基因组编辑在 Astyanax mexicanus使用转录因子样效应核酸酶（TALENS）

Summary

基因靶向诱变现在有可能在宽的范围内使用的基因组编辑技术生物体。在这里，我们演示了有针对性的基因突变的协议使用转录激活像Astyanax mexicanus，鱼品种，包括面鱼和cavefish效应核酸酶（TALENS）。

Abstract

识别进化变化背后的基因等位基因对于理解进化如何以及为什么发生至关重要。 为此，最近的许多工作都集中在确定各种物种性状进化的候选基因上。 然而，直到最近，对有趣的候选基因进行功能验证一直是一项挑战。 最近开发的基因工程工具使得纵各种生物体中的特定基因成为可能。 将这项技术应用于进化相关的生物体，将使人们对候选基因在进化中的作用有前所未有的了解。 Astyanax mexicanus （A. mexicanus） 是一种鱼类，有表生和洞穴生两种形式。 从祖先的表层鱼进化而来的多个独立的洞穴居住形式系，它们彼此互配并与表层鱼类互育，从而可以阐明洞穴特征的遗传基础。 A. mexicanus 已被用于许多进化研究，包括连锁分析以确定负责许多性状的候选基因。 因此，A. mexicanus 是应用基因组编辑来测试候选基因作用的理想系统。 在这里，我们报道了一种使用转录激活因子样效应核酸酶 （TALEN） 突变 A. mexicanus 表面基因的方法。 在 A. mexicanus 中使用 TALEN 进行基因组编辑已被用于产生色素沉着基因的突变。 该技术还可用于评估候选基因对在 A. mexicanus 洞穴形式中进化的许多其他性状的作用。

Introduction

了解性状进化的遗传基础是进化生物学家的一个重要研究目标。相当大的进展在查明位点特征的演变和背后这些位点（例如^1-3）内精确定位候选基因进行了。然而，在功能上测试这些基因的作用仍然具有挑战性用于研究性状的进化因为许多有机体当前不是遗传容易处理。基因组编辑技术问世已经大大增加了广泛的生物体的遗传操作性。转录活化剂-样效应核酸（TALENS）和群集定期相互间隔短回文重复序列（CRISPRs）已被用来产生在一个数生物体（例如^4-11）在基因靶向的突变。这些工具，应用到进化相关制度，有潜力彻底改变进化生物学家研究进化的遗传基础。

Astyanax mexicanus是鱼类的物种存在两种形式:多穴居形式（cavefish）河居住的表面形状（表面鱼）和A. mexicanus cavefish从表面鱼类祖先^（12综述）演变而来。 cavefish种群已经进化了许多特性，包括眼睛的损耗，减少或色素沉着的损失，增加了味蕾和颅神经丘和改变的号码行为，如办学行为的损失，增加侵略，在喂养姿势和亢进¹³的变化^-19。 Cavefish和表面鱼的间，和遗传作图实验已经进行识别位点和候选基因性状的洞穴^1,20-26。一些候选基因已经过测试，在细胞培养^1,19促进洞穴性状的职能作用，在其他物种中的²¹

Protocol

所有的动物程序是按照美国国立卫生研究院的指导方针和机构动物护理和使用委员会在爱荷华州立大学和马里兰大学获得批准。

1. TALEN设计

1. 输入所需的靶序列到TALEN设计网站。 （例如: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ）。输入选择间隔/复读数组的长度。
   1. 基因组序列拷贝到标有"序"框。
   2. 内"提供定制间隔/ RVD长度"选项卡中选择间隔长度和数组的长度。
      注:15个碱基对长度的间隔，重复15-17工作数组长度很好，使组装不太复杂。
2. 选择TALEN对。围绕一个独特的限制性酶位点而设计TALEN对允许通过限制酶的基因分型消化一个PCR产物。
3. 设计引物扩增周围使用的网站，如:引物的^30-32 TALEN目标站点的基因组区域。当用限制性酶进行基因分型，设计引物来扩增包含该限制酶位点只有一次的区域。因此建议该区域被放大和前TALEN施工，以确定存在于A.任何多态性测序要使用mexicanus实验室人口显微注射。

2. TALEN大会（从TALEN包协议修改^）....

Results

TALEN对注射导致的FokⅠ域的二聚的RVDS到特定的DNA核苷酸的结合，因此，产生双链断裂³⁹可通过非同源末端连接（NHEJ）进行修复。 NHEJ常常引入导致在插入或缺失（插入缺失）错误。插入缺失可以通过扩增包围TALEN目标位点的区域和消化与TALEN间隔区之内的切割的限制性酶将所得的扩增子进行识别。没有一个插入缺失的等位基因，而含有等位基因改变限制性内切酶靶序列将不能消化插入缺失，产生一限制酶抗性带（ 图2）将消化。

TALEN注射可以很可能导致A.等位基因基因突变mexicanus ^29。因此，一些表型可能在创始人鱼进行评估。对于例如，我们评估与TALENS目标OCA2，假设是负责的cavefish ^1,28多个白化人群白化病基因注入表面鱼色素沉着。我们发现在O.......

Discussion

大踏步近年来已取得一了解性状进化的遗传基础。虽然一些性状的进化底层候选基因已被确定，它由于缺乏最进化有趣物种遗传易处理的仍然是具有挑战性的，以测试在体内这些基因。这里，我们报告中的A.基因组编辑的方法mexicanus，使用一个物种，研究洞穴动物的进化。遗传图谱研究^1,21,23和候选基因方法^19,40确定了一些候选基因的性状在A.洞穴形式的演变mexicanus。近期cavefish基因组⁴¹出版物提供确定候选基因洞穴性状进化的附加 ​​功能强大的工具。许多测试这些候选基因的功能，需要技术来降低基因的表达。学习目前唯一的选择ING在A.降低基因表达mexicanus是通过使用吗啉的。然而，吗啉代基因敲除是短暂的，仅限于几天受精后，并且是不适合的成年动物，如像上学^17，摄食过度¹⁹和振动吸引力行为⁴²成人洞穴和表面鱼之间行为上的差异学习性状是有用的。基因，如那些可以使用TALENS制.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
设备
热循环仪
注射站
凝胶仪
拔针器
Nanodrop
名称	公司	目录号	评论
用品
据我们所知，除非另有说明
品Golden Gate TALEN和TAL效应器试剂盒2.0	Addgene	试剂盒#1000000024
Fisher BioReagents LB 琼脂、Miller（颗粒）	Fisher	BP9724-500
Fisher BioReagents 微生物培养基：LB 肉汤、Miller	Fisher	BP1426-500
Teknova TET-15 溶于 50% 乙醇	Teknova（通过 Fisher 订购）	50-843-314
大观霉素二盐酸盐，Fisher BioReagents	Fisher	BP2957-1
超级氨苄青霉素（1,000x溶液）	DNA Technologies	6060-1
ThermoScientific X-Gal 溶液，即用	Thermo Sci Fermentas Inc（通过 Fisher 订购）	FERR0941
IPTG，Fisher BioReagents	Fisher	BP1620-1
培养皿	Fisher	08-757-13
BsaI	New England Biolabs（通过 Fisher 订购）	50-812-203	使用 BsaI，而不是 BsaI-HF（如 Golden Gate TALEN 和 TAL 效应器试剂盒方案中所述）
BSA	New England Biolabs	提供限制性内切酶
10x T4 连接酶缓冲液	Promega（通过 Fisher 订购）	PR-C1263
GoTaq Green 预混液	Promega（通过 Fisher 订购）	PRM7123	可以使用其他 Taq，但应相应地调整反应
快速连接试剂盒	New England Biolabs（通过 Fisher 订购）	50-811-728	我们使用快速连接酶进行所有 TALEN 组装反应
One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌	Invitrogen	C4040-06	可以使用其他化学感受态细胞或自制感受态细胞
Esp 3I	Thermo Sci Fermentas Inc（通过 Fisher 订购FERER0451
质粒安全的ATP依赖性DNase	Epicentre（通过Fisher订购）	NC9046399
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	Qiagen试剂盒应用于初始质粒制备（如Golden Gate TALEN和TAL效应器试剂盒方案中所述）
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose	BioExpress	E-3119-125
Sac I	Promega（通过 Fisher 订购）	PR-R6061
mMESSAGE mMACHINE T3 转录试剂盒	Ambion	AM1348M
Rneasy MinElute 净化试剂盒	Qiagen	74204
NorthernMax-Gly 样品上样染料	Ambion（通过 Fisher 订购）	AM8551
Eliminase	Decon（通过 Fisher 订购）	04-355-32
Fisherbrand 一次性钠钙玻璃巴斯德移液器	Fisher	13-678-6B
标准玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100-4
微胶囊	Drummond Scientific Company	1-000-0010
用于 Femtojet 显微注射器的 Eppendorf Femtotips 微量进样器吸头	Eppendorf（通过 Fisher 订购）	E5242956003
氢氧化钠	Fisher	S318-500
Tris 碱	Fisher	BP152-1