光稳定的氰基染料连接到寡核苷酸上，通过能量转移来监测杂交过程。
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本文内容
摘要
摘要
在本实验方案中，我们演示了一种通过自动化固相合成结合标准亚磷酰胺化学方法合成2'-炔基修饰脱氧核糖核酸（DNA）链的方法。寡核苷酸在合成后通过铜催化的点击化学反应，使用两种新型光稳定的氰染料进行标记。文中描述了供体染料和受体染料的合成过程，均分为三个连续步骤完成。以DNA作为支架结构，当这两种染料通过杂交靠近时，会发生能量转移。因此，两条单链DNA退火过程可通过荧光颜色的变化进行可视化。该颜色变化可通过荧光光谱法表征，也可直接使用手持式紫外（UV）灯观察。这种双荧光颜色读出的概念，结合所描述的光稳定染料，使这些寡核苷酸探针成为分子成像的优良工具。由此可避免成像探针的光漂白，从而实现对生物过程更长时间的实时观测。
引言
分子成像技术是理解活细胞内生物过程的一种基本方法。1-3 针对这类化学生物学应用，基于荧光核酸的探针开发已成为一个不断扩展的研究领域。这些荧光探针需满足若干基本要求，才能成为适用于细胞成像的有效工具。首先，所用染料应具有高量子产率、大斯托克斯位移，最重要的是高光稳定性，以实现长期的体内成像。其次，探针应能提供可靠的荧光信号读出。传统的发色团-淬灭剂体系依赖于荧光强度的简单变化来读取单一荧光颜色信号。4 这种方法存在产生假阳性或假阴性结果的风险，原因可能包括细胞内组分的自发荧光，或因其他组分的非特异性淬灭导致信噪比降低。4
我们最近报道了关于这一概念 "DNA交通灯" 通过使用两种不同的发色团，显示出双重荧光颜色读数。5-6 该概念基于供体染料向受体染料的能量转移（ET），该过程会改变荧光颜色（参见 图1）。这使得读数更加可靠，从而为荧光成像探针提供了强有力的工具。寡核苷酸的荧光染料标记可通过两种不同方法实现：染料可在固相化学DNA合成过程中，通过使用相应修饰的磷酸酰胺构建单元进行掺入。7 该方法仅限于在标准亚磷酰胺和去保护条件下稳定的染料。作为替代方案，寡核苷酸化学中已建立了合成后修饰方法。本文中，我们展示了新型光稳定能量转移对之一的合成过程8,9 利用叠氮化物与炔烃之间的铜催化....
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方案
警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。这些合成过程中使用的多种化学品具有毒性且可能致癌。请遵守有机化学实验室通常要求的所有适当安全操作规程，例如穿戴实验服、护目镜和手套。
1. 染料的合成
注意：两种染料均可通过相同类型的反应合成。图2展示了这些反应的概览。
- 1-(3-叠氮丙基)-4-(2-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)乙烯基)吡啶碘化物（染料1）的合成
- 1-(3-碘丙基)-4-甲基吡啶碘化物的合成（图2A，步骤a）
- 将466 mg 4-甲基吡啶和5.91 g 1,3-二碘丙烷溶于20 ml顶空瓶中的10 ml乙腈中，用隔垫密封盖紧密封。
- 加热至85 °C，反应16小时。
- 冷却至室温，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去溶剂。
- 向残留油状物中加入20 ml乙酸乙酯，并在120 W超声浴中处理3分钟。
- 通过过滤收集生成的沉淀，用乙酸乙酯洗涤五次。将固体产物在真空中过夜干燥。
- 1-(3-叠氮丙基)-4-甲基吡啶的合成（图2A，步骤b）
-
....
- 1-(3-碘丙基)-4-甲基吡啶碘化物的合成（图2A，步骤a）
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结果
单链和双链 DNA 的吸收光谱和荧光光谱记录结果如图 4所示。
记录的吸收光谱（图4 右）显示，单链DNA1（染料1）在465 nm处、单链DNA2（染料2）在546 nm处有吸收最大值λmax 。退火后的DNA1_2（染料1和染料2）在469 nm和567 nm处均出现吸收峰。两个吸收最大值均发生红移，染料1红移4 nm，染料2红移21 nm。这些微小的光谱变化是双螺旋DNA结构内染料之间激子相互作用的结果。
相应的荧光光谱（图4 左）显示，单链DNA1（染料1，激发波长435 nm）的最大发射波长λmax,为537 nm，单链DNA2（染料2，激发波长535 nm）为607 nm，退火.......
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讨论
本方案展示了通过叠氮化荧光染料经CuAAC反应对DNA进行合成后标记的完整操作流程。内容包括染料的合成、炔基修饰DNA的制备以及标记过程。
染料的合成包含四个步骤。由于产物带有正电荷，均可通过较为简单的沉淀法获得，无需耗时的柱层析纯化。在中心偶联反应之前引入叠氮官能团，使染料的合成步骤从原先的五步缩短为四步。在烷基化步骤中采用1,3-二碘丙烷替代3-碘丙醇，从而避免了Appel反应以及后续将羟基转化为碘代基团的Finkelstein反应。与已发表的方法相比，这些改进使我们能够以更大的规模和更短的时间合成染料。
所使用的染料具有优异的光稳定性，但在固相DNA合成及后处理过程中缺乏必要的稳定性。因此，选择采用合成后标记策略。 alternatively，可在DNA合成过程中使用此类昂贵染料进行标记，但这需要极为温和的偶联和脱保护条件（例如，使用碳酸钾进行脱保护）。该方法成本显著更高，且需要合成相应的染料修饰的磷酰胺单体作为DNA合成单元，或在固相载体上进行标记（珠上标记）。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢德国研究基金会（DFG, Wa 1386/17-1）、DFG资助的研究培训组GRK 2039以及卡尔斯鲁厄理工学院（KIT）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 合成 | |||
| 4-皮考啉 | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-二碘丙烷 | Sigma Aldrich | 238414 | |
| 乙腈 | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC 级 |
| 乙酸乙酯 | Fisher Scientific | 10456870 | 工业级 |
| 叠氮化钠 | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. 级 |
| 二氯甲烷 | Fisher Scientific | 10626642 | 工业级 |
| 吲哚-3-甲醛；98% | ABCR | AB112969 | |
| 碳酸钾，99+% | Acros | 424081000 | |
| 碳酸二甲酯 | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-二甲基甲酰胺，99.8%，分子筛干燥 | Acros | 348435000 | |
| 硫酸钠 | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| 乙醇，99.5% | Acros | 397690010 | |
| 哌啶，99% | Acros | 147181000 | |
| 乙醚 | Fisher Scientific | 10407830 | 工业级 |
| 2-苯基吲哚-3-甲醛；97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-甲基喹啉 | ABCR | AB117222 | |
| DNA 合成 | |||
| Expedite 8909 核酸合成仪 | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) 磷酸三酯 | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT 磷酸三酯 | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) 磷酸三酯 | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) 磷酸三酯 | Sigma Aldrich | C11108 | |
| DNA 合成用磷酸三酯稀释液 | Sigma Aldrich | L010010 | |
| DNA 合成用超纯乙腈 | Sigma Aldrich | L010400 | |
| 封端试剂 A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| 封端试剂 B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT 柱，1.0 µmol | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) 柱，1.0 µmol | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) 柱，1.0 µmol | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) 柱，1.0 µmol | Proligo Reagents | C461010 | |
| 氨水（水溶液） | Fluka Analytical | 318612 | |
| 离心浓缩装置 Nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(苄硫基)-1H-四唑（活化剂） | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-丙炔基脱氧尿苷磷酸三酯 | Chem Genes | ANP-7754 | |
| 后处理 | |||
| 真空浓缩仪 | Christ | ||
| 点击反应步骤 | |||
| 六氟磷酸四(乙腈)合铜(I) | Sigma Aldrich | 346276 | |
| 乙酸钠 | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-L-抗坏血酸钠 | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA 二钠盐 | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA 配体 | - | - | 根据文献方法合成1 |
| HPLC | |||
| HPLC 系统 | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV 质谱仪 | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 色谱柱 | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| 浓度测定 | |||
| ND 1000 分光光度计 | nanodrop | ||
| 样品制备与光谱分析 | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 荧光光谱仪 | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
参考文献
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.
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