Introduction
En nyligt udviklet high-throughput enkelt-celleassay teknik muliggør hidtil ukendte enzymer, der skal screenes fra en storstilet genetisk bibliotek baseret på deres funktionelle aktiviteter 1. På enkelt celle niveau, er proteiner, der regulerer transkription anvendes til at udløse reportergenekspression ved at registrere små molekyler, der er produceret som et resultat af et mål-enzymaktivitet. En tidlig fremgangsmåde involverede isolering af en phenol-nedbrydende operon fra Ralstonia eutropha E2 anvendelse af substratet-inducerede genetiske ekspression screening (SIGEX) fremgangsmåde, ved hvilken substratet inducerer ekspressionen af et reporter-protein 2. Nhar af Pseudomonas putida blev anvendt til at vælge benzaldehyd dehydrogenase 3, og LysG fra Corynebacterium glutamicum blev anvendt for high-throughput screening af en ny L-lysin-producerende stamme fra forskellige mutantbiblioteker 4.
Tidligere en genetisk enzym flotationng-system (GESS) blev foreslået som en generelt gældende screening platform 5. Dette system bruger phenolen-genkendende dimethylphenol regulator, DmpR, af P. putida. DmpR (E135K), og en mutant af DmpR, kan også anvendes i GESS (pNP-GESS) til påvisning af p-nitrophenol (pNP). I nærvær af målenzymer producerer phenolforbindelser, GESS i E. coli celler udsender et fluorescenssignal, giver mulighed for hurtig isolering af enkelte celler under anvendelse af en fluorescens-aktiveret cellesorterer (FACS). Men ekspressionen af metagenomisk enzym synes at være svagere end i konventionelle rekombinante enzymer; derfor blev GESS designet til at detektere phenolforbindelser med maksimal følsomhed ved at undersøge kombinationen af ribosomale bindingssted (RBS) og terminatorsekvenser sammen med optimal driftstilstand 5.
Et af de grundlæggende fordele ved GESS er, at denne enkelt metode teoretisk muliggør screening af ovis end 200 forskellige typer af enzymer i BRENDA databasen (tabel 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) ved blot at ansætte forskellige substrater. Det blev vist, cellulase, lipase, og kan påvises methyl parathion hydrolase (MPH) ved anvendelse pNP-GESS med passende substrater af p-nitrophenyl-butyrat, p-nitrophenyl-cellotrioside og methyl parathion, henholdsvis 5. For nylig blev det vist, at et alkalisk phosphatase (AP), som er en af de hidtil ukendte enzymer identificeret ved anvendelse pNP-GESS, er den første termolabile AP findes i koldadapterede marine metagenomes 6.
Her er detaljerne i screeningsprocessen præsenteret med pNP-GESS afsløre aktiviteter tre forskellige typer af enzymes- lipase, cellulase, og alkalisk fosfatase -og hurtigt at identificere nye kandidatlande enzymer fra en metagenomisk bibliotek 5,6. Processerne omfatter metagenomet forbehandling med pNP-GESS og drift af en flow cytometri sorteringsanlæg. Mens de opnåede hits vil skulle sekventeret for yderligere identifikation, denne protokol dækker proceduren indtil trinnene enzymaktivitet bekræftelse ved anvendelse af flowcytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af metagenomisk Bibliotek med pNP-GESS
- Konstruer en metagenomisk bibliotek i E. coli med en fosmid vektor under anvendelse af en fosmid biblioteksproduktion kit ifølge producentens protokol 5.
- Portion 100 pi af biblioteket til opbevaring ved -70 ° C, hvilket er en kilde til metagenomisk bibliotekets celler.
Bemærk: Den optiske densitet af en prøve målt ved en bølgelængde på 600 nm (OD 600) i denne bibliotekets er cirka 100. - Optø 100 pi bestanden metagenomisk bibliotek på is og inokulering i en 500 ml kolbe indeholdende 50 ml Luria-Bertani (LB) og 12,5 ug / ml chloramphenicol, efterfulgt af 37 ° C inkubation i 2 timer.
- Cellerne høstes i et 50 ml konisk rør ved centrifugering ved 1.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C.
- Pellet resuspenderes hurtigt i 50 ml iskold destilleret vand (DW) og centrifugeres ved 1.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C igen.
- Resuspend pellet i 50 pi iskold DW med 10% (vol / vol) glycerol. Brug 50 pi af denne celle portion til elektroporering.
- Placer blandingen af elektrokompetente celler 50 pi og pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) i en iskold elektroporation cuvette og elektroporere (1,8 kV / cm, 25 uF) blandingen.
- Hurtigt tilføje 1 ml super optimal bouillon med katabolitrepression (SOC) medium og udeluk cellerne forsigtigt.
- Overfør cellerne i 14 ml rundbundet rør under anvendelse af en pipette og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Spred 500 pi de genvundne celler på en LB 20 x 20 cm firkantet plade indeholdende 12,5 pg / ml chloramphenicol og 50 ug / ml ampicillin. Inkuber plade ved 30 ° C i 12 timer.
- Skrab kolonier under anvendelse af en celleskraber og indsamle celler i en 50 ml konisk rør ved anvendelse af iskold celle lagringsmedier.
- Centrifuger ved 1.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Pellet resuspenderes i 10 ml iskold celle lagringsmedierat nå en OD 600 af 100.
- Aliquot 20 pi cellerne til opbevaring ved -70 ° C.
2. Fjernelse af falske positiver fra metagenomisk Bibliotek
- Optø bestanden metagenomisk bibliotekets celler (fra trin 1.13) indeholdende metagenomisk DNA fosmid og pGESS (E135K) på is.
- Pode 10 pi cellerne i 2 ml LB indeholdende 50 ug / ml ampicillin og 12,5 ug / ml chloramphenicol i et 14-ml rundbundet rør. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm i 4 timer.
- I mellemtiden, tænde for FACS maskine og åbne standard FACS-softwaren. Brug følgende indstillinger: dyse spids diameter, 70 um; Forward Scatter Samarbejdsområde (FSC-A) følsomhed, 300 V-logaritmisk forstærkning; Side Scatter Samarbejdsområde (SSC-A) følsomhed, 350 V-logaritmisk forstærkning; Fluoresceinisothiocyanat Area (FITC-A) følsomhed, 450 V-logaritmisk forstærkning; tærskel parameter, FSC-En værdi 5.
Bemærk: Typiske indstillinger er givetfor FACS enhed nævnt i tabellen of Materials. Juster indstillingerne for andre FACS-enheder. - Fortynde metagenomisk bibliotekets celler fra trin 2.2 ved tilsætning af 5 pi af prøven til en 5-ml rundbundet rør indeholdende 1 ml PBS.
- Placer den fortyndede bibliotek prøve på lastning porten på FACS instrument og klik på Load knappen på Acquisition Dashboard af FACS-softwaren.
- Juster begivenhed sats på 1.000 - 1.500 events / sek ved at klikke og styring af strømningshastigheden knapper på instrumentpanelet.
- Opret log skaleret FSC-A versus log skaleret SSC-A scatter plot på et globalt arbejdsark ved at klikke på Plot-knappen Dot i værktøjslinjen. Juster scatter porten R1 at omfatte de singlet begivenheder (bakteriel population) ved hjælp af knappen Polygon Gate i værktøjslinjen.
- Plot et histogram med celletal vs. log skaleret FITC-A i regnearket ved at klikke på Histogram knap. Derefter justeres FITC spænding fra CytomeFanen ter Indstillinger i vinduet Inspector tilsyn, således at toppen af den klokkeformede fordeling er mindre end 10 2 af FITC-A.
- Opret en log skaleret FSC-A vs. log FITC-Et plot ved at klikke på Dot Plot knappen på det globale arbejdsark. Indstil en sortering gate R2 på grunden ved hjælp af knappen Polygon Gate på værktøjet bar, så at porten er placeret mellem + 5% og -5% celler fra centrum af fordelingen (total 10% celler omkring toppen af klokke- formede kurve).
- Placer en samling rør indeholdende 1,2 ml LB indeholdende 50 ug / ml ampicillin og 12,5 ug / ml chloramphenicol ved udløbet af FACS instrument og sortere ud 10 6 celler opfylder både R1 og R2 gates.
- Fjern opsamlingsrøret, cap, og forsigtigt vortex.
3. metagenomisk Enzyme Screening
- Inkubér sorterede celler (fra trin 2.11) ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm, indtil OD600 når 0,5.
- Tilsæt 1 pi kopiere induktion løsning at amplificere intracellulære fosmid kopital. Inkubér cellerne i yderligere 3 timer ved 37 ° C under omrystning ved 250 rpm.
- For at fremstille celler til sortering, tilsættes 0,5 ml af de dyrkede celler og et passende substrat (p-nitrophenyl-acetat, p-nitrophenyl-β-D-cellobiosid eller phenyl fosfat) i en 14-ml rundbundet rør ved en slutkoncentration af 100 uM.
- For en kontrolprøve, tilsættes 0,5 ml af de dyrkede celler fra trin 3.2 i en 14-ml rundbundet rør. Tilsæt samme volumen af PBS som substratet volumen i trin 3.3.
- Inkuber de to prøver ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm i 3 timer.
- I mellemtiden forberede FACS maskine med de samme konfigurationer som trin 2.3.
- Tilsæt 5 pi af cellerne (for sortering) og kontrolceller til to 5 ml rundbundet rør indeholdende 1 ml PBS, hhv.
- Placer rør indeholdende kontrol celler på than lastning port af FACS og klik på Load knappen på Acquisition Dashboard af FACS-softwaren. Juster begivenhed Pris til 1.000 - 3.000 events / sek ved at styre strømningshastigheden knapper på instrumentbrættet.
- Opret log skaleret FSC-A versus log skaleret SSC-A scatter plot ved at klikke på Dot Plot knappen på det globale arbejdsark af softwaren og juster scatter porten R1 at omfatte de singlet begivenheder (bakteriel population) ved hjælp af knappen Polygon Gate på værktøjslinjen.
- Opret log skaleret FSC-A vs. log skaleret FITC-A scatter plot ved at klikke på Plot-knappen Dot i regnearket og angive en sortering gate R2 på grunden ved hjælp af knappen Polygon Gate på værktøjslinjen, så mindre end 0,1% af negative celler detekteres i R2 gate.
- Udskift kontrolprøven rør med sortering prøveglas, og juster begivenhed sats på 1.000 - 3.000 events / sek ved at kontrollere strømningshastigheden knapper på instrumentpanelet.
- Placer en opsamlingsrør indeholdende 0,5ml LB ved udløbet af FACS instrument og sortere ud 10 4 celler opfylder både R1 og R2 porte.
Bemærk: sorteringskriteriet kan variere fra top 0,1% til 5% af FITC-A i R2 gate. I denne protokol, blev top 1% celler indsamlet som positive. - Fjern opsamlingsrøret, cap, og forsigtigt vortex.
- Spred 0,5 ml opsamlede prøver på to agarplader (90 mm petriskåle) indeholdende LB, 50 ug / ml ampicillin, 12,5 ug / ml chloramphenicol og inkuber pladen ved 37 ° C natten over.
- Hvis det er nødvendigt, foretage yderligere runder af sortering til FITC-A berigelse ved at gentage trin 3.1-3.14.
4. Hit Valg og enzymaktivitet Bekræftelse
- Flowcytometrianalyse
- Fra den inkuberede pladen ved trin 3.14, vælg koloni viser ingen fluorescens under anvendelse af en koloni picker under observation af 488 nm bølgelængde på en LED illuminator.
- Pode den valgte koloni i en 14-ml round-bund rør indeholdende 2 ml LB indeholdende 50 ug / ml ampicillin og 12,5 ug / ml chloramphenicol ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm, indtil dens OD600 når 0,5.
- Tilsæt 2 pi kopiere induktion løsning at amplificere intracellulære fosmid kopital. Inkubér cellerne i yderligere 3 timer ved 37 ° C under omrystning ved 250 rpm.
- Forbered en 14 ml rundbundet rør og tilsæt 1 ml af de dyrkede celler (trin 4.1.3). Tilsæt en passende substrat (p-nitrophenyl acetat, s -nitrophenyl- β-D-cellobiosid eller phenyl phosphat) ved en slutkoncentration på 100 uM.
- For en kontrol, tilsæt 1 ml dyrkede celler fra trin 4.1.3 i en 14 ml rundbundet rør og tilsæt samme mængde PBS som substrat volumen i trin 4.1.4.
- Inkuber de to prøver ved 37 ° C under omrystning ved 200 rpm i 3 timer.
- I mellemtiden forbereder FACS maskine med samme konfigurationer som Trin 2.3.
- Tilsæt 5 pi af kontrol- og substrat behandlede celler til 5 ml rundbundet rør indeholdende 1 ml PBS, hhv.
- Placer rør indeholdende kontrol celler på lastning porten på FACS-enheden og klik på Load knappen på Acquisition Dashboard af FACS-softwaren. Juster begivenhed sats på 1.000 - 3.000 hændelser / sek ved hjælp Flow Rate knapper på instrumentbrættet.
- Klik på Acquisition knappen for at måle FITC-A.
- Erstat kontrolprøven rør med substratet behandlede prøve rør. Juster begivenhed sats på 1.000 - 3.000 hændelser / sek ved hjælp Flow Rate knapper på instrumentbrættet.
- Klik på Acquisition knappen for at måle FITC-A.
- Sammenlign fluorescensen af de to grupper af celler ved at plotte et histogram af celletal versus log skaleret FITC-A.
- Andre assays for at bekræfte enzymaktivitet
- For yderligere identifikation af de udvalgte enzym kandidater, ekstrakt fosmid DNA ved hjælp af standard ekstraktion proprocedurer fra de kommercielle udvinding kits og analysere nucleotidsekvensen, eller teste in vitro enzymaktiviteten 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De tre phenoliske substrater blev undersøgt for at identificere nye metagenomisk enzymer fra en metagenomet bibliotek af ocean-tidevandsenergi flad sedimenter i Taean, Sydkorea ved at følge den foreslåede protokol. For biblioteket konstruktion, gennemsnitlig 30 - blev 40 kb metagenom sekvenser indsat i fosmids, som er baseret på E. coli F faktor replikon og præsenteres som en enkelt kopi i en celle. Bemærk, at fosmids er ofte blevet brugt til at konstruere komplekse genomiske biblioteker på grund af deres stabile formering 8.
Figur 1 viser et kort rutediagram over screeningsprotokol herunder fjernelse af falske positiver med negativ sortering (Figur 1 A), efterfulgt af positiv hit selektion med R1 og R2 sortering porte (figur 1 B). Hits blev evalueret ved sammenligning af fluorescensen af prøverne med og uden substrater(Figur 1 C). I tilfælde af p-nitrophenylacetat medieret screening blev fem kandidater af lipase bekræftet hvor fluorescensen af substrat-behandlede celler var højere end for kontrolceller (figur 2 A). På trods af de brede fordelinger af de tre kandidater af cellulase i figur 2 B, de også viste klare forskelle i gennemsnitlig FITC intensitet befolkningerne. Fire phosphatase kandidater viste også høj fluorescens niveau sammenlignet med kontrolcellerne (figur 2 C). Jo mere fluorescens forskel mellem negative og kandidatens celler stærkere enzymaktiviteten kan udledes, da fluorescens reporter PNP-GESS viser kvantitative svar på phenol koncentrationer 5.
I denne protokol, kun fluorescens forskelle blev bekræftet ved hjælp af en flowcytometri men forskellige identifikation analyser kan anvendes ens nævnt i trin 4.2. Figur 3 viser eksemplet med AP identifikation 6. En udvalgt klon blandt syvogfyrre yderst fluorescerende kolonier fra screeningen blev sekventeret og en ORF af kandidat AP blev identificeret. ORF indsat i en plasmidvektor blev bekræftet at have AP-aktivitet med flowcytometri. I figur 3 hittet viser stærkere fluorescenssignal end de celler, der bærer tomme plasmid (negativ). Yderligere analyse af sekvens og in vitro enzymatisk aktivitet opdagede, at dette AP var meget ligner andre kendte APs i dens enzymatiske egenskaber undtagen høj katalytisk aktivitet ved lavere temperaturer (35 ° C) og inden for 15 min 6 en bemærkelsesværdig termisk ustabilitet (65 ° C) . Derudover screenede AP var sammenlignelig med kommercielt tilgængelige AP'er fjerne terminale fosfater fra kohæsive og stumpe ender af lineariseret plasmid-DNA 6.
Figur 1:. Multi Enzyme Screening Process (A) Fjernelse af falsk-positive celler, der viser fluorescens uden substrat. Sorteringsanlægget gate er placeret i midten af cellen befolkningstæthed således at porten omfatter 10% af de totale celler. (B) Sortering høj fluorescerende (FITC-A) celler (positive), der opfylder R1 og R2 gates i nærvær af et passende substrat. (C) Efter udvælgelse og enkelt celle isolation blev aktiviteten af kandidat-enzymer undersøgt med og uden substratet (benævnt W / og W / O-substrater, henholdsvis). Den klare forskel signalet mellem de to prøver indebærer fosmid vektor af cellerne indeholder mål genetisk information af interesse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: enzymaktivitet evaluering under anvendelse af flowcytometri metagenomisk enzym kandidater screenes ved pNP-GESS med tre forskellige substrater (A) p-nitrophenylacetat (pNPA), (B) p-nitrophenyl-β-D-cellobiosid (pNPG2), og. (C) phenyl phosphat. Alle kandidater viser klart signal forskel mellem celler med og uden substrat. Kontrol er de celler uden deres tilsvarende substrat behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: alkalisk phosphatase IDENTIFICERING. Venstre panel viser klart fluorescens forskel mellem de celler, der indeholder enzymet ramt og en tom plasmidvektor (negativ). Til højre er phosphatase assay af celler, der huser den phosphatase kandidat-gen i en plasmidvektor på LB-agar indeholdende 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat som et kolorimetrisk substrat vist. Blå kolonier indikerer, at de udvalgte celler indeholder metagenomisk gen kodende for en phosphatase. Se 6 for flere detaljer. Klik her for at se en større version af dette tal.
| EU-nummer | Beskrivelse | Antal p-nitrophenol producerende enzymer | Antal phenol producerer enzymer | |
| EF 1 </ Td> | 1.3 | Handler på CH-CH gruppe af donorer | - | 1 |
| oxidoreduktaser | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | Handler på parrede donorer med inkorporering eller | - | 2 | |
| reduktion af molekylært oxygen | ||||
| EF 2 | 2.3 | acyltransferaser | 1 | - |
| transferaser | 2.4 | glycosyltransferaser | 8 | - |
| 2.5 | Overførsel alkyl- eller arylgrupper, andet end methylgrupper | 1 | 1 | |
| 2.7 | Overførsel phosphorholdige grupper | 1 | 1 | |
| 2.8 | Overførsel svovlholdige grupper | 3 | 1 | |
| EF 3 | 3.1 | Lov om esterbindinger | 67 | 16 |
| hydrolaser | 3.2 | glycosylaser | 75 | 21 |
| 3.4 | Lov om peptidbindinger - peptidase | 26 | 4 | |
| 3,5 | Lov på carbon-nitrogen-bindinger, bortset peptidbindinger | 5 | 3 | |
| 3.6 | Lov om syreanhydrider | 4 | - | |
| 3.7 | Lov om carbon-carbon bindinger | 2 | - | |
| EF 4 | 4.1 | Carbon-carbon lyaser | - | 3 |
| lyaser | 4.2 | Carbon-ilt lyaser | 1 | - |
| 4.3 | Carbon-nitrogen lyaser | 1 | - | |
| Subtotal antal enzymer | 197 | 53 | ||
| Samlet antal enzymer (bortset overlappede enzymer) | 211 | |||
Tabel 1: Antal enzymer, der producerer p-nitrophenol eller Phenol fra BRENDA Database.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Øget produktion effektivitet biokatalysatorer er nøglen til succes for bio-kemiske industri 9 og metagenomet betragtes som en af de bedste naturlige enzym kilde. I denne forbindelse er det vigtigt at screene hidtil ukendte enzymer fra metagenomet hvor størstedelen af de genetiske ressourcer ikke er blevet udforsket 10. Adskillige screeningsmetoder er blevet udviklet som direkte opdage enzymprodukter hjælp transkriptionelle aktivatorer 11, 12, men disse teknikker kræver specifik metabolit-responsiv transkriptionel system. På den anden side, GESS er bredt anvendelig afhængigt af anvendelsen af phenol eller pNP mærkede substrater. Selv om de fleste af de rapporterede enzymer producerer phenol eller pnp forbindelser i BRENDA database (tabel 1), (herunder de tre eksempler i dette arbejde) tilhører hydrolasen (EF nummer 3) klasse enzymer, udforske mere forskelligartede phenoliske substrater og endda designe en kunstig substrat udsætte den formålrette enzymaktivitet, som alternativer af naturlige substrater, i væsentlig grad kan udvide anvendeligheden af screeningen systemet. Bemærk, at vælge en passende phenol eller pNP mærkede substrat er en af de afgørende trin i pNP-GESS anvendelse siden membranpermeabiliteten og cellulære virkning af substratet betydeligt påvirke screeningsprotokol. Her viser vi, at industrielt vigtige tre forskellige typer enzymer kan identificeres i en high-throughput måde under anvendelse af enkelt screening system.
Metoden med FACS, foruden den high-throughput screening af metagenomisk enzymer, kan også anvendes til engineering transkriptionelle regulatorer (TRS) for ændret TR specificitet. Et eksempel er en undersøgelse, hvor en AraC variant, der detekteres mevalonat stedet for arabinose blev isoleret under anvendelse af FACS og derefter anvendt til at screene celler, der producerer mevalonat 13. Desuden har ændringen af specificiteten af TRs tilladt for Furthis engineering af enzymaktivitet. Auto-regulerede TR, PcaU, blev manipuleret til at detektere 3,4-dihydroxybenzoat (34DHB) og derefter anvendt til at screene for dehydroshikimat dehydratase enzymer (AsbF) ved deres maksimale aktivitet konvertere endogen dehydroshikimat til 34DHB 14. Det grundlæggende koncept for disse undersøgelser svarer til den for pNP-GESS, eftersom pNP-GESS bruger en DmpR variant til påvisning pNP og viser høj-throughput ydeevne ved screening fra et storstilet genetisk bibliotek. Imidlertid kan specificitet engineering forårsage utilsigtede falske positiver blandt hits, da det er muligt at udløse reporter ekspression ved andre induktorer som følge af udvidet specificitet. Derfor ville det være ønskeligt at undersøge orthogonality af TR respons inden TR påføres. På den anden side kunne forøge følsomheden og dynamiske område af TR kompensere for falsk positiv generation. For eksempel blev følsomheden af GESS forbedret ved at indsætte optimerede RBS og terminator sequiner på i systemet. Falske positiver af screeningen systemet muligvis kommer fra fejl i den genetiske kredsløb, utilsigtede phenoliske kemikalier aktivering TR, heterogene cellevækst og gratis udbredelse af phenol eller pNP. De negative udvælgelsesprocesser af Steps 2.1 - 2.9 forventedes at fjerne falske positive celler frigiver fluorescens uden substrat behandling. Disse falske positive celler kan også reduceres ved at maksimere signal-støj-forholdet af den genetiske kredsløb. Sammen med RBS og terminator teknik, anvendelse af M9-glucose medier forbedrede signifikant signal (7 gange højere end LB-medium) i pNP-GESS 5 performance. Men, i denne protokol, blev LB brugt som et kompromis mellem det ukendte metagenomisk genekspression og GESS signal intensitet. Undersøge mere sarte betingelser for pNP-GESS cellevækst og substrat virkning i M9-glucose gør det muligt at forbedre signalintensiteten. Tæt regulering af reaktionstiden af substraterne, i trin 3.5, erogså vigtigt at forhindre falske positiver udløst af phenol eller pNP diffusion.
GESS fremmer ændringen af enzymfunktionen i transkriptionsmedieret reporter protein ekspression i en enkelt celle niveau, men den indirekte identifikation via reporter protein kunne være en af de indre begrænsninger. Så i vitro enzym-assay og LC / GC-MS-analyse af et produkt skal følges for konkret identifikation af en formodet enzym kandidat 6,7. Det er også muligt at bruge GESS uden behov for dyre FACS-analyse ved at knytte alternative reportere såsom antibiotiske resistensgener eller kromogene enzymer med fluorescerende reportere. For yderligere forbedring af Gess anvendelser er det nødvendigt at indføre en metode til at karakterisere enzymaktiviteten og identificere enzymerne i en high-throughput måde. Sammen med andre high-throughput teknologier, såsom næste generation sekventering, vil GESS være en udbredt strategi for protein og enzymig katalysator engineering i biologi-industri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
