Abstract
循环微RNA（miRNA）（无细胞的），从细胞释放到血流中。在循环的特定微小RNA的量已与一种疾病状态，并具有被用作疾病的生物标志物的潜力。用于使用基于染料的化学和液滴数字PCR技术循环微RNA定量的灵敏和准确的方法最近已开发。具体而言，使用锁核酸（LNA）为基础的miRNA特异性引物用绿色荧光DNA结合染料在相容的液滴数字PCR系统能够获得特定miRNA的绝对定量。在这里，我们描述了如何执行此技术，以评估在生物流体，例如血浆和血清的miRNA量，是可行和有效的。
Protocol
从血浆或血清中分离的microRNA
注意：血浆和血清制剂是循环的miRNA定量的相关步骤。存在用于血浆和血清制备没有优选的程序。唯一要考虑的重要的事情是，所有来自同一实验的样品必须使用完全相同的工作流程进行处理。从200μl的血清或血浆开始。总RNA可以从血清或血浆用市售试剂盒进行分离。
1，协议总RNA（miRNA的包括）隔离
- 在冰上解冻血清/血浆样本。
- 1毫升裂解试剂（ 如 ，Qiazol加）添加到200微升血清/血浆。
- 涡旋混匀，含在板凳上的匀浆在室温5分钟管。
- 从添加C的合成的miRNA CEL-MIR-39-3p的4.16纳米的解决方案的3微升线虫 。
- 加入200μl氯仿。摇动该管剧烈持续15秒。第广场在室温替补2分钟就电子管。
- 离心机以12,000 xg离心15分钟，在4℃，以获得相分离：上层水相含有的RNA。
- 水相转移到一个新的管，约700微升，避免任何白色相间的材料转移。
- 加入1ml的100％乙醇并通过倒置混合。
- 吸管向上700微升样品放入一个微型旋转柱置于2ml的收集管。盖上盖子，离心机在12000 XG为15秒。丢弃的流量通过。
- 重复使用剩余的样本这一步骤。
- 加入700μlBuffer RWT到微型离心柱，盖上盖子，离心15秒12,000 XG洗列。丢弃的流量通过。
- 吸取500微升缓冲液RPE到微型离心柱。盖上盖子，离心15秒12,000 RPM。丢弃的流量通过。再次重复此步骤。
- 离心全速微型旋转柱2分钟以干燥离心柱从膜残留的乙醇。
- 微型旋转柱转移至新的1.5 ml收集管和移液管35微升不含RNA酶的水在列的膜。
- 离心1分钟以12,000 xg离心以洗脱RNA。
- 储存在-80℃的RNA。
注意：由于RNA浓度不能精确确定的，使用固定的卷作为输入量的量度。
2.微小RNA反转录
- 解冻的逆转录（RT）试剂混合物成分：5×反应缓冲液，不含核酸酶的水。混合轻轻翻转冰上管和地点。在使用前，立即删除从冰箱中的酶混合物置于冰上。降速所有试剂。
- 如表1中所述制备在冰上对RT试剂混合物。制备至少10％的超过组合。
- 混合吹打反应，然后降速。
- 在42℃孵育60分钟。
- 热灭活的逆向工程＆本身酶为在95℃5分钟。
- 立即冷却至4℃。
- 存放在-20°C的基因。
3.稀释的cDNA
- 稀需要在无核酸酶的水计划ddPCR反应cDNA模板的量。稀释1:50和1之间的基因反应：500水，取决于目标miRNA的丰度。储存在-20℃下的稀释的cDNA。所述稀释的cDNA被证明为在-20℃至少3个月是稳定的。
4.产生液滴和PCR
注意：液滴生成应该在8个样品在同一时间内进行。技术重复不是必需的，因为这种技术12,15 .A无模板对照（NTC）的样品应当在每一个板中运行的高再现性，并为每个不同ddPCR条件。
- 解冻并平衡了主结构（ 例如 ，EvaGreen预混），微小RNA引物和cDNA在室温。
- 混合母液日oroughly通过倒转试管几次。降速所有试剂。
- 如表2中所述制备ddPCR组合。当执行多个ddPCR反应，制备ddPCR混合工作溶液。至少准备10％的超额组合。
- 一旦组装，调匀和降速ddPCR组合。
- 分配12微升ddPCR的混合到96孔PCR板或PCR管。
- 添加8微升稀释的cDNA模板的每个管/孔。
- 将液滴生成墨盒插入支架。
- 转移20微升每种制备的样品，以微滴发生器盒小心，同时避免空气在井的底部的气泡的样品孔（中间行）。
- 用70微升液滴生成油填充每个油井（下排）。
- 钩在盒保持器的垫片和插入液滴发生器。
- 盖上盖子，开始根据液滴代制造商的公关otocol。当液滴的一代已经完成，打开盖子，取出一次性垫圈。盒的顶部孔包含液滴。
- 吸管慢慢，平稳40微升的八个顶部孔（液滴）的内容到一个96孔PCR板中的一列。
- 转移液滴蒸发避免后立即密封带箔的PCR板。使用可刺穿箔片密封件是与液滴读者针相容。
- 密封板30分钟内开始热循环（PCR）。
- 根据表3进行循环协议。
5.阅读液滴
- 上电液滴读者。
- 从热循环仪，以液滴读者移动板。
- 放置含有PCR后液滴入盘保持器的底部的96孔PCR板。
- 放置在PCR板的板保持器的顶部。用力按下两个释放卡舌到固定支架中的PCR板。
- 开始从系统计算机软件。
- 单击设置来定义试验（绝对定量），然后单击Run启动液滴读数。
- 当液滴阅读完毕后，单击“分析”按钮，打开和分析数据。
- 使用2D振幅积在分析软件来选择阳性微滴（套索工具）（ 图1B）。
- 使用事件选项卡，检查阳性，总滴数。为18,000的总人数 - 21000飞沫通常与probeless ddPCR实现。
- 一旦正液滴被选择，导出使用来自浓度标签导出的.csv选项所述miRNA浓度值。
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Representative Results
可使用绿色荧光DNA结合染料和液滴数字PCR技术来确定每毫升的血浆或血清的特定miRNA的绝对量。 图1表示正极的液滴选择的过程中，它决定了最终的miRNA浓度（拷贝/微升）在由分析软件计算的扩增反应。血液中的每个miRNA的量是非常不同的，是一些miRNA族比其他人更丰富。使用在ddPCR反应1:50稀释的cDNA，可以得到正和负的液滴的足够数量。在正液滴饱和（ 例如 ，没有剩余的负液滴）的情况下，cDNA样本的进一步的稀释可能是必要的。
每一LNA的引物组应该被优化以液滴数字PCR系统上正常工作。对的miR-181A-5P优化过程是在图2中表示的具体而言，改变引物的量（通常在0.25的范围内-每ddPCR反应1微升）。和退火温度（通常在56的范围内- 60℃），它是可以选择的组合确定正和负的液滴之间的更好的分离。在的miR-181A-5P，60℃的退火温度和两个0.5和1μl的引物的量的情况下提供以液滴振幅而言更好的结果。
是可能发生的一组引物给出了一些非特异扩增，可能是由于引物二聚体的形成。当与循环的miRNA工作，从样品的正信号可能是非常低的，因此类似的非特异性信号。如果非特 异性靶扩增的“云”不与真实的信号（ 图1C）重叠，所述miRNA仍可定量仅选择所述真实积极的液滴。在这种情况下，NTC样品为液滴选择是必不可少的。所有被包含在相同的分析样品需要使用同样的方法和相同的ddPCR条件进行处理。
图1.积极液滴选择 。阳性液滴使用1D曲线（A）或执行围绕在二维图（B）中的正液滴云圆负液滴高于阈值的分析过程中手动选择。如果一些引物组给出了非特异性扩增，这是通过正液滴的第二云出现在阴性对照（无模板对照，NTC）样品（C）的证明。 “真正的”阳性仍然可以选择不包括在二维图中的非特异性信号。e.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2.引物优化无细胞的miRNA定量与Probeless ddPCR上部面板：使用4种不同的ddPCR条件的两个血浆样品（S1和S2）中的miR-181A-5P的定量。 MIR-181A-5P LNA的引物浓度（0.5和1微升）和退火温度（58和60℃）影响的正（蓝色）中的DNA-嵌入染料ddPCR的振幅和负（黑色）的液滴。可以得到在60℃下进行PCR，并使用0.5或1μl的引物对本miRNA的更好的分离。对照样品（NTC，无模板对照）没有正面滴，符合市场预期。中央板：在上述条件下的miR-181-5p的最终浓度。结果表示为在放大器每微升份fication反应。误差棒代表泊松95％置信区间。下图：上液滴（绿色）的总人数正滴（蓝色）的数量，请点击此处查看该图的放大版本。
| 试剂 | 体积（微升） |
| 5X反应缓冲液 | 4 |
| 不含核酸酶的水 | 11 |
| 酶混合物 | 2 |
| 模板总RNA | 3 |
| 总成交量 | 20 |
表1 - 逆转录试剂混合组件
| 试剂 | 体积（微升） |
| 2X DNA结合染料超混合液 | 10 |
| LNA引物 | 可变（0.5 - 1）* |
| 不含核酸酶的水 | 变量 |
| 稀释cDNA模板 | 8 |
| 总成交量 | 20 |
| *第一ddPCR反应应该是几样执行，建立底漆的最佳工作数量 | |
表2 - ddPCR试 剂混合组件
| 循环步骤 | 温度 | 时间 | 下降率 | 周期 |
| 激活酶 | 95℃ | 5分钟 | 〜2℃/秒 | 1 |
| 变性 | 95℃ | 30秒 | 40 | |
| 退火/延伸 | 60℃ | 1分钟 | ||
| 信号稳定 | 4℃ | 5分钟 | 1 | |
| 90℃ | 5分钟 | 1 | ||
| 保持（可选） | 4℃ | 无穷 | 1 | |
| 使用加热的盖设置为105℃，样品体积为40微升。 | ||||
表3 - 热循环条件液滴的数字PCR
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Discussion
循环miRNA是存在于血液中的浓度极低，而且可以从血浆和血清样品中提取的RNA的量是低的。因为这个原因，它们难以与其它技术，如微阵列和RNA测序量化。此外，还有在数据归一化的一般化缺乏协议和内源性“参考”微RNA在血液中的存在。在这种情况下，一个灵敏的技术，如微滴数字PCR，能够每毫升血清或血浆，即使非常低的计数的miRNA拷贝数的，是非常有吸引力的。我们配对该技术具有普遍性的cDNA系统，反向转录在一个反应全部循环的miRNA从而节省时间，最重要的是，RNA的材料。在我们的方法，特异度为固有的使用LNA的引物，相对于其他的解决方案时，16 miRNA的定量其中表现非常出色。
液滴数字PCR是终点测定法，允许靶基因的计算绝对浓度。不像定量PCR，扩增效率不足不影响最终ddPCR定量。因此，考虑到本比如血液样本中的PCR抑制剂的量，ddPCR提供用于循环核酸评估一个强大的工具。
由于其高灵敏度，该技术提供了一个足够的量化也不太丰富的miRNA，即使起始原料的量有限。另外，假设每个miRNA分子在cDNA分子反转录，我们可以计算出在1微升血浆/血清的绝对拷贝ddPCR反应值所得到的浓度乘以要稀释因子（145.83）。
所提出的工作流程可以在8-96的样品在一个时间容易地进行，从而提供了在CLINICA微RNA定量的可靠和时间有效的工具L个样本。滴数字PCR有可能成为核酸的一个必不可少的工具生物标志物评估，诊断设置，从而使液体活检从替补到床边的潜力。
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Acknowledgments
从意大利癌症研究协会（AIRC）为MF（MFAG 11676）和MN资金支持（特别节目分子临床肿瘤学 - 5千分数ñ9980，2010/15）和指令意大利教育部，大学和研究FIRB 2011年明尼苏达州（项目RBAPIIBYNP）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma |
| 100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG |
| Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | Kit for microRNA reverse transcription |
| MicroRNA LNA PCR primer set | Exiqon | 204000-206xxx and 2100000-21xxxxx | Primers for miRNA amplification inside droplets |
| QX200 droplet generator | BioRad | 186-4002 | Instrument used for droplet reading |
| QX200 droplet reader | BioRad | 186-4003 | Instrument used for droplet generation |
| QuantaSoft software | BioRad | 186-3007 | Software for data collection and analysis |
| PX1 PCR plate sealer | BioRad | 181-4000 | Plate sealer |
| DG8 droplet generator cartridges and gaskets | BioRad | 186-4008 | Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets |
| QX200 ddPCR EvaGreen supermix | BioRad | 186-4033/36 | PCR supermix |
| QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye | BioRad | 186-4005 | Oil for droplet generation |
References
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