand.
- Indstil de øvre og nedre grænser for en z-serie. Indstil den øvre grænse for z-serien ved hjælp af fokus justeringsanordningen at flytte målet til den ønskede startposition og klikke på Z-positionen knappen "Top". Bestem den øvre grænse for z-serien ved at visualisere fibernettet kollagen ved overfladen af tumoren i den anden harmoniske generation (SHG) kanal og observere, når ingen celler, men kun collagenfibre er synlige.
- Indstil den nedre grænse for z-serien ved at flytte målet til den ønskede billeddannelse dybde (typically 50-150 um) og klikke på Z-position "Bottom" knappen.
- Indstil trin størrelse ved at skrive den ønskede værdi i trin størrelse feltet. Bestem skridt størrelse baseret på hensynet til opløsning og erhvervelse tid (typisk 2 um anvendes til høj opløsning 3D rekonstruktion og 5 um andet).
- Indstil time-lapse interval ved at skifte til Time-Lapse panel og indtaste den ønskede bortfalder tid i Time-Lapse felt. For optimal tidsmæssige opløsning indstille tidsintervallet til 0 sek til kontinuerlig billeddannelse. Bemærk: For lang tid-lapse imaging anbefales det at indstille tidsintervallet til 10 sek mellem opkøb for at genopbygge det mål fordybelse væske.
- Når parametrene for billedbehandling er fastlagt, langsomt injicere 155 kDa dextran-TMR.
- Fjern sprøjten med PBS i halevenen kateteret og erstatte med den sprøjte, der indeholder 155 kDa dextran-TMR pas på ikke at indføre nogen bobler i line.
- Injicer langsomt 155 kDa dextran-TMR i musen, med en maksimal volumen på 200 pi, og erstatte sprøjten med sprøjte indeholdende PBS. KRITISK STEP: Udfør injektionen langsomt og tage forholdsregler for at undgå at få løsning uden for venen.
- Start købet af Z-stack time-lapse imaging ved at klikke på Z-Stack og time-lapse knapper til at presse dem og derefter klikke på knappen rekord.
- Hvis andre fluorescerende dextraner, dvs 10 kDa dextran-fluorescein (FITC), eller proteiner, dvs VEGFA 165, er blevet forberedt på forhånd, injicere dem efter starten af billedoptagelse i = 0 min start.
- Fjern sprøjten med PBS i halevenen kateteret og erstatte med den sprøjte, der indeholder 10 kDa dextran-FITC eller VEGFA 165 pas på ikke at indføre nogen bobler i linjen.
- Injicer langsomt injectables i musen gennem halevenen kateteretog erstatte sprøjten med en sprøjte indeholdende PBS.
- Hver 30-45 min, langsomt injicere 50 pi PBS eller saltvand for at opretholde hydrering af dyret.
8. Eutanasi
- Ved afslutningen af købet billede, aflive dyret.
- Øg isofluran til 5%.
- Hold dyret under 5% isofluran indtil 30 sek efter at den ophører med at trække vejret og fjerne dyret fra scenen.
- Udfør cervikal dislokation at sikre fuldstændig eutanasi.
9. Billedbehandling
- Anskaf billeder på 16-bit TIFF-filer for hver enkelt kanal på hvert tidspunkt og spar sekventielt.
- Udfør adskillelse af spektral overlapning (dvs. GFP og CFP), eliminering af xy afdrift og frembringelsen af film fra time-lapse sekvenser under anvendelse af etablerede fremgangsmåder i ImageJ 9. Udfør 3D overflade rekonstruktioner af billeder med høj opløsning 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvidet tid-lapse intravital mikroskopi muliggør enkelt celle opløsning billeddannelse af flercellede processer i tumor mikromiljø. Ved fluorescens mærkning tumorceller, makrofager, det vaskulære rum, og visualisere netværket kollagen fiber ved hjælp af den anden harmoniske generation signal, er flere rum i tumoren mikromiljø samtidig spores under billedbehandling. Tumorceller mærket med fluorescerende proteiner kan genereres i transgene mus som det er sket i MMTV-PyMT-Dendra2 mus, med brysttumorceller mærket med Dendra2 (figur 1A). Ved at krydse disse transgene mus med Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP mus, som har makrofager mærket med ECFP er begge tumorceller og makrofager mærket i MMTV-PyMT mus. Med den tosidede strategi med tumorceller og makrofager mærkning, kan den direkte interaktion af de to celletyper visualiseres i realtid (figur 1A). Derudover kan humane brystcancerceller linjer eller patient-afledte tumorceller transduceret med GFP anvendes til mærkning tumorceller. Makrofager kan mærkes under anvendelse af fluorescerende mærkede 70 kDa dextran som akkumuleres i de fagocytiske makrofager (figur 1B). Disse metoder har fremmet studiet af dynamiske multicellulære begivenheder såsom tumorcelle-makrofag streaming motilitet, vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation. At visualisere ændringer i tumor vaskulær permeabilitet, en fluorescens-mærket højmolekylær dextran (er 155 kDa eller mere anbefales 9,13,21,22) eller quantum dots til at mærke det vaskulære rum (figur 1). 155 kDa dextran eller kvantepunkter er store nok, at de ikke let diffundere gennem interendothelial rum 23.
Kontinuerlig høj opløsning billeddannelse letter indfangning af vaskulære permeabilitet begivenheder og denkvantificering af kinetikken af dextran ekstravasation og clearance på TMEM (figur 2 og Movie 1). Da det vaskulære rum let defineret af 155 kDa dextran ved indledningen af time-lapse-sekvens (som i 0 'i figur 2) ekstravaskulære fluorescerende dextran kan kvantificeres i hver ramme af time-lapse-sekvens. Figur 2 og Movie 1 demonstrere ekstravasation af 155 kDa dextran-TMR injiceres gennem en hale vene kateter i en MMTV-PyMT-Dendra2; Csf1r-CFP mus. Dendra2-mærkede tumorceller (grøn) og CFP-mærkede makrofager (cyan) bruges til at identificere TMEM i levende dyr. Den TMEM struktur ved stedet for vaskulær permeabilitet er skitseret i en hvid boks. Det vaskulære rum er mærket med 155 kDa dextran-TMR (rød) til at visualisere strømmende vaskulatur og ekstravasation af vaskulære indhold under begivenheder af vaskulær permeabilitet. Toppen af 155 kDa dextran-TMR ekstravasationi figur 2 ses mellem 29 'og 34'. Ekstravaskulære dextran ses på den hvide pilespids i de øverste paneler og på den røde pilespids i de lavere paneler, der kun viser kanalen for den 155 kDa dextran-TMR. Den 155 kDa dextran-TMR rydder fra vævet og ses som et fald i det ekstravaskulære TMR-signalet, som det ses ved 97 'i figur 2. Efter udarbejdelsen af time-lapse-sekvens i ImageJ ekstravaskulære dextran kvantificeres.
Ud over at observere spontane begivenheder i tumormikromiljøet, er det vigtigt at undersøge den underliggende molekylære mekanisme af de identificerede fænomener. Injektion yderligere vaskulære farvestoffer eller proteiner til inducerer vaskulær permeabilitet kan give indsigt i de signaleringsbegivenheder regulerer vaskulær permeabilitet. Figur 3 viser forskellen i ekstravasation af 10 kDa dextran-FITC (grøn) og 155 kDa dextran-TMR (rød).Høj molekylvægt 155 kDa dextran-TMR administreres umiddelbart inden starten af time-lapse billeddannelse. Fem Z-stakke er erhvervet i time-lapse-sekvens for at angive en baseline før 10 kDa dextran-FITC injiceres. Efter erhvervelse af det 5. Z-stable 10 kDa dextran-FITC administreres gennem halevenen kateteret uden at afbryde købet billede. Det dextran-FITC ses ind i vaskulaturen med øjeblikkelig ekstravasation mens 155 kDa dextran-TMR forbliver begrænset til det vaskulære rum (figur 3, 0 'og 6'). Den 10 kDa dextran-FITC helt ekstravaserer fra blodkarret og sender fra væv der forlader 155 kDa dextran-TMR i blodkarret (figur 3 som set ved 56 'og Movie 2). Ved hjælp af en tidspunkt fra før injektion, kan kinetikken af 10 kDa dextran-FITC ekstravasation let sammenlignet med 155 kDa dextran-TMR 13. Den umiddelbare ekstravasation af 10 kDa dextren-FITC efter injektion er væsentlig forskellig fra den tilbageholdelse af 155 kDa dextran-TMR i vaskulaturen og de spontane vaskulær permeabilitet begivenheder 13. Yderligere eksperimentelle kontroller kan udføres herunder inducere vaskulær permeabilitet gennem den mekaniske afbrydelse af endotelet eller gennem VEGFA 165 medieret permeabilitet 13. Kinetikken for ekstravasation af 155 kDa dextran-TMR af spontane permeabilitet begivenheder kan sammenlignes med 10 kDa dextran og andre midler til at inducere vaskulær permeabilitet til at forstå de begivenheder og signaler, der er involveret i vaskulær permeabilitet begivenheder i tumormikromiljøet.
Figur 1. Strategier til mærkning celler og vaskulaturen i tumoren mikromiljø. (A) transgene MMTV-PyMT mus med tumorceller mærket med Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) og makrofager mærket med FFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumorvaskulatur er mærket med 155 kDa dextran-TMR administreres ved halevene kateter. (B) TN1-GFP patient-afledt xenotransplantattumorer med makrofager mærket med 70 kDa dextran-Texas Red og vaskulatur mærket med kvanteprikker vha halevenen kateteret. Scale bar, 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Visualisere forbigående vaskulær permeabilitet. (A) Intravital mikroskopi (IVM) time-lapse af 155 kDa dextran-TMR (rød) ekstravasation og tumorceller intravasation på TMEM (hvid boks). Tumor celler mærket med Dendra2 (grøn, TC), makrofager med ECFP (cyan, M) og blood fartøjer med 155 kDa dextran-TMR (rød, BV). Blood permeabilitet fartøj sites (hvid pilespids). (B) isoleret 155 kDa dextran-TMR kanal. Røde pile markerer dextran ekstravasation (hvid). Scale bar, 50 um. Film af time-lapse mikroskopi i Movie 1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. visualisere flere fluorescensmærkede dextraner. IVM time-lapse af forskel i ekstravasation af 155 kDa dextran-TMR (rød) og 10 kDa dextran-FITC (grøn). Makrofager er mærket med ECFP (cyan) og kollagen i blåt (SHG). Den overlejring af røde 155 kDa dextran-TMR og grøn 10 kDa dextran-FITC i karrene er gul. Rapid ekstravasation af grøn 10 kDa dextran-FITC top er på 6 min. scale bar, 50 um. Film af time-lapse mikroskopi i Movie 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. Visualisering spontan forbigående vaskulær permeabilitet med tidsforskudt IVM. Time-lapse mikroskopi (som set i figur 2) af forbigående blodkar permeabilitet visualiseret i en transgen MMTV-PyMT mus med tumorceller mærket med Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) og makrofager mærket med FFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Ekstravasation af 155 kDa dextran-TMR ekstravasation (rød i venstre panel, hvid højre panel) er observeret ved filialen punkt tumor blodkar. Please klik her for at se video. (Højreklik for at downloade.)
Movie 2. Visualisering ekstravasation af flere fluorescensmærkede dextraner ved tidsforskudt IVM. Time-lapse mikroskopi (som set i figur 3) af ekstravasation af 155 kDa dextran-TMR (rød) og 10 kDa dextran-FITC (grøn) i en transgen MMTV-PyMT mus med makrofager mærket med FFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG af kollagen er mærket med blåt. Red 155 kDa dextran-TMR forbliver i tumorvaskulaturen for varigheden af time-lapse, mens den grønne 10 kDa dextran-FITC hurtigt ekstravaserer og sender fra blodkarrene og vævet. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellulære interaktioner, der forekommer spontant i tumormikromiljøet kan føre til ændringer i tumorcellemotilitet og intravasation. Høj opløsning intravital billeddannelse af levende tumorvæv tillader visualisering af multi-cellulære dynamik, der kan være meget forbigående 10,13,24. End-point in vivo assays eller time-lapse billeder erhvervet med diskrete tidspunkter kan give væsentlige oplysninger om molekylære mekanismer i processer i tumor mikromiljø. Intravital billeddannende undersøgelser er blevet anvendt til at undersøge processer i tumormikromiljøet, der sker over flere dage, skaber nye indsigt på angiogenese, tumorcellemigration og reaktion på lægemiddelbehandling 25-30. Dog kan disse assays ikke fange kinetikken af forbigående hændelser i tumormikromiljøet grund tidsskalaen for de processer, der undersøges 7,31. At skelne flere forbigående hændelser fra konstante processer er en betydelig annoncevantage af intravital mikroskopi.
Den intravital billeddannelse teknikken beskrevet i denne protokol muliggør direkte visualisering af cellulære dynamik i tumormikromiljøet ved fluorescens mærkning af multiple cellelinier og strukturer. Multifoton mikroskopi tillader større dybde af imaging løbet enkelt-foton konfokalmikroskopi med dybder på 300 um rutinemæssigt 24. Erhvervelse af Z-stakke af 50-100 um med 2 um trin er af høj nok opløsning til at generere 3D rekonstruktion af cellulære interaktioner, herunder fremspring, at celler gør som de strækker sig mod hinanden 13 og vaskulære strukturer i tumoren mikromiljø. Film og 3D rekonstruktioner fra time-lapse billedsekvenser tillader kvantificering af cellulære motilitet (hastighed og direktionalitet) og ved hjælp af ændringer i fluorescerende signal intensitet injicerbare farvestoffer, vaskulær permeabilitet.
For at fange spontaneous cellulære begivenheder antallet af individuelle billeder taget i en enkelt sekvens, skal optimeres for at tillade en hastighed på erhvervelse billede, der fanger kinetikken af begivenheden, men det dækker også en tilstrækkelig fysisk plads til at øge sandsynligheden for at indfange en individuel hændelse under en enkelt gang-lapse-sekvens. De rumlige billeddannende parametre, der skal overvejes, omfatter; antallet af skiver i en Z-stack, antallet af synsfelter med Z-stakke erhvervet og den aksiale afstand mellem de enkelte skiver i en Z-stack. Derfor indstille disse parametre, før du starter erhvervelse billedet er et afgørende skridt i protokollen. Ved hjælp af multifoton mikroskop, køb af 30 billeder (500 um x 500 um) i en z-serien er ca. 60 sek. Da varigheden af observerede tumorceller intravasation kan være i størrelsesordenen af minutter 13, erobre flere Z-stakke til 3D rekonstruktion af intravasation blev købet tidspunktet for en Z-stack begrænset to 60 sek. Derfor blev en enkelt synsfelt med op til 30 skiver i en Z-stack erhvervet. Da 3D rekonstruktion af celler blev ønsket, det aksiale trin mellem Z-skiver blev fastsat til 2 um. Dette giver mulighed for tilstrækkelige oplysninger om cellevolumener at give mulighed for 3D-rekonstruktion. Disse parametre skal optimeres for enhver mikroskop og billedbehandlingssoftware anvendes baseret på kinetikken af de live events at blive undersøgt.
Ændringen af gummi pad på mikroskopbordet og halevenen iv kateter har både mulighed for en væsentlig forøgelse af billeddannelse tid. Gummipuden danner en brønd for at muliggøre fastholdt hydratisering af tumoren og minimere XY afdrift på dækglas. Kombinationen af opvarmningskammeret med administrationen af PBS vedligeholder hydrering og fysiologisk temperatur af dyr. Disse forhold kombineret opretholde vaskulær perfusion og blodgennemstrømningen at muliggøre udvidet billeddannelse af cellulære begivenheder på tumor vasculature herunder vaskulær permeabilitet og tumorcelle intravasation.
En begrænsning ved denne teknik er antallet af fluorescerende mærker, der kan anvendes til at visualisere celler i tumoren mikromiljø. Generering transgene mus med yderligere celletyper (dvs. endothelceller, fibroblaster eller pericytes) indeholdende fluorescerende protein kan være vanskeligt og tidskrævende. Imidlertid kunne fremtidige potentielle anvendelser anvende en kombination af fluorescerende protein mærkning af stromale celletyper med implanterede tumorceller og 70 kDa dextran mærkning af makrofager. Ved at anvende en kombination af disse mærkning strategier og krydser transgene mus kan frembringes nye kombinationer af cellulære etiketter til at vurdere cellulær bevægelse og hændelser i tumoren mikromiljø.
I modsætning end-point eksperimenter baseret på immunfluorescensfarvning, høj opløsning intravital mikroskopi tillader visualisering af spontan og forbigåendebegivenheder i tumor mikromiljø. Den intravital imaging beskrevet her afslører nye begivenheder og cellulære interaktioner i tumor mikromiljø, som ikke kan tydes fra statiske billeder. Med roman oplysninger om de typer eller processer interagerende celler og kinetik for disse begivenheder, kan hypoteser genereres til at undersøge de signalveje, der driver disse interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af det amerikanske forsvarsministerium Breast Cancer Research Program under award nummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, og den integrerede Imaging Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
